Summary
आईपी-FCM विधि प्रस्तुत है, जो जेनेटिक इंजीनियरिंग या बड़े नमूना आकार की आवश्यकता के बिना एक संवेदनशील, मजबूत, देशी प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत के जैव रासायनिक मूल्यांकन की अनुमति देता है.
Abstract
प्रवाह cytometry (आईपी FCM) के द्वारा पाया immunoprecipitation का पता लगाने और बढ़ाता प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत के लिए एक कारगर तरीका है. सैंडविच एलिसा, जिसमें कब्जा कर लिया प्राथमिक analyte अन्य शारीरिक multiprotein परिसरों के भीतर जुड़े अणुओं के साथ एक साथ पता लगाया जा सकता है के बुनियादी सिद्धांत है कि फैली हुई है. प्रक्रिया ब्याज की एक प्रोटीन के लिए मोनोक्लोनल (एमएबी) एंटीबॉडी विशिष्ट immunoprecipitating, सेल lysates के साथ इन मोतियों incubating, fluorochrome संयुग्मित जांच के साथ कब्जा कर लिया प्रोटीन परिसरों की जांच, और प्रवाह cytometry द्वारा मनका जुड़े प्रतिदीप्ति विश्लेषण के साथ polystyrene लाटेकस microbeads के सहसंयोजक युग्मन शामिल है. आईपी FCM बेहद संवेदनशील है, उनके मूल (गैर विकृत) राज्य में प्रोटीन का विश्लेषण की अनुमति देता है, और या तो अर्द्ध मात्रात्मक या मात्रात्मक विश्लेषण करने के लिए उत्तरदायी है. अतिरिक्त लाभ के रूप में, आईपी FCM कोई जेनेटिक इंजीनियरिंग या विशेष उपकरण, एक प्रवाह cytometer के अलावा अन्य की आवश्यकता है, और यह आसानी से उच्च throughput अनुप्रयोगों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.
Protocol
उच्च संवेदनशीलता और देशी प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत और प्रवाह cytometry द्वारा multiprotein परिसरों के मात्रात्मक विश्लेषण का पता लगाने: ** यह वीडियो एक जुड़े एक प्रकाशन प्रोटोकॉल पर आधारित है. एडम जी Schrum, डायना गिल, ऐलेन पी. Dopfer, डेविड एल Wiest, लॉरेंस ए Turka, वोल्फगैंग WA Schamel, एड पामर. विज्ञान 2007 STKE (389): pl2, 5 जून, 2007, [DOI: 10.1126/stke.3892007pl2] कृपया यहाँ क्लिक करें इस प्रकाशन देखने के लिए .
शुरू करने के लिए पहले, के बाद जलीय स्टॉक समाधान तैयार:
| एमईएस युग्मन बफर: | 25 में स्टोर डिग्री सेल्सियस |
| एमईएस, 6.0 पीएच | 50 मिमी |
| EDTA | 1 मिमी |
| शमन / / (QBs) भंडारण बफर अवरुद्ध: | 4 में स्टोर डिग्री सेल्सियस |
| BSA | % 1 |
| सोडियम azide | 0.02% |
| Pbs, 7.4 पीएच | 1x |
| FCM बफर: | 4 में स्टोर डिग्री सेल्सियस |
| Tris, 7.4 पीएच | 50 मिमी |
| NaCl | 100 मिमी |
| सोडियम azide | 0.02% |
| FBS | 5% |
| Pbs, 7.4 पीएच | 1x |
तुरंत पहले की तैयारी के लिए प्रयोग करें:
| EDAC - एमईएस: | 50 मिलीग्राम / एमएल एमईएस युग्मन बफर में EDAC पाउडर भंग |
| Digitonin समाधान (2% w / v): | DH 2 हे में 95 के लिए हीटिंग से digitonin पाउडर भंग डिग्री सेल्सियस 5min के लिए तो बर्फ पर ठंडा |
| Lysis बफर: | |
| Tris, 7.4 पीएच | 50 मिमी |
| NaCl | 150 मिमी |
| Digitonin समाधान | % 1 |
| Protease inhibitors | 1x |
| बर्फ पर रखें |
1. MAB के मनकों के लिए युग्मन
- पीबीएस में गिराए और एक hemacytometer के साथ गिनती के द्वारा खरीदा शेयर से मोतियों की एकाग्रता का निर्धारण करते हैं. गिनती के लिए मोतियों की एक 1:10000 कमजोर पड़ने के साथ शुरू करो.
- पिपेट 18 x 1.5 एमएल ट्यूब microcentrifuge में 10 6 मोती.
- मोती 0.5 से 1.0 एमएल एमईएस युग्मन बफर में 2 से 3 बार धो, प्रत्येक धोने के बाद 25 में 3 मिनट के लिए 20,000 छ ° C पर centrifuging.
- 50 μL एमईएस युग्मन बफर में मोती Resuspend.
- हौसले से तैयार EDAC एमईएस के 20 μL जोड़कर मनकों पर carboxyl समूहों को सक्रिय करें.
- 25 ° मैन्युअल pipetting और नीचे सी 15 मिनट के लिए धीरे मिलाएं.
- सक्रिय मोती 0.5 से 1.0 एमएल पीबीएस में 2 से 3 बार धो, 3 मिनट के लिए 20,000 ग्राम पर 25 ° centrifuging प्रत्येक धोने के बाद सी.
- 50 μL पीबीएस में सक्रिय मोती Resuspend.
- सक्रिय मनका समाधान के लिए आईपी MAB (0.2-1.0 मिलीग्राम / एमएल एकाग्रता शेयर) के 50 μL जोड़ें.
- 25 डिग्री सेल्सियस पर 3 से 4 घंटे के लिए एक प्रकार के बरतन हिल पर ट्यूब रखकर मिक्स. ट्यूब के तल पर मोतियों के बसने को रोकने के पर्याप्त हिलाएँ.
- धो MAB युग्मित मोती 0.5 से 1.0 एमएल पीबीएस में 2 से 3 बार, 3 मिनट के लिए 20,000 ग्राम में 25 में प्रत्येक धोने के बाद centrifuging डिग्री सेल्सियस.
- 100 μL QBs बफर में मोती Resuspend. 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है
- मोती निलंबित अच्छी तरह से, 1:200-1:10,000 पीबीएस में पतला और एक hemacytometer के साथ गिनती. प्रत्येक प्रारंभिक बैच के लिए एकाग्रता मापा होना चाहिए, ताकि प्रत्येक आईपी या पुल - डाउन प्रयोग में इस्तेमाल मोतियों की संख्या ठीक से नियंत्रित किया जा सकता है.
2. पोस्ट परमाणु lysate तैयारी और आईपी
lysis विधि और इष्टतम lysis शर्तों सेल प्रकार और प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत की जांच की जा रही पर निर्भर करेगा. प्रोटोकॉल के एक नंबर मौजूद हैं और आपके आवेदन के लिए संशोधित किया जा सकता है.
- 20 x 10 जैसे लिम्फोसाइटों, या 5 6 'छोटे' कोशिकाओं, lyse x 10 6 मैक्रोफेज या ट्यूमर कोशिकाओं के रूप में में 'बड़े' कोशिकाओं, 100 μL बर्फ पर 20min के लिए 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब में ताजा lysis बफर में. Lysis मात्रा स्केल के रूप में की जरूरत है.
- नाभिक और अघुलनशील सेलुलर मलबे को हटाने के लिए, 20,000 जी में 4 बजे 10 मिनट डिग्री सेल्सियस के लिए lysate अपकेंद्रित्र सतह पर तैरनेवाला रखें और त्यागने गोली.
- 0.5 x 10 5 से 2.5 x 10 5 स्पष्ट lysate MAB मिलकर मोती, धीरे pipetting करने के लिए मिश्रण जोड़ें. न्यूनतम मात्रा हम का उपयोग करेंप्रदर्शन एक ही आईपी 5 μL है.
- एक ठंडे कमरे में रात भर के लिए एक ऊर्ध्वाधर घूर्णन पहिया 4 घंटे पर रखें. पर्याप्त वेग सेट बसने से मोती को रोकने. यह कम मात्रा आईपी के तरल को रोटेशन के दौरान ट्यूब के तल में रहने के लिए स्वीकार्य है.
3. Fluorochrome संयुग्मित एंटीबॉडी के साथ मनका - कब्जा कर लिया प्रोटीन की जांच
- आईपी मोती 0,2 से 1.0 एमएल बर्फ ठंड FCM बफर में दो बार धो, 4 पर 20,000 जी पर centrifuging ° प्रत्येक धोने के बाद 3 मिनट के लिए सी.
- पांच या उससे अधिक 1.5 एमएल microcentrifuge चिमनी नीचे एक थाली के ट्यूब या कुओं में से प्रत्येक में 100 μL FCM बफर और विभाज्य 20 μL में मोती Resuspend.
- नमूने के fluorochrome - संयुग्मित Mabs जोड़ें. प्रदर्शन FCM विक्रेता के निर्देशों के अनुसार या empirically निर्धारित सांद्रता के अनुसार दाग. एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में, या अच्छी तरह से ट्यूब प्रति शेयर एंटीबॉडी के समाधान के 0.2 से 1 μL (0.2-1.0 मिलीग्राम / एमएल) जोड़ने के लिए, और बर्फ पर 40 मिनट के लिए सेते हैं.
- धो 1.5 मिलीलीटर ट्यूबों में 1.0 एमएल FCM बर्फ ठंड बफर में मोती दो बार जांच, 4 पर 20,000 जी पर centrifuging ° सी प्रत्येक धोने के बाद 3 मिनट के लिए. धीरे प्रत्येक धोने के बाद सतह पर तैरनेवाला निकालने के लिए, ध्यान लेने के मनकों को परेशान नहीं. चिमनी नीचे एक थाली के लिए, 0.2 एमएल बर्फ ठंड FCM बफर के साथ दो बार धोने, 4 में 5 मिनट के लिए 1000g पर centrifuging ° C प्रत्येक धोने के बाद. एक multichannel pipettor इस कदम के लिए उपयोगी है. चिमनी नीचे एक थाली में मोतियों से सतह पर तैरनेवाला हटायें, 'झटका' थाली एक बार, तो, जबकि अभी भी उल्टा, कुओं के किनारों से किसी भी भरी दाग. प्रत्येक कुएं में अवशिष्ट मात्रा, मोती युक्त, के बारे में 20 μL हो जाएगा.
- नमूना प्रति 200 μL FCM बफर में मोती Resuspend. लेबल FACS ट्यूबों पर स्थानांतरण. नमूने अब कर रहे हैं FCM के लिए तैयार है.
4. FCM अधिग्रहण
CML इस प्रोटोकॉल में वर्णित मोती व्यास में 3 से 5 सुक्ष्ममापी, लगभग आधा एक मौन माउस लिम्फोसाइट का व्यास हैं. इसलिए, यह आवश्यक हो करने के लिए मैन्युअल रूप से अग्रेषित (FSC) amp लाभ स्कैटर और साइड (एसएससी) स्कैटर वोल्टेज वृद्धि मनका घटनाओं की आबादी के लिए आदेश में बड़े पैमाने पर रजिस्टर कर सकते हैं. व्यक्तिगत आईपी मोती एक एकल कसकर क्लस्टर जनसंख्या के रूप में करना चाहिए. सेटिंग्स और फाटक मनका दोहरी और मलबे को बाहर करने के लिए समायोजित किया जाना चाहिए.
- चल मोती या मोती मानकों को पहले छोटी बूंद रोकथाम आस्तीन है कि कुछ cytometers पर नमूना इनलेट चारों ओर हटा दें. म्यान द्रव नमूनों के बीच ड्रिप करने की अनुमति दें, के रूप में इस इनलेट स्पष्ट और से एक नमूना से दूसरे पर किया जाता मोती रोकने जाएगा.
- Unlabeled मोती, प्रतिदीप्ति का एक नकारात्मक नियंत्रण, और इंद्रधनुष अंशांकन (RCPs) कण, प्रतिदीप्ति का एक सकारात्मक नियंत्रण, का उपयोग करने के लिए सेटिंग्स समायोजित इतना है कि दोनों नकारात्मक और सकारात्मक प्रतिदीप्ति चरम लॉग पैमाने पर x-अक्ष पर एक साथ दिखाई देते हैं. यह सुनिश्चित करता है कि प्रयोगात्मक नमूने से प्रतिदीप्ति भी पैमाने पर होगा. ध्यान दें कि RCPs CML के मोतियों की तुलना में छोटे होते हैं, इसलिए FSC और एसएससी मानकों, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से गेट की स्थिति, की आवश्यकता हो सकती है कि नमूने के लिए अस्थायी रूप से परिवर्तित किया जा.
- Unlabeled मनका सेटिंग्स पर लौटें RCPs के साथ एक बार अंशांकन पूरा हो गया है. यदि केवल एक नमूना प्रति फ्लोरोसेंट जांच का प्रयोग किया जाता है, कोई प्रतिदीप्ति मुआवजा आवश्यक है. सामान्य में, हम एक एकल fluorochrome संयुग्मित FCM नमूना प्रति MAB के साथ multiprotein परिसरों जांच, और हम विभिन्न सब यूनिटों के लिए विशिष्ट Mabs के साथ समानांतर मनका नमूने धुंधला द्वारा एकाधिक बातचीत भागीदारों की जांच.
- अधिग्रहण और प्रतिदीप्ति डेटा फ़ाइलों को बचाने. विश्लेषण तो प्रवाह CellQuest, FlowJo जैसे cytometry, सॉफ्टवेयर, या CFlow का उपयोग किया जा सकता है.
5. प्रतिनिधि परिणाम
चित्रा 1. TCR/CD3 multiprotein जटिल के लिए आईपी FCM. माउस तनाव से टी कोशिकाओं BALB ग / 1% digitonin में lysed थे, और आईपी FCM lysate विरोधी CD3ε मोती का उपयोग अधीन था. पर कब्जा कर लिया परिसरों TCR-β के महत्वपूर्ण मात्रा (बैंगनी क्षेत्र) रखी जाती है और सह जुड़े CD3 ε (हरा), लेकिन करीब Thy1.2 जैसे अन्य प्रोटीन की पृष्ठभूमि का स्तर (अप्रासंगिक immunoglobulin जांच, गुलाबी ट्रेस द्वारा परिभाषित), CD45, या (घ) एच 2K (भूरे रंग के, नारंगी, और नीले निशान, क्रमशः). इसी तरह पहले प्रकाशित 1-6 परिणाम देखें .
Discussion
प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत के बारे में जानकारी अत्यधिक संकेत transduction, वंश परिपक्वता, सेल चक्र प्रगति, और apoptosis के cascades के रूप में कई सेलुलर प्रक्रियाओं के विश्लेषण के लिए प्रासंगिक है. आईपी FCM एक त्वरित, मात्रात्मक और संवेदनशील प्रोटीन की बातचीत की जांच करने और अपनी मूल रचना में multiprotein परिसरों के सदस्यों को परिभाषित तरीका प्रदान करता है. मोती और युग्मित किया जा सकता है एक दिन में सेल lysates साथ incubated और जांच अगले दिन का विश्लेषण किया जा सकता है. एक थाली 96 अच्छी तरह प्रारूप नमूनों की बड़ी संख्या के लिए एक सांख्यिकीय या स्क्रीनिंग प्रयोजनों के लिए कुशल डेटा संग्रह प्रदान करने के लिए समय पर विश्लेषण किया जा के लिए अनुमति देता है. फ्लोरोसेंट मनका मानकों का उपयोग, प्रत्येक मनका द्वारा कब्जा कर लिया प्रोटीन की संख्या का अनुमान लगाया जा सकता है. बहुत कम स्रोत सामग्री पर कब्जा है और पता लगाने के लिए की जरूरत है, तो सीमित नमूने और दुर्लभ analytes अभी भी कई बातचीत के लिए विश्लेषण किया जा सकता है. हालांकि आईपी FCM जेनेटिक इंजीनियरिंग, मिलान टैगिंग, विकृतीकरण, या इन विट्रो में एक गैर शारीरिक वातावरण में प्रोटीन का मिश्रण की आवश्यकता नहीं है, यह इन और अन्य तकनीकों के साथ युग्मित किया जा सकता है, यह करने के लिए प्रयोज्यता के साथ एक मूल्यवान और सुलभ उपकरण बनाने कई जैविक प्रणालियों.
समस्या निवारण:
कई आईपी FCM प्रयोगों उपयोगी प्रोटीन बातचीत डेटा पहली बार वे करने का प्रयास कर रहे हैं उत्पन्न करते हैं. हालांकि, आईपी FCM के अनुकूलन मोती, प्रोटीन जटिल पर कब्जा, और फ्लोरोसेंट बाध्यकारी जांच के एंटीबॉडी संयुग्मन में सुधार कर सकते हैं.
आईपी एंटीबॉडी संयुग्मन की दक्षता जांच युग्मित मोती विरोधी immunoglobulin एंटीबॉडी के साथ सीधे द्वारा निर्धारित किया जा सकता है. यदि इस क्षमता कम है, युग्मन प्रतिक्रिया के दौरान एंटीबॉडी की एकाग्रता में वृद्धि अधिक आईपी एंटीबॉडी प्रत्येक मनका को संलग्न करने के लिए अनुमति दे सकते हैं. यह आईपी मनका बैच के बाध्यकारी क्षमता में वृद्धि, बढ़ाया और analytes की कब्जा पता लगाने में जिसके परिणामस्वरूप कर सकते हैं. अन्य प्राथमिक amine युक्त अणु (जैसे Tris, गोजातीय सीरम albumin) युग्मन प्रतिक्रिया के दौरान उपस्थित नहीं हो सकता है, के रूप में इन MAB साथ मनका और कम MAB युग्मन में अनुलग्नक परिणाम के लिए प्रतिस्पर्धा कर सकते हैं चाहिए. यदि MAB के मनकों के लिए संयुग्मन अन्य कारणों के लिए समस्याग्रस्त साबित होता है, मोती बजाय avidin / streptavidin के लिए युग्मित किया जा सकता है, और biotinylated एंटीबॉडी बाद गैर covalently बाध्य और immunprecipitation के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
अच्छा प्रतिरक्षी विकार के बावजूद, मनका जुड़े प्रतिदीप्ति के प्रारंभिक पता लगाने कम हो सकता है. पहले, जटिल पर कब्जा ही कम किया जा सकता है. क्योंकि आईपी FCM analytes की एकाग्रता पर निर्भर करता है, प्रति इकाई lysis मात्रा lysed कोशिकाओं की संख्या बढ़ रही है analyte कब्जा और पता लगाने में वृद्धि कर सकते हैं. इसके अतिरिक्त, कब्जा आईपी lysate, जो कम मोती भर में कब्जा कर लिया, परिसरों और मनका प्रति बढ़ा औसत प्रतिदीप्ति है जब जांच में परिणाम वितरित के साथ incubated मनकों की संख्या कम करके बढ़ाया जा सकता है. दूसरा, यह संभव है कि जांच एंटीबॉडी के कब्जा कर लिया परिसरों तक पहुँच sterically immunoprecipitating एंटीबॉडी द्वारा रुकावट है. इस मामले में, समस्या को अलग एंटीबॉडी का उपयोग और / या जांच कब्जा कर संबोधित किया जा सकता है.
Acknowledgments
इस काम ईगल्स इनोवेशन अवार्ड (ईगल्स के सहोदर आदेश) और मेयो फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| carboxylate-modified polystyrene latex (CML) beads (5mm surfactant-free) | Reagent | Interfacial Dynamics | 2-5000 | Store at 4°C. |
| Rainbow Calibration Particles | Reagent | Spherotech, Inc. | RCP-30-5A | Store at 4°C. |
| 2-[N-Morpholino] ethanesulfonic acid (MES) | Reagent | Sigma-Aldrich | M-5287 | |
| 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropl) carbodiimide HCl (EDAC) | Reagent | Sigma-Aldrich | 22980 E-6383 | Store at -20°C under desiccating conditions. |
| Protease Inhibitor General Use Cocktail, containing AEBSF, Bestatin, Aprotinin, EDTA, E-64, and Leupeptin | Reagent | Sigma-Aldrich | P-2714 | Prepare 100x stock solution in H2O. Aliquot and store at -20°C. Handle with gloves. |
| PCR plates, 96-well 0.2mL, natural, tall chimney | Reagent | Fisher Scientific | 08-408-230 | For use in place of microcentrifuge tubes during FCM staining |
References
- Schrum, A. G. High-sensitivity detection and quantitative analysis of native protein-protein interactions and multiprotein complexes by flow cytometry. Sci STKE. , pl2-pl2 (2007).
- Schrum, A. G. Visualization of multiprotein complexes by flow cytometry. Curr Protoc Immunol. Chapter 5, 9-9 (2009).
- Teixeiro, E. T cell division and death are segregated by mutation of TCRbeta chain constant domains. Immunity. 21, 515-526 (2004).
- Teixeiro, E. Different T Cell receptor signals determine CD8+ memory versus effector development. Science. 323, 502-505 (2009).
- Treves, S. Junctate is a key element in calcium entry induced by activation of InsP3 receptors and/or calcium store depletion. J Cell Biol. 166, 537-548 (2004).
- Gil, D., Schrum, A. G., Alarcon, B., Palmer, E. T cell receptor engagement by peptide-MHC ligands induces a conformational change in the CD3 complex of thymocytes. J Exp Med. 201, 517-522 (2005).
