Summary
وصفنا بروتوكول طريقة لتحليل GC القائم على المشتقات خلات aldonitrile من الجلوكوزامين وحامض الموراميك المستخرجة من التربة. لتوضيح الآلية الكيميائية، ونقدم أيضا استراتيجية لتأكيد بنية المشتقة وشظايا ايون شكلت بناء على التأين الإلكترون.
Abstract
نهج كمي إلى الكائنات الحية الدقيقة التي تميز حاسمة لفهم أوسع لوضع الميكروبية وظيفة في إطار النظم الإيكولوجية. الاستراتيجيات الحالية لتحليل الجراثيم تشمل كلا من مختبر الثقافة التقليدية التي تعتمد على التقنيات وتلك القائمة على استخراج مباشرة وتحديد المؤشرات الحيوية معينة 1 و 2. يمكن زرعها قليل بين تنوع الأنواع الجرثومية التي تعيش في التربة، وبالتالي الثقافة التي تعتمد على أساليب إدخال تحيزات كبيرة، وتحديد غائبة في تحليل العلامات البيولوجية.
وقد الحامض الجلوكوزامين، mannosamine، غالاكتوزامين والموراميك خدم كذلك اتخاذ تدابير لائق على حد سواء والأموات الشامل الجرثومية، من هذه الأحماض في الجلوكوزامين (الأكثر وفرة) والموراميك (فريد من الخلية البكتيرية) هي المكونات الأكثر أهمية في نظم التربة 3 (4). ومع ذلك، فإن الافتقار إلى المعرفة على تحليل يحد من تعميم واسع بين أقرانه العلمية. بين جميع EXIلسعة الطرق التحليلية، إلى اشتقاق aldononitrile الأسيتات تليها GC التحليل القائم على برزت كخيار جيد بالنسبة للتوازن على النحو الأمثل الدقة والحساسية، والبساطة، والفصل الكروماتوغرافي جيد، والاستقرار على تخزين عينة 5.
هنا، نقدم لبروتوكول مفصلة لإجراء تحليل موثوق وبسيطة نسبيا من الجلوكوزامين وحامض الموراميك من التربة بعد تحويلها إلى الأسيتات aldononitrile. ويتضمن البروتوكول أساسا أربع خطوات: حامض الهضم، وتنقية العينة، واشتقاق، وتقرير مجلس الإدارة. يتم تعديل هذا الإجراء خطوة بخطوة وفقا لمنشورات السابق 6، 7. وبالإضافة إلى ذلك، نقدم استراتيجية للتحقق من صحة هيكليا أيون الجزيئية المشتقة وشظايا ايون لها شكلت بناء على التأين الإلكترون. طبقنا GC-EI-MS-SIM، LC-ESI-MS-TOF والكواشف المسمى isotopically لتحديد الوزن الجزيئي للaldononitrile خلات الجلوكوزامين derivatized وMURحامض AMIC؛ استخدمنا تحول كتلة من النظائر المسمى المشتقات في الطيف ايون للتحقيق في شظايا ايون من كل المشتقات 8. بالإضافة إلى توضيح النظرية، فإن التحقق من أيون الجزيئية المشتقة وشظايا ايون لها أن تكون مفيدة للباحثين باستخدام δ 13 جيم أو شظايا أيون من هذه المؤشرات الحيوية في الدراسات البيولوجية الكيميائية 9 و 10.
Protocol
1. تحضير العينة واستخلاص حمض
- تجميد عينات من التربة الجافة بعد الجمع الميداني.
- طحن والتجانس عينات من التربة باستخدام طاحونة الكرة، طاحونة التربة، أو بمدافع الهاون ومدقة.
- وزن عينات من التربة (التي تحتوي على> 0.3 ملغم N) في دورق 25 مل من التحلل.
- إضافة 10 مل من حمض الهيدروكلوريك 6M في كل قارورة المائي، وملء N 2 الغاز في القوارير، والغطاء بإحكام.
- يتحلل عند درجة حرارة 105 مئوية في حاضنة لمدة 8 ساعات باستخدام مفتاح الموقت السيارات.
2. عينة تنقية
- إزالة قوارير من الحاضنة، بارد لدرجة حرارة الغرفة.
- أضف 100 ميكروليتر الداخلية معيار ميو، اينوزيتول (1 ملغ مل -1 في الماء) على كل قارورة، مزيج من دوامات.
- إنشاء مداخل البلاستيكية التي تصب في قوارير 200 مل على شكل كمثرى مع ST / NS 24/40 المفاصل، وتعيين على الأكواب البلاستيكية للاستقرار.
- طية Whatman # 2 دوائر النوعية (11 قطرها سم) إلى أرباع، ومجموعة في المداخن. عباب كل قارورة المائي، ويسكب المزيج في قمع لتصفية (قد شطف مزيد من كل قارورة مع مل 3 ~ من الماء).
- تجفيف الترشيح باستخدام التبخير الدوار في ~ 45 درجة مئوية، وتطبيق فراغ.
- Resuspend بقايا المجففة من كل قارورة الكمثرى مع 3 ~ 5 مل ماء (استخدام حمام بالموجات فوق الصوتية وإذا رغبت في ذلك)، وتصب في أنبوب 40 مل تفلون؛ شطف القارورة مع قسامة الثانية من المياه.
- ضبط درجة الحموضة إلى 6،6-6،8 باستخدام 1M KOH حل لايونات المعادن راسب والجزيئات العضوية الأخرى.
- إزالة الرواسب عن طريق الطرد المركزي في 2000 إطار التعاون الإقليمي لمدة 10 دقائق.
- صب طاف في أنبوب 40 مل زجاج، تغطية افتتاح أنبوب مع parafilm، وتجميد في -20 درجة مئوية، ثم كزة ثقوب في parafilm.
- تجميد تجفيف طاف المجمدة لازالة كل السائل.
- حل بقايا مع الميثانول 3 مل جاف، vortexing تماما (استخدام حمام بالموجات فوق الصوتية وإذا رغبت في ذلك)؛ غطاء الأنبوب، وأجهزة الطرد المركزي ثم في 2000 إطار التعاون الإقليمي لمدة 10 دقائق لتسويةمن الأملاح.
- نقل وطاف على قارورة مل 3 رد فعل مخروطي الشكل؛ تتبخر إلى جفاف بواسطة آلة RapidVap على 45 درجة مئوية (أو تحت تيار لطيف من غاز النيتروجين الجاف إذا رغبت).
- على كل قارورة، أضف 100 ميكروليتر انتعاش معيار N-methylglucamine (1 ملغ مل -1 في الماء) و 1 مل H 2 O، يكتم الافواه قارورة مع parafilm، وتجميد في -20 درجة مئوية، وخرم parafilm، ومن ثم تجميد جاف .
- جعل المعايير: إضافة 100 حامض الموراميك ميكرولتر (0.5 ملغ مل -1 في الميثانول)، و 100 الجلوكوزامين ميكروليتر (1 ملغ مل -1 في الماء)، و 100 ميكرولتر ميو، اينوزيتول (1 ملغ مل -1 في الماء)، و 100 N-ميكرولتر methylglucamine (1 ملغ مل -1 في الماء)، و 1 مل H 2 O، parafilm كل قارورة، وتجميد في -20 درجة مئوية، وخرم parafilm، ثم تجميد الجافة.
3. اشتقاق
- تحضير كاشف اشتقاق التي تحتوي على 32 ملغ مل هيدروكلوريد هيدروكسيل -1 و 40 مجم مل -1 4 dimethylamino-PYridine في بيريدين، الميثانول (4:1 V / V).
- إضافة 300 ميليلتر من كاشف اشتقاق إلى كل من reactivials، الغطاء بإحكام، ودوامة تماما.
- وضع قنينة في 75-80 درجة مئوية حمام الماء لمدة 35 دقيقة (مختومة جيدا قارورة لتجنب السماح لأي المياه للدخول في قارورة).
- إزالة قارورة من الحمام المائي، وباردا لدرجة حرارة الغرفة.
- إضافة 1 مل من الخل أنهيدريد إلى كل من كاب مل 3، reactivials بإحكام، ودوامة جيدا، ثم يسخن في حمام ماء 75-80 درجة مئوية لمدة 25 دقيقة.
- إزالة قارورة من الحمام المائي، وباردا لدرجة حرارة الغرفة.
4. فصل والقياس
- إضافة 1.5 مل من ثنائي كلورو ميثان إلى كل كأب، وقارورة بإحكام، ودوامة تماما.
- إضافة 1 مل من حمض الهيدروكلوريك 1M إلى كل كأب، وقارورة بإحكام ودوامة تماما للسماح للحلول على الجلوس دون عائق حتى العبارات منفصلين، نضح وتجاهل الجزء العلوي (مائي) مرحلة استخدام 1000 pipettor ميكرولتر.
- و في نفسashion، استخراج مرحلة العضوية 3 مرات ولكن مع 1 مل O 2 H (مع الخطوة غسل الماضي، عناية خاصة للتأكد من أن تمت إزالة جميع من مرحلة أعلى مائي).
- تجف الحل النهائي باستخدام RapidVap على 45 درجة مئوية (أو الجاف باستخدام غاز النيتروجين إذا رغبت).
- حل في 300 ميكروليتر خلات الإيثيل، الهكسين (1:1 V / V) ونقل إلى 2 مل من قنينات المسمار سقف العنبر مع ادخال وحجم صغير والغطاء بإحكام.
- لالكمي وتحليلها بواسطة GC-FID باستخدام قطبي العمود الشعري السيليكا تنصهر فيها: 30 مترا، 0.25 ملم معرف، 0.25 سماكة الفيلم أم؛ مرحلة ثابتة 5٪ فينيل، 95٪ ميثيل polysiloxane (DB-5 أو ما يعادلها) مع الهيدروجين أو الهليوم والغاز الناقل، في 0.5 مل تدفق -1 دقيقة ثابتة. واللوني هو أفضل على قسط مراحل "خاملة"، وغاز الهيدروجين الناقل، ولكن غير مقبول على أصناف أكثر شيوعا ومع الهيليوم. إعدادات كاشف هي 300 درجة مئوية، 400 مل دقيقة -1 الهواء و30 مل -1 دقيقة للنيتروجين على حد سواء وغازات الهيدروجين ماكياج. الحقن والمعلمات فرن هي كما يلي: 1 حقن الانقسام ميكرولتر (30:1) مع مدخل القيادة العامة التي حددت في 250 درجة مئوية؛ الأولية حرارة الفرن، و 120 درجة مئوية، عقد 1 دقيقة، وزيادة درجة حرارة الفرن عند 10 درجة مئوية دقيقة. -1 إلى 250 درجة مئوية؛ عقد 2،5 دقيقة؛. المنحدر إلى 270 درجة مئوية عند 20 درجة مئوية دقيقة -1؛ عقد 2 دقيقة، المنحدر إلى 290 درجة مئوية عند 20 درجة مئوية دقيقة -1، عقد 5 دقائق. ضبط معدل تدفق الغاز الناقل بحيث أزل اينوزيتول، الجلوكوزامين ومشتقات حمض الموراميك على 250 درجة مئوية، وelutes N-methylglucamine عند 270 درجة مئوية.
5. مشتق التحقق من صحة
- استخدم التأين الناعمة LC-ESI-TOF-MS لتحديد أيون الجزيئية وتحديد الوزن الجزيئي للمشتقات.
- استخدام GC-EI-MS-SIM أو GC-EI MSMS من أجل تعزيز حساسية للتحقيق في الأيونات المستهدفة من المشتقات المالية.
- استخدم العديد من الكواشف المسمى isotopically للإعداد للمشتقات، ومن ثم استخدام هذا التحول الشاملمن تلك المشتقات المسمى isotopically في MS للتحقيق أيون الجزيئية وشظايا أيون.
6. ممثل النتائج
بروتوكول للطريقة تتكون بصورة رئيسية من أربع خطوات: حامض الهضم، وتنقية العينة، واشتقاق، وتحديد GC (الشكل 1). ويرد مثال على تحليل للحمض الجلوكوزامين والموراميك من المخزونات ومعيار من عينة من التربة في الشكل 2. ويمكن بالإضافة إلى الجلوكوزامين وحمض الموراميك، mannosamine وغالاكتوزامين (أيزومرين الجلوكوزامين) أيضا أن تحدد في وقت واحد باستخدام طريقة. استنادا إلى عوامل استجابة للمعايير فيما يتعلق الداخلية معيار ميو، اينوزيتول، ويمكننا تحديد هذه المؤشرات الحيوية في عينات من التربة. وقد استخدم معيار استرداد لمراقبة النوعية في عملية اشتقاق. وتظهر مخططات لتشكيل حامض خلات aldononitrile الجلوكوزامين والموراميك derivatized في الشكل (3)
وتم تحديد الهياكل المقترحة للمشتقات بواسطة GC-EIMS-SIM لتعزيز حساسية، أو التأين الناعمة LC-ESI-TOF MS-8، وتمت دراسة الهياكل المقترحة من شظايا ايون شكلت بناء على التأين الإلكترون من خلال مقارنة الأطياف ايون لل عينات أعدت مع المدرجه النظائر المختلفة 11. ويبين الشكل 4 التحول الشامل لايون المهيمنة م / ض 187 من aldononitrile خلات الجلوكوزامين derivatized في ثلاثة سيناريوهات، الذي أعد مع وكلاء غير المسمى، الأنهيدريت D-الخل، ويو -13 سي الجلوكوزامين. ويمكن الإشارة إلى معلومات تفصيلية أخرى وتفسيرات لمنشوراتنا الأخيرة 8 و 11. ويمكن هذه الاستراتيجية بمثابة نموذج لدراسة الكيمياء المشتقة.
الرقم تدفق قياس 1. الرسم البياني للبروتوكول لتحليل الجلوكوزامين وحامض الموراميك في التربةعينات. ويتضمن البروتوكول أساسا 4 خطوات: حمض الهضم، تنقية، اشتقاق وتصميم GC.
الشكل 2. GC-FID المخططات الاستشرابية من الأسيتات aldononitrile من اينوزيتول، الجلوكوزامين، وحامض الموراميك، mannosamine، غالاكتوزامين وmethylglucamine لمعايير والتربة.
الشكل 3. خطط لتشكيل حامض خلات aldononitrile الجلوكوزامين والموراميك derivatized. الرقم 1 يمثل رد فعل النتريل. الرقم 2 يمثل أستلة.
الشكل 4. الأطياف كتلة من aldononitrile خلات الجلوكوزامين derivatized المرتبطة متطوره ايون مهيمنوفاق في ظل الوضع EI أعدت مع (A) وكلاء غير المسمى، (B) D-الخليك الأنهيدريت، (C) يو -13 C-الجلوكوزامين. نجم يمثل النظائر الثقيلة ذرة أو مجموعة النظير.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقدمت القيادة العامة المستندة إلى طريقة لتحليل الحمض aldononitrile خلات الجلوكوزامين والموراميك derivatized يوفر طريقة سريعة نسبيا لتحديد هذه السكريات الأمينية، والمستخرجة من التربة. والمشتقات هي مستقرة كيميائيا، ويمكن تحديدها في واحدة تحليل. لا يقتصر هذا الأسلوب على عينات من التربة، ويمكن أن تكون مبسطة للحصول على عينات من التربة غير المصفوفة.
وقد تم بناء مضخة فراغ المستخدمة في هذا الأسلوب لتكون مقاومة للحامض. ونقترح كذلك وضع فخ قاعدة لحماية مضخات عندما يتبخر 6M حمض الهيدروكلوريك الحلول. يجب توخي الحذر خلال خطوات للحفاظ على ظروف اشتقاق اللامائية بصرامة، لالكواشف على حد سواء، والأواني الزجاجية. وينبغي إجراء العمل دون تأخير. يجب أن تكون نظيفة والأواني الزجاجية بدقة، إما عن طريق بأيديك على 550 درجة مئوية أو بواسطة الشطف مع مذيب. وينبغي اتخاذ احتياطات السلامة للتعامل مع الأحماض، وأبخرة حامض قوي خلال التبخر. أمينوغليكوزيد، وهووقد تم تحديد سلسلة من المضادات الحيوية التي تنتجها كائنات الحية التي تعيش في التربة، كما تدخل ممكن، لأنه شارك في elutes مع الجلوكوزامين أو حامض الموراميك في DB-5 12، لذلك يوصى العمود الثاني مع كيمياء مرحلة ثابتة مختلفة إذا GC-FID هو الوسيلة الرئيسية المستخدمة لقياس هذه السكريات الأمينية. نوصي كاشف مؤكد بعد elutes GC لتحليلها في المستقبل. لتحديد العلامات البيولوجية لا لبس فيه من أثر في مصفوفات معقدة، ونقترح استخدام أجهزة متطورة، وعلى سبيل المثال GC-MSMS مع رصد رد فعل متعددة؛ لتقدير دقيق من العلامات البيولوجية في وجود interferents، نقترح القيام المعايرة على أساس بعض الأيونات الشامل المهيمن فريدة من نوعها لالعلامات البيولوجية المشتقات.
deuterated تم تأكيد الهويات هيكل السكر عن طريق استبدال 15 N-هيدروكسيل هيدروكلوريد، أنهيدريد الخل، و 13 مئوية والمؤشرات الحيوية / أو 15 N المسمى لغير المسمى الهيدروكسيلوتوقع أمين هيدروكلوريد، أنهيدريد الخل والمؤشرات الحيوية في التحضير للمشتقات، ورصد مزيد من م / ض التحول من الأيونات المميزة للالمسمى مقابل المشتقات الخالي من الملصقات. في محددة، إذ أن كل مجموعة من خلات يحتوي على 3 deuteriums وكل مجموعة النتريل على 1 ذرة N 15، يمكن توقع أن يتم تحديد أيون التحول الشامل م / ض من قبل عدد ستعرض مجموعات خلات ومجموعة النتريل في هياكل أيون شظايا. وبالمثل، 13 C و / أو 15 N-وصفها يمكن أن الخلايا البكتيرية على حد سواء يمكن استخدامها لتحديد عدد ذرات C في هياكل ايون شظية ونشأت من الجلوكوزامين أو حامض الموراميك، أو ما إذا كان الجلوكوزامين-N أو حمض الموراميك-N موجود في تفتيت الهياكل.
GC-EI-MS-SIM هو اللوني للغاز تليها التأين تأثير الإلكترون وقياس الطيف الكتلي باستخدام quadropole فصل الشامل والمحدد للرصد ايون؛ LC-ESI-TOF-MS هو اللوني السائل تليها ELECالتأين trospray وقياس الطيف الكتلي استخدام الوقت من الطيران الفصل الشامل. نشير هنا إلى الاختلافات بين هذه الأساليب التي تستخدم للمساعدة في تحديد الوزن الجزيئي وشظايا أيون. ESI-TOF-MS هو "لينة التأين" تقنية في طاقة التأين المنقولة لجزيئات الحليلة أن منخفض بما فيه الكفاية، بحيث لا يحدث الانقسام وإشارة المنتجة هو مقياس دقيق للغاية من الوزن الجزيئي لتحليلها. في GC-MS-EI، يتم نقل المزيد من الطاقة لتحليلها، وجزيء فواصل استسلام بعيدا عددا من شظايا مشحونة. وquadropole بمثابة مرشح كتلة بحيث فقط تلك الأجزاء من نسبة كتلة / تهمة محددة تصل إلى كاشف. ويظهر توزيع الشظايا، والذي هو سمة من تحليلها، في رسم بياني يسمى طيف أيون، والتي يتم رسم كثافة أو وفرة ضد ض / م. لزيادة حساسية، ونحن نستخدم اختيار الرصد ايون (SIM)، والتي نحن برمجة MS لجمع سوى عدد قليل من معين م / ض قيم RAذر من الطيف الشامل بأكملها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدينا ما يكشف.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من وزارة الطاقة البحيرات العظمى مركز أبحاث الطاقة الحيوية (وزارة الطاقة BER مكتب العلوم DE-FC02-07ER64494). نحن ممتنون للدكتور تشانغ شو دونغ وأعضاء جماعته لإجراء مناقشات تقنية مفيدة والتعليقات لا تقدر بثمن في وضع الصيغة النهائية للبروتوكول.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Muramic acid | Sigma-Aldrich | M2503-25MG | |
| D-(+)-glucosamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | G1514-100G | |
| N-methyl-D-glucamine | Sigma-Aldrich | M2004-500G | |
| Myo-inositol | Fisher Scientific | A307003G025 | |
| Methanol (dry) | Acros Organics | AC326950010 | |
| 4-dimethylamino-pyridine | Acros Organics | AC148270050 | |
| Ethyl acetate | VWR international | BJGC100-4 | |
| Hydroxlamine hydrochloride | Fisher Scientific | H330-100 | |
| Pyridine | Fisher Scientific | P368-500 | |
| Acetic anhydride | Fisher Scientific | A10-100 | |
| Dichloromethane (Methylene chloride) | Fisher Scientific | D37-500 | |
| Hexane | Fisher Scientific | H303-4 | |
| Hydrochloric acid (6M) | Fisher Scientific | S456-4 | |
| Hydroxylamine hydrochloride-15N | Icon services | IN5280 | |
| Acetic anhydride-2H (D6C4O3) | Acros Organics | AC174670050 | |
| D-glucose-U-13C | Cambridge Isotope Laboratories | CLM-1396-1 | |
| Ammonium sufate-15N | Cambridge Isotope Laboratories | NLM-713-1 | |
| Rapid-Vap | Labconco Corp. | 790002 | |
| Vacum pump | KNF Neuberger | D-79112 | |
| Hydrolysis flask | Fisher Scientific | 06 423A | |
| Derivatization microvial | Fisher Scientific | 06-100E | |
| GC | Hewlett-Packard | 6890 | |
| MS | Hewlett-Packard | 5972 | |
| LC-ESI-TOF-MS | Agilent Technologies | An Agilent 1200 series HPLC system coupled to an Agilent LC/MSD-TOF |
References
- Zelles, L. Fatty acid patterns of phospholipids and lipopolysaccharides in the characterisation of microbial communities in soil: a review. Biology and Fertility of Soils. 29, 111-129 (1999).
- Kirk, J. L. Methods of studying soil microbial diversity. Journal of Microbiological Methods. 58, 169-188 (2004).
- Joergensen, R. G., Emmerling, C. Methods for evaluating human impact on soil microorganisms based on their activity, biomass, and diversity in agricultural soils. Journal of Plant Nutrition and Soil Science. 169, 295-309 (2006).
- Guggenberger, G., Frey, S. D., Six, J., Paustian, K., Elliott, E. T. Bacterial and fungal cell-wall residues in conventional and no-tillage agroecosystems. Soil Science Society of America Journal. 63, 1188-1198 (1999).
- Amelung, W. Assessment Methods for Soil Carbon. Lal, R., Kimble, J. M., Follett, R. F., Stewart, B. A. , CRC/Lewis Publishers. Boca Raton, FL. 233-270 (2001).
- Guerrant, G. O., Moss, C. W. Determination of monosaccharides as aldononitrile, O-methyloxime, alditol, and cyclitol acetate derivatives by gas-chromatography. Analytical Chemistry. 56, 633-638 (1984).
- Zhang, X., Amelung, W. Gas chromatographic determination of muramic acid, glucosamine, mannosamine, and galactosamine in soils. Soil Biology and Biochemistry. 28, 1201-1206 (1996).
- Liang, C. Investigation of the molecular ion structure for aldononitrile acetate derivatized muramic acid. Journal of Microbiological Methods. 86, 224-230 (2011).
- He, H., Xie, H., Zhang, X. A novel GC/MS technique to assess 15N and 13C incorporation into soil amino sugars. Soil Biology and Biochemistry. 38, 1083-1091 (2006).
- Glaser, B., Gross, S. Compound-specific delta 13C analysis of individual amino sugars - a tool to quantify timing and amount of soil microbial residue stabilization. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 19, 1409-1416 (2005).
- Liang, C., Balser, T. C. Mass spectrometric characterization of amino sugar aldononitrile acetate derivatives used for isotope enrichment assessment of microbial residues. Soil Biology and Biochemistry. 42, 904-909 (2010).
- Liang, C., Pedersen, J. A., Balser, T. C. Aminoglycoside antibiotics may interfere with microbial amino sugar analysis. Journal of Chromatography A. 1216, 5296-5301 (2009).
