Summary
We beschrijven een methode protocol voor de GC-gebaseerde analyse van de aldonitrile acetaat derivaten van glucosamine en muramic zuur gewonnen uit de bodem. Ter verduidelijking van de chemische mechanisme ook een strategie op de structuur van het derivaat en de ion gevormde fragmenten op elektronen ionisatie bevestigen.
Abstract
Kwantitatieve benaderingen van het karakteriseren van micro-organismen zijn cruciaal voor een breder begrip van de microbiële status en functie binnen ecosystemen. De huidige strategieën voor microbiële analyse zowel traditionele laboratorium cultuur-afhankelijke technieken en op basis van directe extractie en de vaststelling van bepaalde biomarkers 1, 2. Er zijn maar weinig onder de diversiteit van microbiële soorten bewonen bodem kan worden gekweekt, zodat cultuur-afhankelijke methoden in te voeren belangrijke vooroordelen, een beperking afwezig in biomarker analyse.
De glucosamine, mannosamine, galactosamine en muramic zuur zijn goed gediend als maatregelen van zowel de levenden en de doden microbiële massa, van die de glucosamine (meest voorkomende) en muramic zuur (uniek van bacteriële cel) zijn de belangrijkste bestanddelen in de bodem systemen 3 4. Echter, het gebrek aan kennis over de analyse beperkt de brede popularisering onder de wetenschappelijke collega's. Van alle Existeken analysemethoden, derivatisering tot aldononitrile acetaten gevolgd door GC-gebaseerde analyse is naar voren gekomen als een goede optie met betrekking tot een optimale afweging van precisie, gevoeligheid, eenvoud, goede chromatografische scheiding, en de stabiliteit bij de opslag van monsters 5.
Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor een betrouwbare en relatief eenvoudige analyse van glucosamine en muramic zuur uit bodem na hun bekering tot aldononitrile acetaten. Het protocol omvat hoofdzakelijk vier stappen: zuur spijsvertering, monster zuivering, derivatisering en GC vastberadenheid. De stap-voor-stap procedure wordt aangepast aan voormalige publicaties 6, 7. Daarnaast presenteren we een strategie om structureel valideren van de moleculaire ionen van het derivaat en de ion-fragmenten gevormd op elektron ionisatie. Wij pasten GC-MS-EI-SIM, LC-ESI-TOF-MS en isotopisch gelabeld reagens het molecuulgewicht van aldononitrile acetaat gederivatiseerde glucosamine en mur bepalenAmic zuur, gebruikten we de massa verschuiving van isotopen gemerkt zijn derivaten in de ion-spectrum om ion fragmenten van elk 8 derivaten te onderzoeken. Naast de theoretische verklaring, de validatie van moleculaire ionen van het derivaat en de ion fragmenten nuttig onderzoekers die δ 13 C of ion fragmenten van deze biomarkers in biogeochemische studies 9, 10.
Protocol
1. Monstervoorbereiding en zure extractie
- Freeze-droge grond monsters na veld collectie.
- Grind en homogeniseer grondmonsters met behulp van een kogelmolen, bodem slijpmachine, of een vijzel en stamper.
- Weeg grondmonsters (bevattende> 0,3 mg N) in een 25 ml kolf hydrolyse.
- Voeg 10 ml 6M HCl in elke hydrolyse fles, goed gevuld N 2 gas in de flessen, en de dop.
- Hydrolyseren bij 105 ° C in een incubator gedurende 8 uur met een automatische tijdschakelaar.
2. Voorbeeld Zuivering
- Verwijder de kolven van de broedmachine, afkoelen tot kamertemperatuur.
- Voeg 100 ul interne standaard myo-inositol (1 mg ml-1 in het water) aan elke kolf; mengen door schudden.
- Stel plastic trechters die afwateren in 200 ml peervormige kolven met ST / NS 24/40 gewrichten, ingesteld op plastic bekers voor de stabiliteit.
- Vouw Whatman # 2 Kwalitatieve Circles (11 cm diameter) in vieren en zet in de trechters. Swirl elke hydrolyse fles, en giet drijfmest in de trechter te filteren (je kan verder spoelen elke kolf met ~ 3 ml water).
- Droog het filtraat met een rotatieverdamper bij ~ 45 ° C met toepassing vacuum.
- Resuspendeer de gedroogde residu van elke peer kolf met 3 ~ 5 ml water (gebruik ultrasoonbad indien gewenst), en giet het in een 40 ml Teflon buis; spoel de kolf met een tweede portie van water.
- PH 6,6 tot 6,8 met 1 M KOH-oplossing neer te slaan metaalionen en andere organische moleculen.
- Verwijder de precipitaten door centrifugatie bij 2000 RCF gedurende 10 minuten.
- Giet het supernatant in een 40 ml glazen buis wordt de buis opening met parafilm, invriezen bij -20 ° C zijn, dan steken gaten in de parafilm.
- Vriesdrogen de bevroren supernatant alle vloeistof te verwijderen.
- Los het residu met 3 ml droge methanol, vortexen grondig (gebruik ultrasoonbad indien gewenst); dop van de buis, en dan bij 2000 RCF gecentrifugeerd gedurende 10 minuten om zich te vestigenuit zouten.
- Breng de supernatant naar een 3 ml conische reactieflacon, damp droog door RapidVap machine op 45 ° C (of onder een lichte stroom van droog stikstofgas indien gewenst).
- Aan elke flacon, voeg 100 ul recovery standaard N-methylglucamine (1 mg ml -1 in water) en 1 ml H 2 O, hebben betrekking op de flacon monden met parafilm, invriezen bij -20 ° C, perforeren de parafilm, en dan bevriezen droog .
- Merk normen: voeg 100 pi muramic zuur (0,5 mg ml -1 in methanol), 100 ul glucosamine (1 mg ml -1 in water), 100 ul myo-inositol (1 mg ml -1 in water), 100 ul N- methylglucamine (1 mg ml -1 in water) en 1 ml H2O parafilm elk flesje invriezen bij -20 ° C, perforeren de parafilm dan vriesdrogen.
3. Derivatisering
- Bereid derivatiseringsreagens met 32 mg ml'1 hydroxylamine hydrochloride en 40 mg ml -1 4-dimethylamino-pyridine in pyridine-methanol (4:1 v / v).
- Voeg 300 pi van de derivatiseringsreagens elk van de reactivials, cap stevig en goed vortex.
- Zet de flesjes in de 75-80 ° C waterbad gedurende 35 minuten (goed afgedicht de flacons om te voorkomen zodat er geen water aan de flesjes in te voeren).
- Verwijder flacons uit het waterbad en laat afkoelen tot kamertemperatuur.
- Voeg 1 ml azijnzuuranhydride aan elk van de drie mL reactivials, dop stevig en vortex grondig vervolgens opwarmen in 75-80 ° C waterbad gedurende 25 minuten.
- Verwijder flacons uit het waterbad en laat afkoelen tot kamertemperatuur.
4. Scheiding en waardering
- Voeg 1,5 ml dichloormethaan aan elk flesje, dop stevig vast, en vortex grondig.
- Voeg 1 ml 1M HCl aan elk flesje, dop stevig vast en vortex grondig om de oplossingen voor ongestoord gaan zitten totdat de twee zinnen aparte, zuigen en gooi de top (waterige) fase met behulp van 1000 uL pipet.
- In dezelfde fashion, pak de organische fase 3 keer maar met 1 ml H 2 O (met de laatste wasstap, extra voorzichtig zijn om ervoor te zorgen dat alle van de waterige fase top is verwijderd).
- Droog de uiteindelijke oplossing met RapidVap bij 45 ° C (droog of met stikstofgas indien gewenst).
- Los in 300 ul ethylacetaat-hexaan (1:1 v / v) en breng 2 ml amber schroefdop flesjes met een kleine hoeveelheid insert en dop stevig.
- Voor kwantificering analyseren door GC-FID met een gesmolten silica-polair capillaire kolom: 30 m lang, 0,25 mm ID, 0,25 um laagdikte, stationaire fase 5% fenyl-, 95% methyl-polysiloxaan (DB-5 of equivalent) met waterstof of helium als draaggas, 0,5 ml min -1 constante stroom. De chromatografie is beter op de premie "inerte" fasen en waterstof draaggas, maar is aanvaardbaar op de meest voorkomende variëteiten en met helium. De detector instellingen 300 ° C, 400 ml min -1 lucht en 30 ml min -1 voor stikstof enwaterstof make-up gassen. De injectie en oven parameters zijn: 1 pi splitinjector (30:1) met GC inlaat bij 250 ° C; eerste oventemperatuur 120 ° C; houden 1 min; verhogen oven bij 10 ° C min. -1-250 ° C houden 2,5 min;. helling tot 270 ° C bij 20 ° C min -1; houden 2 minuten helling tot 290 ° C bij 20 ° C min -1, houdt 5 min. Stel de drager gasstroom zodat het inositol, glucosamine en muramic zuurderivaten elueren bij 250 ° C, en N-methylglucamine elueert bij 270 ° C.
5. Afgeleide Validatie
- Gebruik zachte ionisatie LC-ESI-TOF-MS de moleculaire ionen identificeren en het molecuulgewicht van het derivaat te bepalen.
- Gebruik GC-EI-MS-SIM-kaart of GC-EI-MSMS op gevoeligheid verbetering gerichte ionen van het derivaat te onderzoeken.
- Gebruik meerdere isotopisch gelabeld reagentia voor de voorbereiding van de derivaten, en gebruik vervolgens de massa verschuivingvan de isotopisch gelabelde derivaten MS moleculaire ionen en ionen fragmenten onderzoeken.
6. Representatieve resultaten
Het protocol van de methode bestaat voornamelijk uit vier stappen: zuur spijsvertering, monster zuivering, derivatisering en GC bepaling (figuur 1). Een voorbeeld van de analyse van glucosamine en muramic zuur van standaard standen en een grondmonster in figuur 2. Naast glucosamine en muramic zuur, mannosamine en galactosamine (twee isomeren van glucosamine) kunnen ook gelijktijdig worden bepaald volgens de methode. Gebaseerd op responsfactor van normen met betrekking tot de interne standaard myo-inositol, kunnen we kwantificeren biomarkers grondmonsters. Het herstel standaard is gebruikt om kwalitatief toezicht houden op de derivatisering proces. De regelingen voor de vorming van de aldononitrile acetaat gederivatiseerde glucosamine en muramic zuur in figuur 3
De voorgestelde structuur van de derivaten werden bepaald door GC-EIMS-SIM voor gevoeligheid verbeteren of zachte ionisatie LC-ESI-TOF-MS 8, de voorgestelde constructies van de ionen die worden gevormd bij elektronen ionisatie werden onderzocht door het ion spectra van de monsters bereid met verschillende isotopen oprichtingen 11. Figuur 4 toont de massa verschuiving van de dominante ion m / z 187 aldononitrile acetaat gederivatiseerde glucosamine in drie gevallen, bereid met niet-gemerkt middelen, D-azijnzuur anhydriet en U 13C-glucosamine. Overige informatie en uitleg kan worden doorverwezen naar onze recente publicaties 8, 11. Deze strategie zou kunnen dienen als een model om afgeleide chemie studeren.
Figuur 1. Meting stroomschema van het protocol voor de analyse van glucosamine en muramic zuur in de bodemmonsters. Het protocol bevat voornamelijk 4 stappen: Acid spijsvertering, Zuivering, derivatisering en GC vastberadenheid.
Figuur 2. GC-FID chromatogrammen van aldononitrile acetaten van inositol, glucosamine, muramic zuur, mannosamine, galactosamine en methylglucamine voor normen en bodem.
Figuur 3. Regelingen voor de vorming van de aldononitrile acetaat gederivatiseerd glucosamine en muramic zuur. Het getal 1 nitril reactie. Het cijfer 2 staat acetylering.
Figuur 4. Massa spectra van aldononitrile acetaat gederivatiseerd glucosamine in verband met de dominante ionen structureeles onder EI-modus bereid met (A) niet-gelabelde stoffen, (B) D-azijn-anhydriet, (C) U -13 C-glucosamine. Star staat voor zware isotoop atoom of isotoop groep.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De gepresenteerde GC-gebaseerde methode voor de analyse van aldononitrile acetaat gederivatiseerde glucosamine en muramic zuur zorgt voor een relatief snelle methode om deze aminozuren suikers, gewonnen uit de bodem te kwantificeren. De derivaten zijn chemisch stabiel en kan worden bepaald in een analyse. De werkwijze is niet beperkt tot bodemmonsters, en kan worden vereenvoudigd monsters van niet-bodem matrix.
De vacuümpomp in deze methode is gebouwd om zuurbestendig. We suggereren verder het opzetten van een basis trap naar de pompen te beschermen wanneer het verdampen van 6M HCl-oplossingen. Er moet worden genomen tijdens de derivatisering stappen om rigoureus watervrije omstandigheden te houden, voor zowel de reagentia en glaswerk. Het werk moet worden uitgevoerd zonder vertraging. Glaswerk kraakheldere, door moffelen bij 550 ° C of door spoelen met oplosmiddel. Veiligheidsmaatregelen moeten worden genomen voor de behandeling van zuren, en sterk zure dampen tijdens verdamping. Aminoglycoside eenreeks antibioticum geproduceerd door de bodem levende organismen, is geïdentificeerd als een mogelijke interferentie, omdat het co-elueert met glucosamine of muramic zuur op DB-5 12, dus een tweede kolom met een andere stationaire fase chemie wordt aanbevolen als GC-FID is de primaire methode voor het kwantificeren van deze amino suikers. Wij adviseren een bevestiging detector volgende GC elueert voor toekomstige analyse. Voor ondubbelzinnige identificatie van sporen van biomarker in complexe matrices, raden we met behulp van geavanceerde instrumentatie, zoals GC-MSMS met meerdere reactie monitoring; voor een nauwkeurige kwantificering van biomarkers in de aanwezigheid van interfererende, raden wij doen kalibratie op basis van een aantal dominante massa-ionen die uniek zijn voor de biomarker derivaten.
Bevestiging van suiker structuur identiteit werd vervangen door het 15 N-hydroxylamine hydrochloride, gedeutereerde azijnzuuranhydride en 13 C en / of 15 N gelabeld biomarkers niet-gelabelde hydroxylamine-hydrochloride, azijnzuuranhydride en biomarkers ter voorbereiding van de derivaten, en monitoring voorspeld m / z verschuiving van karakteristieke ionen van het label ten opzichte van de niet-gemerkte derivaten. In bepaalde, omdat elk van acetaat groep bevat drie deuteriums en elke nitril groep bevat een 15 N atoom kan worden voorspeld dat ion m / z massaverschuiving wordt bepaald door het aantal groepen en acetaat nitrilgroep worden gepresenteerd in de structuur van ion fragmenten. Evenzo 13 C en / of 15 N-labeling bacteriecellen kan zowel om te bepalen hoeveel C-atomen in de fragment ion structuren afkomstig van de glucosamine of muramic zuur of glucosamine N-of muramic zuur-N bestaat in de fragment structuren.
GC-MS-EI-SIM is gaschromatografie volgt electron ionisatie massaspectrometrie met quadropole massa scheiding geselecteerde ioncontrolemethode, LC-ESI-TOF-MS vloeistofchromatografie gevolgd door electrospray ionisatie en massaspectrometrie met behulp van time-of-flight massa-scheiding. Wij hier wijzen op de verschillen tussen deze methoden die worden gebruikt om het molecuulgewicht en ion fragmenten te bepalen. ESI-TOF-MS een "zachte ionisatie" techniek op de ionisatie energie is die de analyt moleculen die laag genoeg, zodat er geen fragmentatie en geproduceerde signaal is een zeer nauwkeurige meting van het molecuulgewicht van de analyt. In GC-MS-EI is meer energie naar de analyt en het molecuul breekt waarbij een aantal geladen deeltjes. De quadropole werkt als een massa filter zodat alleen die fragmenten van een bepaalde massa / lading-verhouding te bereiken de detector. De verdeling van fragmenten, die kenmerkend is voor de analyt, wordt in een grafiek genoemd ion spectrum, waarbij de intensiteit of overvloed uitgezet tegen m / z. Om de gevoeligheid te verhogen, gebruiken we geselecteerd ion monitoring (SIM), waarin we het programma van de lidstaten te verzamelen slechts een aantal specifieke m / z-waarden rather dan de hele massaspectrum.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Wij hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door subsidies van DOE Great Lakes Bioenergy Research Center (DOE BER Office of Science DE-FC02-07ER64494). We zijn dankbaar aan Dr Xudong Zhang en zijn groepsleden voor nuttige technische discussies en waardevolle commentaar op het finaliseren van het protocol.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Muramic acid | Sigma-Aldrich | M2503-25MG | |
| D-(+)-glucosamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | G1514-100G | |
| N-methyl-D-glucamine | Sigma-Aldrich | M2004-500G | |
| Myo-inositol | Fisher Scientific | A307003G025 | |
| Methanol (dry) | Acros Organics | AC326950010 | |
| 4-dimethylamino-pyridine | Acros Organics | AC148270050 | |
| Ethyl acetate | VWR international | BJGC100-4 | |
| Hydroxlamine hydrochloride | Fisher Scientific | H330-100 | |
| Pyridine | Fisher Scientific | P368-500 | |
| Acetic anhydride | Fisher Scientific | A10-100 | |
| Dichloromethane (Methylene chloride) | Fisher Scientific | D37-500 | |
| Hexane | Fisher Scientific | H303-4 | |
| Hydrochloric acid (6M) | Fisher Scientific | S456-4 | |
| Hydroxylamine hydrochloride-15N | Icon services | IN5280 | |
| Acetic anhydride-2H (D6C4O3) | Acros Organics | AC174670050 | |
| D-glucose-U-13C | Cambridge Isotope Laboratories | CLM-1396-1 | |
| Ammonium sufate-15N | Cambridge Isotope Laboratories | NLM-713-1 | |
| Rapid-Vap | Labconco Corp. | 790002 | |
| Vacum pump | KNF Neuberger | D-79112 | |
| Hydrolysis flask | Fisher Scientific | 06 423A | |
| Derivatization microvial | Fisher Scientific | 06-100E | |
| GC | Hewlett-Packard | 6890 | |
| MS | Hewlett-Packard | 5972 | |
| LC-ESI-TOF-MS | Agilent Technologies | An Agilent 1200 series HPLC system coupled to an Agilent LC/MSD-TOF |
References
- Zelles, L. Fatty acid patterns of phospholipids and lipopolysaccharides in the characterisation of microbial communities in soil: a review. Biology and Fertility of Soils. 29, 111-129 (1999).
- Kirk, J. L. Methods of studying soil microbial diversity. Journal of Microbiological Methods. 58, 169-188 (2004).
- Joergensen, R. G., Emmerling, C. Methods for evaluating human impact on soil microorganisms based on their activity, biomass, and diversity in agricultural soils. Journal of Plant Nutrition and Soil Science. 169, 295-309 (2006).
- Guggenberger, G., Frey, S. D., Six, J., Paustian, K., Elliott, E. T. Bacterial and fungal cell-wall residues in conventional and no-tillage agroecosystems. Soil Science Society of America Journal. 63, 1188-1198 (1999).
- Amelung, W. Assessment Methods for Soil Carbon. Lal, R., Kimble, J. M., Follett, R. F., Stewart, B. A. , CRC/Lewis Publishers. Boca Raton, FL. 233-270 (2001).
- Guerrant, G. O., Moss, C. W. Determination of monosaccharides as aldononitrile, O-methyloxime, alditol, and cyclitol acetate derivatives by gas-chromatography. Analytical Chemistry. 56, 633-638 (1984).
- Zhang, X., Amelung, W. Gas chromatographic determination of muramic acid, glucosamine, mannosamine, and galactosamine in soils. Soil Biology and Biochemistry. 28, 1201-1206 (1996).
- Liang, C. Investigation of the molecular ion structure for aldononitrile acetate derivatized muramic acid. Journal of Microbiological Methods. 86, 224-230 (2011).
- He, H., Xie, H., Zhang, X. A novel GC/MS technique to assess 15N and 13C incorporation into soil amino sugars. Soil Biology and Biochemistry. 38, 1083-1091 (2006).
- Glaser, B., Gross, S. Compound-specific delta 13C analysis of individual amino sugars - a tool to quantify timing and amount of soil microbial residue stabilization. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 19, 1409-1416 (2005).
- Liang, C., Balser, T. C. Mass spectrometric characterization of amino sugar aldononitrile acetate derivatives used for isotope enrichment assessment of microbial residues. Soil Biology and Biochemistry. 42, 904-909 (2010).
- Liang, C., Pedersen, J. A., Balser, T. C. Aminoglycoside antibiotics may interfere with microbial amino sugar analysis. Journal of Chromatography A. 1216, 5296-5301 (2009).
