Summary
在有氧条件下进行细胞培养实验调查细菌的粘附和侵袭,通常是不具代表性的
Abstract
与宿主细胞的细菌性病原体的相互作用已被广泛研究,利用体外细胞培养方法。然而,由于这样的细胞培养实验是在有氧条件下进行的,这些在体外模型中,可能无法精确地表示在体内环境,使宿主病原体相互作用发生。我们已经开发出了不同的介质和气体条件下,允许细菌与宿主细胞的共培养感染的体外模型。厅(VDC)的垂直扩散模型模拟人体肠道的条件下,细菌会在那里将提供与从血液中的氧的条件下,是非常低的氧,而组织。配售极化肠上皮细胞(IEC)单层生长成VDC在Snapwell插入心尖和基底创建单独的车厢。基底外侧的隔室充满了细胞培养液中,密封,灌注与氧瓦特休斯特根尖车厢充满了肉汤,保持开放和微氧条件下培养。双方的Caco-2和T84的IEC可以维持在直流电压,在这些条件下,对细胞的存活或单层的完整性没有任何明显的不利影响。共培养实验进行不同C.空肠弯曲菌的野生型菌株和不同的IEC线VDC模型再现性与微需氧条件下在心尖室产生相互作用的数量(近10倍)的增加和细胞内细菌(近100倍)相比,有氧培养条件1。 VDC模型中创建的环境更加紧密地模仿环境C.遇到在人体肠道菌和突出表演体外感染实验条件下,更加紧密地模仿在体内现实中的重要性。我们建议,使用的VDC模型将允许下注的相互作用的新诠释WEEN细菌病原体和宿主细胞。
Introduction
与宿主细胞的细菌性病原体的相互作用已被广泛研究,利用体外细胞培养方法。使用这样的细胞培养实验中,细菌宿主细胞的粘附性,鉴定的受体宿主细胞,宿主细胞的信号转导途径和细菌入侵宿主细胞都被详细研究,导致在许多重要的观测。然而,这样的细胞培养实验是在有氧条件下,可能不具有代表性的体内环境。 在体外模型用来研究胃肠道感染是一个主要的限制,文化条件,包括高氧含量普遍青睐真核细胞的存活。然而,在肠腔内的条件下将几乎是厌氧的。在一个非常低的氧环境下的肠道病原体表达的毒力基因的表达在有氧条件下的变化2。因此,获得的数据,使用标准的细胞培养模型M可能给出不准确的指示细菌与宿主细胞的相互作用。
空肠弯曲菌是细菌性急性胃肠炎全球领先的病原体,症状范围从轻度腹泻到严重的炎症性肠炎。 C.大多数空肠弯曲菌感染导致并发症的胃肠炎,但是C.空肠弯曲菌是最常见的周围神经病变,包括格林-巴利综合征(GBS)的传染性病原体。据估计,在英国,有超过50万的情况下,引起肠炎C.菌感染,每年对英国经济的预测成本5.8亿英镑。在发展中世界,C.菌是儿童死亡的首要原因。尽管无疑是十分重要的弯曲杆菌感染和几十年的研究,包括彻底的基于基因组学的分析,C.菌的发病机制仍是不佳understOOD,对比其他肠道致病菌如沙门氏菌 , 大肠杆菌 , 痢疾杆菌 , 霍乱弧菌 。一个方便的小动物模型的缺乏是其中一个主要原因,这3。此外,广泛应用于体外感染模型更不适用于研究微需氧C.菌比其他肠道致病菌,兼性厌氧菌。虽然C。菌侵入的病原体,机制C.确认为菌侵入肠上皮细胞(IECS)目前仍不清楚。C. 4,5 空肠弯曲菌侵袭已被证明是依赖于以微丝,微管,两者的组合或两者都不是5。在这方面的混乱,最有可能是由于在体外试验条件下的使用不恰当的。
已使用的许多不同的细胞培养实验,调查C的相互作用菌与宿主细胞。 Caco-2细胞,INT 407 7,T84 8芯线都被用于研究不同C.黏附和侵袭能力菌菌株。不过,该水平的细菌粘附和入侵C.空肠弯曲菌与IECS是大大低于其他肠道病原体9。共培养C.空肠弯曲菌与IECS通常是附近的大气中的氧水平的条件下,在CO 2培养箱中进行,所需的生存的IEC C。空肠弯曲菌基因表达会有很大的不同,在低氧气的环境相比,大气中的氧气条件下肠腔。
已开发的垂直扩散商会系统(VDC)的使用,它允许根据不同的介质和气体条件1,10,11细菌与宿主细胞的共培养。该系统模拟的条件在人体肠道中的细菌将被取消从血液中的氧会被提供一个非常低的氧,而组织的性别条件。有极性的IEC单层生长在特殊的0.4μm的过滤器被放置成一个直流电压,创建心尖和基底的隔室,与细菌的发酵液和细胞培养基中( 图1),并分别填充。的直流电压被放入变量的气氛含有85%N 2,5%O 2,和10%的CO 2培养箱在37℃下,较下的最佳条件为空肠弯曲菌 。心尖室敞开和变量气氛培养箱内暴露于微氧气氛,而密封的基底外侧隔室与氧气的供给恒定给药5%CO 2/95%O 2的混合气体与出口管防止压力积累。获确认通过监测跨膜元素,Caco-2细胞的生存和在这些条件下的单层的完整性跨单层超过24小时ctrical电阻(TEER),以证明生存的Caco-2细胞单层和物理分离的心尖和基底低氧条件下在心尖的隔室的隔室。单层TEER在变量的气氛孵化器(微氧条件)和标准的细胞培养CO 2培养箱(有氧条件下)保持在VDC的没有表现出显着性差异,表明细胞单层的完整性不同大气条件下1。微氧条件下,紧密连接仍然存在occludin的染色模式类似于细胞维持在有氧条件下1单元格边框之间均匀分布。
C.的相互作用空肠弯曲菌与Caco-2细胞和T84细胞在VDC进行了研究,通过评估细菌相互作用(粘附和侵袭)和侵袭。两种不同的C。菌野生型笔直NS 1。C.空肠弯曲菌 11168H是一个hypermotile的的原始序列菌株NCTC11168的衍生物。 11168H应变显示在一个小鸡定植模型定植水平高得多,因此被认为是一个合适的菌株用于宿主 - 病原体相互作用的研究。 81-176是人类的隔离是最侵入性的广泛的研究的实验室菌株之一。C.空肠弯曲菌菌株中加入微需氧或好氧条件下向根尖隔室的一个直流电压。我们观察到互动和侵袭率较高C.录菌微氧条件下1。 C.增加菌相互作用不是由于细菌数量增加,微氧条件下1。在心尖的隔室中的VDC的低氧环境中增强了细菌宿主的相互作用,并指示此数据支持了我们的假设,C.侵入性的性质的空肠弯曲菌是增量在这些条件下的缓解。这是首次报告使用的VDC模型研究侵袭性细菌病原体,并进行体外感染实验条件下,更加紧密地模仿体内的情况突出的意义。 VDC模型可以用来研究许多不同的细菌宿主 - 病原体相互作用。
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Protocol
1。 IEC单层生长的特殊0.4微米的过滤器
- 文化活动碳酸钙-2细胞在Dulbecco氏修改的必不可少的介质(DMEM)与10%(体积/体积)胎儿小牛血清,100 U / ml的青霉素,100μg/ ml的链霉素和1%(体积/体积)中的不必要的氨基酸补充标准组织培养孵化器在37℃下在5%CO 2和95%空气。种子4×10 5的 Caco-2每0.4微米过滤器的IEC和增长极化超过21天,每2-3天改变媒体。
- 测量的TEER的单层使用伏欧姆电阻表确认极化状态。在我们的研究中,21天的TEER的Caco-2细胞生长在这0.4μm的过滤器是700-800欧姆厘米2。
2。 C.制备空肠弯曲菌和细菌的共培养培养基含量
- 24小时前VDC共培养实验所需的起始点,准备一个新鲜的血琼脂平板上的C。空肠弯曲菌和孵化,在37℃微氧条件下(85%N 2,O 2 5%,10%CO 2)在变量的气氛孵化器。
- 在同一时间,垫上预温育30毫升的布鲁氏杆菌肉汤中,于37℃微需氧条件下,在一个可变气氛的孵化器。
3。制备和灭菌,检测前的VDC半钱伯斯
- 完全沉浸VDC半室以及O型圈,并在消毒溶液中的插头。
- 使用无菌的20毫升注射器,通过进气口的两个半室灭菌溶液冲洗。如果不这样做,可能会导致共培养过程中的样品污染。
- 保留所有组件沉浸在1小时的灭菌水溶液。
- 用新鲜无菌水冲洗所有组件,用另一个无菌的20毫升注射器冲洗进气口。
4。准备细菌接种物
- 收获C.半一盘菌生长的血琼脂平板准备的前一天为1毫升的预孵育布氏肉汤。这应该产生〜10 CFU /毫升。
- 的细菌悬浮液的光密度测量,在600nm semiquantify细菌菌落形成单位(的CFUs)。
- 调整到所需的接种量在4毫升的预培养的布鲁氏杆菌肉汤中的细菌悬浮液。
- 从这个最后的细菌悬浮液,然后通过电镀适当的稀释血琼脂平板上,一式三份,然后在37℃下孵育48小时,在变量气氛培养箱量化存在于接种物中的细菌的CFUs的数目进行连续稀释。
5。设置直流电压
- 将VDC单位的下半部室的板凳上。适合O型圈到下半部室。
- 分离一个过滤器从t携带的IEC他载波和400微升无菌PBS洗三次。将过滤器到的下半部室,确保O形圈保持在原位。
- 轻轻放下的上半腔到位。两个半室后组装而成,使用环型夹夹在一起。将VDC水平在板凳上顶部,与两个开口朝上。
- 添加4毫升细菌接种到心尖的半室。
- 添加4毫升细胞培养液为基底的半室。
- 将末尾件到两个半室上的开口。
6。安装VDC气歧管内的可变大气孵化的
- 将VDC到变量的气氛培养箱在靠近气歧管。
- 打开连接的气体歧管的气体供给调节器。从歧管上的管连接到进气口上的基底侧的半室的直流电压。附加的GA口门管领导变量的气氛孵化到底片基底的半室的网点之一。
- 关闭关闭其他出口到底片基底的半室。打开气流气歧管上,照顾打开很慢,以避免多余的气体压力,因为这可能会导致驱逐基底介质。
- 宗旨是每2-5秒1气泡的气体流。定期进行检查,在实验过程中气体的流动过程中,必要时调整。
7。拆卸VDC共培养后
- 经过适当的共培养期间,关闭气源稳压器连接到气歧管。关闭气体流量到VDC歧管。断开气体入口,气体出口和从直流电压中的止动件。
- 删除VDC从可变的气氛孵化。删除心尖和基底上清和储存在-80°C subsequent检验。
- 拆下环形夹子和轻轻拆开VDC。从半室转移到无菌的6孔细胞培养皿中取出过滤器。 IECS 3次洗净,用400μl的无菌PBS。
- 对于枚举相互作用的细菌总数,添加400μl的无菌PBS含有0.1%(体积/体积)的Triton X-100的IEC,并在室温下孵育20分钟以裂解的IEC。随后通过电镀适当的稀释血琼脂平板上,一式三份,然后在37℃下孵育48小时,在变量气氛培养箱量化相互作用的细菌的CFUs的数目从该细胞裂解物进行连续稀释。
- 对于枚举入侵的细菌总数,在5%CO 2和95%DMEM培养液细胞培养液中含有150微克/毫升庆大霉素的IEC和在标准组织培养孵化2小时孵育在37℃下加入400微升杀灭空气中胞菌,然后按照上述步骤7.4。
8。清洁VDC共培养后
洗净,用无菌水和存储,为下一轮实验的直流电压。
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Representative Results
共培养实验用C.空肠弯曲菌的野生型菌株和在VDC与微需氧条件下在心尖室模型的IEC已经证实,在相互作用的数量增加(几乎10倍)和细胞内(近100倍)相比,细菌的需氧培养条件下,在一个时间依赖的方式1。这一观察结果是再现的使用两个不同的C。空肠弯曲菌野生型菌株(11168H 81-176)和两个不同的IEC线(Caco-2细胞和T84),突出VDC模型1的有效性。
这里提出的具有代表性的结果C.数之间的比较空肠弯曲菌相互作用或入侵后3,6,或24小时的共培养的Caco-2细胞在任一标准的细胞培养在CO 2培养箱中( 图2A和B)或直流电压模型的测定条件下微需氧条件下在心尖的COM却已( 图2C和D)。数据在两个不同的C。菌野生型菌株(11168H 81-176)。根据标准的细胞培养条件下使用,在绝大多数的研究在科学文献中,<10 7个菌落形成单位与Caco-2细胞( 图2A)相比,观察到交互〜10 8菌落形成单位与Caco-2细胞中的VDC观察到的相互作用24小时后的模型( 图2C)。共培养后的直流电压模型,Caco-2细胞( 图2D),相比之下,只有〜10 6 Caco-2细胞( 图2B)为标准的细胞培养条件下共培养后分离出的细胞内菌落中分离〜10 7细胞内的菌落形成单位24小时。
C.数之间的直接比较菌相互作用或侵入的IEC VDC模型共培养后,无论是微氧或有氧条件蒸发散在心尖室已执行先前1。使用的VDC的模型结果在相互作用C.增加空肠弯曲菌的近10倍,增加细胞内C.菌近100倍后,24小时共培养1。
图1。示意性的垂直扩散厅(VDC)的模型。肠道上皮细胞(IECS)是生长在透水0.4微米的过滤器支撑并插入到一个直流电压,从而创造的顶端和基底外侧隔室。这些隔室可以单独调整以使共培养的IEC与C相对于介质和气体组成空肠弯曲菌的IEC和有氧条件下在基底表面的IEC的顶端表面,在微需氧条件。
图2。代表性的成果比较多的C空肠弯曲菌野生型菌株11168H或81-176(A和C)进行交互,或入侵(B和D)Caco-2细胞共培养实验后3,6或24小时时进行任何一种标准的细胞培养条件下,在CO 2培养箱(A和B)或VDC模型在心尖室(C和D)的微氧条件下 , 所有实验代表至少有三个生物复制在每个实验重复进行。 点击这里查看大图 。
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Discussion
研究细菌病原体与宿主细胞的相互作用是在体外细胞培养的方法,使用广泛采用的一种技术,在许多研究实验室。然而,由于这样的细胞培养实验是在有氧条件下进行的,这些在体外模型中,可能无法精确地表示在体内环境,使宿主病原体相互作用发生。 在体外感染模型被广泛使用的是特别不合适的学习微需氧C.菌相比其他肠道致病菌,兼性厌氧菌。在文献中有相当大的混乱,就入侵人类的IEC机制C.菌 4,5。我们建议,入侵机制知之甚少的原因是因为在这些研究中所使用的体外模型不能准确地反映体内的情况。使用标准的细胞培养分析,水平C. IECS 菌入侵总是很低。 VDC模型的发展是我们的反应来解决这个问题。
我们已经建立了两个不同的IEC线可以保持在微需氧条件下的顶端表面中的VDC中,在24小时内1没有任何观察到的不利影响。两者相互作用和胞内C.时间依赖性增加的数字观察11168H 空肠弯曲菌的野生型菌株的细菌共培养后,与Caco-2细胞与微需氧条件下在心尖室1在直流电压的IEC。这些观察结果进一步证实使用IEC的第二线(T84),以及一个第二C。空肠弯曲菌的野生型菌株(81-176),表示无细胞系或细菌菌株的具体影响1。这些细菌的互动和侵袭水平的提高导致的增加,偏光先天的免疫反应IECS 1。 HIG微氧共培养后检测她的IL-8的水平,表明细菌的挑战的增加一致,增加宿主反应。向根尖上清液相比基底上清液中检测到较高水平的IL-8,这表明IL-8的分泌的IEC主要发生从基底IEC表面。 IL-8是中性粒细胞的引诱剂,这将是有限的使用在肠腔。此数据表明,两隔室设置的直流电压,也可以有效地识别的偏振光的宿主反应。
几个特点VDC模型有关的技术/设置侧前必须考虑应用模型来研究任何病原体。首先,必须生长的IEC特别0.4μm的过滤器上,形成一个不渗透的单层。这需要14-21天之间,取决于所使用的细胞系,并使得相当冗长的实验古典cocultu相比环实验,在细胞培养板,并执行使用IECS生长1-7天之间。另一方面,只有经过这么长的增长期的IEC已被证明,以形成完全极化的单分子层。这种偏振单层模仿在人的肠上皮细胞在体内的情况更紧密地比无极性的,在一些研究中使用的IEC nonconfluent线,因此提供直流电压模型的另一个优点。其次,特殊的0.4微米的过滤器是一个标准的24孔细胞培养板明显更昂贵的比。直流电压的主要限制是相对较低的通过。这主要是由于可用性的VDC室和设置需要气歧管。只有相对较低的数字,可以在同一时间进行的并行复制,对比古典的细胞培养方法。 VDC模型,因此不太适合大规模筛选试验或实验需要大量的副本工商业污水附加费。另一个要考虑的因素是,在VDC模型进行共培养检测手段的重力效应,随着时间的推移,细菌就会开始聚集在根尖车厢底部的机会减少的相互作用与IEC单层。然而,使用VDC模型,我们已经表明,无动力,nonaggregating 11168H rpoN突变体的相互作用显着降低相比能动,聚合后,6小时1 11168H野生型菌株。我们目前正在修改VDC模型,将允许一些混合的顶舱,将更加紧密地模仿蠕动的肠腔。因此,当直流电压模型优于经典的,有氧细胞培养方法更紧密地模仿体内的情况,特别是对于细菌如C空肠弯曲菌有严格的大气要求,VDC模型仍然具有一定的局限性,需要采取考虑到设计实验时。
我们的数据支持的结果报告了类似的VDC模型用来研究人类胃癌的致病菌幽门螺旋杆菌 ,这表明增加细菌粘附于宿主细胞,增加细菌毒力因子的合成,以及增加宿主先天免疫反应,当H.幽门螺旋杆菌是培养上皮细胞在微氧相比,有氧条件下11。由于两个H.幽门和C空肠弯曲菌的增长需要微好氧条件下,发现微需氧条件下促进与宿主细胞的相互作用的生物是不足为奇的。然而,另一项研究中,使用一个直流电压系统的相互作用分析的兼性厌氧菌,肠出血性大肠杆菌的IEC显示VDC心尖部室10的厌氧/微氧共培养条件下细菌相互作用的水平增加。 Ť他指示的IEC厌氧/微需氧条件下共培养时,能够在大气中的氧气条件下的增殖的细菌,该行为也被改变。这表明,在直流电压模型,改进的,有价值的许多不同的致病性细菌的宿主-病原体相互作用的分析模型的条件下,更忠实地在人体肠道管腔体内的情况类似。
从模型的角度来看,VDC的模型已被证明在体外空肠弯曲菌 IEC共培养模型具有一些明显的优势有氧。 VDC模型创建的环境中更加紧密地模仿期间C.在人体肠道环境菌感染,导致在交互和侵入的IEC细菌数目的高度显着增加。 VDC模式在当前的格式是理想的研究肠道细菌的相互作用,胃或肠上皮细胞,但有潜在VDC模型适应研究严格厌氧菌从粪便样品,或用于口服的微生物样品,只是两个例子。最重要的原则应该始终是旨在执行这些共存的实验条件下,更加紧密地模仿体内的情况。 VDC模型C.进一步的研究将是一个重要的工具空肠弯曲菌宿主病原体相互作用和应该是适用于许多不同的细菌的致病机制的研究。
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Disclosures
我们什么都没有透露。
Acknowledgments
多米尼克·米尔斯由布卢姆斯伯里高校博士助学金(2007-2010年)的支持。笔者想感谢他们协助开发的VDC模型的OZAN Gundogdu和阿卜迪·艾尔米。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Speciality vertical diffusion system for use with Snapwell inserts | Harvard Apparatus | 66-0001 | Manifold & six Snapwell chambers |
Caps | Harvard Apparatus | 66-0020 | |
O-rings | Harvard Apparatus | 66-0007 | |
Clamps | Harvard Apparatus | 66-0012 | |
Snapwell filters (pore size 0.4 μm) | Corning Costar | 3407 | |
Millicell ERS-2 Volt-Ohm resistance meter | Millipore | MERS00002 | |
WPA Lightwave II spectrophotometer | Biochrom | 80-3003-72 |
References
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