Summary
Realización de ensayos de cultivo celular para investigar la adhesión bacteriana y la invasión en condiciones aerobias es generalmente representativo de la
Abstract
Las interacciones de patógenos bacterianos con células huésped se han investigado extensamente en el uso de métodos de cultivo celular in vitro. Sin embargo, como estos ensayos de cultivo celular se realizan bajo condiciones aeróbicas, estos modelos in vitro pueden no representar con precisión el entorno in vivo en el que las interacciones huésped-patógeno se llevan a cabo. Hemos desarrollado un modelo in vitro de la infección en que permite que el co-cultivo de las bacterias y las células huésped bajo diferentes condiciones de medio y de gas. La cámara de difusión vertical (VCC) modelo imita las condiciones en el intestino humano, donde las bacterias estarán en condiciones de muy baja, mientras que los tejidos de oxígeno serán suministrados con el oxígeno del torrente sanguíneo. La colocación de monocapas de células epiteliales intestinales polarizadas (IEC) obtenidas en los prospectos Snapwell en una VDC crea compartimentos apical y basolateral separados. El compartimento basolateral se llena con medio de cultivo celular, sellado y perfundidos con oxígeno wHilst el compartimiento apical está lleno de caldo, mantienen abiertas y se incubaron bajo condiciones microaeróbicas. Tanto Caco-2 y T84 IECs se pueden mantener en el VDC bajo estas condiciones, sin efectos perjudiciales aparentes sobre la supervivencia celular o integridad de la monocapa. Experimentos de cocultivo a cabo con diferentes C. jejuni cepas de tipo salvaje y diferentes líneas de IEC en el modelo VCC con condiciones microaeróbicas en el compartimiento apical reproducible resultan en un aumento en el número de interactuar (casi 10 veces) y las bacterias intracelulares (casi 100 veces) en comparación a las condiciones de cultivo aerobio 1. El ambiente creado en el modelo VDC imita más de cerca el ambiente encontrado por C. jejuni en el intestino humano y pone de relieve la importancia de llevar a cabo en ensayos de infección in vitro en condiciones que imitan más estrechamente la realidad in vivo en el. Proponemos que el uso del modelo VDC permitirá nuevas interpretaciones de las interacciones apuestaween patógenos bacterianos y células huésped.
Introduction
Las interacciones de patógenos bacterianos con células huésped se han investigado extensamente en el uso de métodos de cultivo celular in vitro. El uso de estos ensayos de cultivo celular, la adhesión bacteriana a las células huésped, la identificación de los receptores de la célula huésped, célula huésped vías de señalización y la invasión bacteriana de células huésped todas han sido estudiados en detalle, lo que resulta en muchas observaciones importantes. Sin embargo, tales ensayos de cultivo celular se realizan bajo condiciones aeróbicas que pueden no ser representativos de la ambiente in vivo. Una limitación importante de los modelos in vitro utilizados para estudiar infecciones gastrointestinales es que las condiciones de cultivo, incluyendo altos niveles de oxígeno generalmente favorecen la supervivencia celular eucariota. Sin embargo las condiciones en el lumen intestinal serán casi anaeróbica. Patógenos entéricos en un entorno muy poco oxígeno expresan genes de virulencia cuya expresión cambia en condiciones aeróbicas 2. Como tal, los datos obtenidos utilizando el estándar de cultivo celular modelos may dar una indicación inexacta de las interacciones con las células huésped bacterianas.
Campylobacter jejuni es el agente causal principal de gastroenteritis aguda bacteriana en todo el mundo, con síntomas que van desde diarrea leve hasta enteritis inflamatoria severa. La mayoría de C. jejuni infecciones producen gastroenteritis sin complicaciones, sin embargo C. jejuni es también el agente infeccioso identificado con mayor frecuencia en las neuropatías periféricas, incluyendo el síndrome de Guillain-Barré (GBS). En el Reino Unido, se estima que hay más de 500.000 casos de enteritis causadas por C. jejuni infección cada año con un coste previsto de la economía del Reino Unido de £ 580 millones. En el mundo en desarrollo, C. jejuni es la causa principal de mortalidad entre los niños. A pesar de la indudable importancia de la infección por Campylobacter y décadas de investigación, incluido el análisis basada en la genómica completa, C. jejuni patogenia es aún mal comprendood, en contraste con otros patógenos entéricos, tales como Salmonella, Escherichia coli, Shigella y Vibrio cholerae. La falta de un modelo animal pequeño conveniente es una razón principal para este 3. También el ampliamente utilizado en modelos de infección in vitro son más apropiado para el estudio de microaerophilic C. jejuni que para otros patógenos entéricos que son anaerobios facultativos. Mientras que C. jejuni es reconocido como un patógeno invasor, los mecanismos de C. jejuni invasión de las células epiteliales intestinales (IECS) aún no están claros 4,5. C. invasión jejuni ha demostrado ser dependiente de cualquiera de microfilamentos, microtúbulos, una combinación de ambos o ninguno 5. La confusión en esta zona es muy probablemente debido a la utilización de no apropiado en condiciones de ensayo in vitro.
Un número de diferentes ensayos de cultivo celular se han utilizado para investigar las interacciones de C. jejunicon las células huésped. Caco-2 6, INT 407 7, y 8 líneas de células T84 han todos han utilizado para estudiar las capacidades de adherencia y la invasión de diferentes C. jejuni cepas. Sin embargo, los niveles de la adhesión bacteriana y la invasión de C. jejuni con IECs son considerablemente inferiores a los de otros patógenos entéricos 9. El cocultivo de C. jejuni con IECs se realiza normalmente en un incubador de CO2 en condiciones próximas a los niveles de oxígeno atmosférico, necesario para la supervivencia de IECs. C. la expresión de genes jejuni será muy diferente en el entorno de bajo oxígeno de la luz intestinal en comparación con las condiciones de oxígeno atmosférico.
El uso de un sistema de cámara de difusión vertical (VCC) ha sido desarrollado que permite el co-cultivo de las bacterias y las células huésped bajo diferentes condiciones de medio y de gas 1,10,11. Este sistema imita las condiciones en el intestino humano, donde las bacterias no sufriráder condiciones de muy bajo, mientras que los tejidos de oxígeno se suministran con el oxígeno de la corriente de la sangre. Monocapas de IEC polarizadas cultivadas en filtros de 0,4 micras especiales se colocaron en una VCC la creación de un compartimento apical y basolateral, que se llenaron individualmente con caldo bacteriano y medio de cultivo celular, respectivamente (Figura 1). El VDC se colocó en la atmósfera variable de incubadora que contiene 85% de N 2, 5% de O 2, y CO 2 al 10% a 37 ° C, que representa las condiciones óptimas para C. jejuni. El compartimento apical se dejó abierta y expuesta a la atmósfera microaerobia dentro de la atmósfera variable de incubadora, mientras que el compartimento basolateral sellada fue suministrado con oxígeno mediante la administración constante de 5% de CO 2/95% de O 2 mezcla de gas con un tubo de salida prevención de la acumulación de la presión . Caco-2 y la supervivencia celular integridad de la monocapa en estas condiciones se confirmaron mediante la supervisión del elemento transepitelialresistencia ctrical (TEER) a través de la monocapa de más de 24 horas para demostrar la supervivencia de células Caco-2 monocapa celular y separación física de los compartimentos apical y basolateral en condiciones bajas de oxígeno en el compartimiento apical. La TEER de monocapas en los CDA mantenidos en la atmósfera incubadora variables (condiciones microaeróbicas) y en un cultivo de células de CO 2 incubadora estándar (condiciones aeróbicas) no mostró diferencias significativas, indicando la integridad de la monocapa de células en diferentes condiciones atmosféricas 1. En condiciones microaeróbicas, uniones estrechas se mantuvo presente y distribuida de manera uniforme entre los bordes de las celdas con un patrón de tinción similar a la ocludina células mantenidas en condiciones aeróbicas 1.
Las interacciones de C. jejuni con células Caco-2 y células T84 en el VDC fueron investigados mediante la evaluación de la interacción bacteriana (adherencia y la invasión) y la invasión. Dos diferentes C. jejuni wild-type strains se utilizaron 1. C. jejuni 11168H es un derivado de la cepa hypermotile secuencia original NCTC11168. La cepa 11168H muestra los niveles de colonización mucho más altos en un modelo de colonización de pollo y por lo tanto se considera una cepa adecuada a utilizar para estudios de interacción huésped-patógeno. 81-176 es un aislado de humanos y es una de las cepas de laboratorio ampliamente estudiados más invasivos. C. jejuni cepas fueron añadidos al compartimiento apical de una VCC ya sea bajo condiciones microaeróbicas o aeróbico. Hemos observado tasas más altas tanto para la interacción y la invasión se registraron para C. jejuni en condiciones microaeróbicas 1. El aumento de la C. interacciones jejuni no se debieron a un aumento en el número de bacterias en condiciones microaerobias 1. Estos datos apoyan nuestra hipótesis de que el entorno de bajo nivel de oxígeno en el compartimento apical de la VCC mejora las interacciones bacteria-huésped e indica que las propiedades invasivas de C. jejuni son incraliviado en estas condiciones. Este fue el primer informe del uso del modelo de VCC para estudiar un patógeno bacteriana invasiva y pone de relieve la importancia de llevar a cabo en ensayos de infección in vitro en condiciones que más estrechamente imita la situación in vivo. El modelo VCC podría ser utilizado para estudiar las interacciones huésped-patógeno para muchas especies bacterianas diferentes.
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Protocol
1. El crecimiento de monocapas IEC en especial 0.4 Filtros micras
- Cultura Caco-2 células en medio esencial modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% (v / v) de suero de ternero fetal, 100 U / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina y 1% (v / v) de aminoácidos no esenciales en una tejido estándar de cultivo en estufa a 37 ° C en 5% de CO2 y 95% de aire. Seed 4 x 10 5 células Caco-2 IECs por 0,4 micras filtran y crecen a la polarización durante 21 días, el cambio de los medios de comunicación cada 2-3 días.
- Mida la TEER para confirmar el estado de polarización de la monocapa utilizando un medidor de resistencia de Volt-Ohm. En nuestros estudios, la TEER de 21 días Caco-2 células cultivadas en estos filtros de 0,4 micras es 700-800 Ωcm 2.
2. Preparación de C. jejuni y el Medio bacteriana Para el ensayo de cocultivo
- 24 horas antes de la punto de inicio deseado del ensayo cocultivo VDC, preparar una placa de agar sangre fresca de C. jejuni y se incuba a 37 ° C en condiciones microaeróbicas (85% N 2, 5% O 2 y CO 2 del 10%) en la atmósfera variable de incubadora.
- Al mismo tiempo, preincubar 30 ml de caldo de Brucella a 37 ° C en condiciones microaerobias en un ambiente incubadora variable.
3. Preparación y esterilización de las medias cámaras VDC antes del ensayo
- Sumerja completamente las cámaras VDC medio, así como las juntas tóricas y los tapones en la solución de esterilización.
- Mediante una jeringuilla estéril 20, lave la solución de esterilización a través de las entradas de gas en ambas cámaras medio. El no hacerlo puede resultar en la contaminación de las muestras durante el cocultivo.
- Deje todos los componentes inmersos en la solución de esterilización para> 1 hr.
- Enjuague todos los componentes con agua estéril fresco, utilizando otra jeringa estéril de 20 ml para eliminar las entradas de gas.
4. Preparacióndel inóculo bacteriano
- Cosecha medio de una placa de C. jejuni crecimiento de la placa de agar sangre preparó el día anterior en 1 ml del caldo de Brucella preincubado. Esto debería dar ~ 10 10 ufc / ml.
- Medir la densidad óptica de la suspensión bacteriana a 600 nm para semicuantificar unidades formadoras de colonias bacterianas (CFU).
- Ajustar la suspensión bacteriana al nivel de inóculo deseado en 4 ml de caldo de Brucella preincubado.
- Realizar una dilución en serie a partir de esta suspensión bacteriana final, seguido de chapado de las diluciones apropiadas en placas de agar sangre, por triplicado, a continuación, se incuba a 37 ° C en la atmósfera variable de incubadora durante 48 horas para cuantificar el número de UFC bacterianas presentes en el inóculo.
5. Configuración del VDC
- Coloque la cámara de mitad inferior de un VDC plana sobre el banco. Coloque una junta tórica en la cámara media más baja.
- Separe un filtro que llevan los IECs de tél portador y lavar tres veces con 400 l de PBS estéril. Coloque el filtro en la cámara media inferior, asegurándose de que la junta tórica permanece en su lugar.
- Baje con cuidado la cámara de medio superior en su lugar. Una vez que las dos medias cámaras están montadas, la abrazadera juntas usando las abrazaderas de anillo. Coloque el VDC horizontalmente en la parte superior del banco, con las dos aberturas hacia arriba.
- Añadir el 4 ml de inóculo bacteriano en la cámara de medio apical.
- Añadir 4 ml de medio de cultivo celular en la cámara de medio basolateral.
- Coloque las piezas de los extremos en las aberturas en ambas cámaras medio.
6. Colocación de la CC al colector de gas dentro de la variable de ambiente Incubadora
- Coloque el VDC a la atmósfera variable de incubadora en estrecha proximidad con el colector de gas.
- Abra el regulador de suministro de gas conectado al colector de gas. Fije el tubo desde el colector en la entrada de gas en la cámara de medio basolateral de la VCC. Conecte el gas tubo de salida que conduce fuera de la variable ambiente incubadora a uno de los puntos de venta en la pieza final en la cámara de medio basolateral.
- Cierre la otra salida de la pieza final en la cámara de medio basolateral. Abra el flujo de gas en el colector de gas, teniendo cuidado para abrirlo muy lentamente para evitar el exceso de presión de gas, ya que esto puede conducir a la expulsión del medio basolateral.
- El objetivo es un flujo de gas de 1 burbuja cada 2-5 seg. Periódicamente comprobar el flujo de gas durante el transcurso del experimento y ajustar si es necesario.
7. Desmontaje del VDC después Coculture
- Después del periodo de co-cultivo apropiado, cerrar el regulador de suministro de gas conectado al colector de gas. Cierre el suministro de gas en el VDC en el colector. Desconectar la entrada de gas, la salida de gas y el tapón de la VCC.
- Retire el VDC de un ambiente incubadora variable. Retirar el sobrenadante y almacenar apical y basolateral a -80 ° C para subsequenanálisis de t.
- Retire las abrazaderas del anillo y tome suavemente aparte del VDC. Quite el filtro de la cámara de medio y transferir a un 6-así placa de cultivo celular estéril. Lávese las IECS tres veces con 400 l de PBS estéril.
- Para la enumeración del número total de bacterias que interactúan, añadir 400 l de PBS estéril que contiene 0,1% (v / v) de Triton X-100 a las IECs y se incuba durante 20 min a temperatura ambiente para lisar la IEC. Realizar una dilución en serie de este lisado celular, seguido por chapado de las diluciones apropiadas en placas de agar sangre, por triplicado, a continuación, se incuba a 37 ° C en la atmósfera variable de incubadora durante 48 horas para cuantificar el número de interactuar UFC bacterianas.
- Para la enumeración del número total de bacterias invasoras, añadir 400 l de medio de cultivo celular DMEM que contiene 150 mg / ml de gentamicina a los IECs y se incuba durante 2 horas en un incubador de cultivo de tejido estándar a 37 ° C en 5% de CO 2 y 95% aire para matar las bacterias extracelulares,luego siga como para el paso 7.4 anterior.
8. Limpieza del VDC después Coculture
Lave el VDC con agua estéril y tienda para la siguiente ronda de experimentos.
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Representative Results
Experimentos de cocultivo realizaron con un C. jejuni cepa de tipo salvaje y los IEC en el modelo VCC con condiciones microaeróbicas en el compartimiento apical han demostrado un aumento en el número de interactuar (casi 10 veces) y las bacterias intracelulares (casi 100 veces) en comparación con las condiciones de cultivo aerobias en un momento que dependen de forma 1. Esta observación fue reproducible usando dos diferentes C. jejuni cepas de tipo salvaje (11168H y 81-176) y dos líneas de educación y comunicación diferentes (Caco-2 y T84), destacando la validez del modelo VDC 1.
Los resultados representativos se presentan aquí son una comparación entre el número de C. jejuni interactuar con o invadir las células Caco-2 después de 3, 6 o 24 h de cocultivo ya sea bajo condiciones de ensayo de cultivo celular estándar en un incubador de CO2 (Figuras 2A y B) o en el modelo de VCC con condiciones microaeróbicas en la com apicalmento (Figuras 2C y D). Los datos para dos C. diferente se presentan jejuni cepas de tipo salvaje (11168H y 81-176). Bajo las condiciones estándar de cultivo celular utilizados en la gran mayoría de los estudios en la literatura científica, <10 7 ufc se observaron interactuar con células Caco-2 células (Figura 2A) en comparación con ~ 10 8 ufc observó interacción con las células Caco-2 en el VDC modelo (Figura 2 C) después de 24 horas. Después de cocultivo en el modelo de VCC, ~ 10 7 ufc intracelular fueron aisladas de las células Caco-2 (Figura 2D), en comparación con sólo ~ 10 5 ufc intracelular aislado de células Caco-2 (Figura 2B) después de co-cultivo bajo condiciones estándar de cultivo celular para 24 hr.
Una comparación directa entre el número de C. jejuni interactuar o invadir IECs después de co-cultivo en el modelo VDC con cualquiera microaeróbica o aeróbico condicionesciones en el compartimiento apical se ha realizado previamente 1. El uso de los resultados del modelo de VCC en un aumento en la interacción C. jejuni de casi 10 veces y un incremento intracelular en C. jejuni de casi 100 veces después de 24 h de cocultivo 1.
Figura 1. Esquema de la cámara de difusión vertical (VCC) modelo. Células epiteliales intestinales (IECs) se cultivan en soportes de filtro permeables 0,4 micras y se inserta en un VCC, creando así una apical y un compartimento basolateral. Estos compartimentos se pueden ajustar de forma individual con respecto al medio y la composición del gas para permitir que el cocultivo de las IECs con C. jejuni con condiciones microaeróbicas a la superficie apical de las IECs y las condiciones aeróbicas en la superficie basolateral de las IECs.
Figura 2. Los resultados representativos comparación de números de C. jejuni 11168H o 81-176 cepas de tipo salvaje que interactúan con (A y C) o invasor (B y D) las células Caco-2 después de 3, 6 o 24 h cuando el ensayo de co-cultivo se realiza bajo condiciones estándar de cultivo celular en un CO 2 incubadora (A y B) o en el modelo VDC con las condiciones microaeróbicas en el compartimiento apical (C y D). Todos los experimentos representan al menos tres réplicas biológicas realizadas por duplicado en cada experimento. Haz clic aquí para ver más grande la figura .
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Discussion
El uso de métodos de cultivo de células in vitro para estudiar las interacciones de patógenos bacterianos con células huésped es una técnica ampliamente utilizada en muchos laboratorios de investigación. Sin embargo, como estos ensayos de cultivo celular se realizan bajo condiciones aeróbicas, estos modelos in vitro pueden no representar con precisión el entorno in vivo en el que las interacciones huésped-patógeno se llevan a cabo. El ampliamente utilizado en modelos de infección in vitro son especialmente apropiado para el estudio de microaerofílico C. jejuni en comparación con otros patógenos entéricos que son anaerobios facultativos. Existe una gran confusión en la literatura en relación con los mecanismos de invasión de IECs humanos por C. jejuni 4,5. Sugerimos que la razón de los mecanismos de invasión son tan poco conocidos es porque los modelos in vitro utilizados en estos estudios no reflejan con exactitud la situación in vivo. El uso de ensayos de cultivo celular estándar, el nivelde C. jejuni invasión de IECs es siempre muy bajo 9. El desarrollo del modelo VDC fue nuestra respuesta a abordar esta cuestión.
Hemos establecido que dos líneas diferentes IEC se pueden mantener en el VDC con condiciones microaeróbicas a la superficie apical, sin efectos desfavorables observados durante un período de 24 horas 1. Un aumento dependiente del tiempo de los números de ambos interacción intracelular y C. bacterias de tipo salvaje cepa jejuni 11168H se observó después de cocultivo con células Caco-2 IECs en el VDC con condiciones microaeróbicas en el compartimiento apical 1. Estas observaciones se confirmaron adicionalmente usando una segunda línea de IEC (T84), así como una segunda C. jejuni cepa de tipo salvaje (81-176), indicando que no hay línea de células bacterianas o de los efectos específicos de la raza 1. Este aumento de los niveles de interacción bacteriana y la invasión dieron como resultado un aumento de la respuesta inmune, polarizado innata de la IECs 1. HigSe detectaron sus niveles de IL-8 después de cocultivo microaeróbica, lo que indica que el aumento de la exposición a las bacterias se corresponde con un aumento de la respuesta del huésped. Se detectaron niveles más altos de IL-8 en los sobrenadantes basolateral en comparación con los sobrenadantes apicales, lo que indica que la secreción de IL-8 por las IECs se produce predominantemente a partir de la superficie basolateral IEC. IL-8 es como un atrayente de neutrófilos, lo que sería de uso limitado en el lumen intestinal. Estos datos demuestran que la configuración de dos compartimentos de la VCC también permite la identificación eficiente de una respuesta del huésped polarizada.
Varias características relativas a la parte / configuración técnica del modelo VDC deben considerarse antes de aplicar el modelo para estudiar cualquier organismo patógeno. En primer lugar, los IECs deben ser cultivadas para formar una monocapa impermeable en filtros de 0,4 micras especiales. Esto toma entre 14-21 días dependiendo de la línea celular utilizada y hace que los experimentos bastante largas en comparación con clásica cocultuexperimentos anillo realizaron en placas de cultivo de células y el uso de los IEC cultivadas para entre 1-7 días. Por otro lado, sólo después de un largo período de crecimiento tales se han demostrado los IECs para formar una monocapa polarizada totalmente. Tales monocapas polarizadas imitan la situación in vivo en el epitelio intestinal humano mucho más estrechamente que las líneas de IEC, no confluentes no polarizados se utilizan en algunos estudios y, como tal, proporcionar otra ventaja del modelo de VCC. En segundo lugar, los filtros de 0,4 micras especiales son significativamente más caro que una placa de cultivo celular de 24 pocillos estándar. La principal limitación del VDC es el relativamente bajo rendimiento. Esto se debe principalmente a la disponibilidad de cámaras de VCC y la instalación que requiere el colector de gas. Sólo un número relativamente bajo de repeticiones paralelo se pueden realizar de una sola vez, en contraste con el método de cultivo celular clásica. Por tanto, el modelo de VDC es menos adecuado para experimentos de cribado a gran escala o experimentos que requieren un alto número de réplicastes. Otro factor a considerar es que el efecto de la gravedad de la realización de ensayos de cocultivo en el modelo V CC significa que las bacterias más tiempo comenzarán a agruparse en la parte inferior del compartimento apical resultando en la reducción oportunidad para las interacciones con la monocapa IEC. Sin embargo, utilizando el modelo de VCC, hemos demostrado que las interacciones de un no móviles, no agregante 11168H rpoN mutante dramáticamente se reducen en comparación con el móvil, la agregación de la cepa de tipo salvaje 11168H después de 6 horas 1. Actualmente estamos trabajando en modificaciones al modelo VDC que permitiría algo de mezcla en el compartimiento apical, que debería imitar más de cerca el peristaltismo en el lumen intestinal. Por lo tanto, mientras que el modelo de VCC es mejor que los métodos de cultivo celular, aeróbicos clásicos debido a la más estrechamente imita la situación in vivo, sobre todo para las bacterias tales como C. jejuni que tienen unos requisitos estrictos atmosféricas, el modelo VDC todavía tiene ciertas limitaciones que deben tenerseen cuenta en el diseño de experimentos.
Nuestros datos apoyan los hallazgos informados para un modelo de V CC similar utilizado para estudiar el patógeno gástrica por Helicobacter pylori humana, que mostró aumento de la adhesión bacteriana a las células huésped, aumento de la síntesis de factores de virulencia bacteriana, así como un aumento de la respuesta inmune del huésped innata cuando H. pylori se co-cultivaron con células epiteliales bajo microaerobia en comparación con las condiciones aeróbicas 11. Como ambos H. pylori y C. jejuni requiere condiciones microaeróbicas para el crecimiento, la constatación de que las condiciones microaeróbicas promover la interacción de los organismos con células huésped es sorprendente. Sin embargo, otro estudio utilizando un sistema VDC para analizar las interacciones de los anaerobio facultativo Escherichia coli enterohemorrágica con IECs demostró aumento de los niveles de interacción bacteriana en condiciones anaeróbicas cocultivo / microaerobia en el compartimento apical de 10 V CC. Tsu indica que el comportamiento de las bacterias que son capaces de proliferar en condiciones de oxígeno atmosféricos también se cambia cuando se co-cultivaron con IECs bajo condiciones anaeróbicas / microaeróbica. Esto sugiere que el modelo de VCC es un modelo mejorado y valiosa para el análisis de las interacciones huésped-patógeno de muchas bacterias patógenas diferentes en condiciones que se asemejan más fielmente la situación in vivo en el lumen intestinal en humanos.
Desde el punto de vista, el modelo VDC ha demostrado poseer algunas ventajas claras sobre aeróbica en C. jejuni modelos cocultivo-IEC in vitro. El entorno creado en el modelo de VCC imita más estrechamente el medio ambiente en el intestino humano durante C. infección jejuni, que conduce a un aumento altamente significativo en el número de bacterias que interactúan con e invadir los IECs. El modelo V CC en este formato actual es ideal para estudiar las interacciones de las bacterias entéricas con gástrica o intestinalcélulas epiteliales, pero no existe la posibilidad de adaptar el modelo VDC para el estudio de anaerobios estrictos a partir de muestras de heces o muestras microbiológicas orales, ya que sólo dos ejemplos. El principio importante debe ser siempre para apuntar para llevar a cabo estos experimentos de cocultivo en condiciones que más estrechamente imita la situación in vivo. El modelo VDC será una herramienta importante para futuros estudios de C. jejuni interacción huésped-patógeno y deben ser aplicables al estudio de los mecanismos patogénicos de muchas bacterias diferentes.
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Disclosures
No tenemos nada que revelar.
Acknowledgments
Dominic Mills fue apoyado por una Bloomsbury Colegios Beca de doctorado (2007-2010). Los autores desean dar las gracias a Ozan Gundogdu y Abdi Elmi por su ayuda en el desarrollo del modelo VDC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Speciality vertical diffusion system for use with Snapwell inserts | Harvard Apparatus | 66-0001 | Manifold & six Snapwell chambers |
| Caps | Harvard Apparatus | 66-0020 | |
| O-rings | Harvard Apparatus | 66-0007 | |
| Clamps | Harvard Apparatus | 66-0012 | |
| Snapwell filters (pore size 0.4 μm) | Corning Costar | 3407 | |
| Millicell ERS-2 Volt-Ohm resistance meter | Millipore | MERS00002 | |
| WPA Lightwave II spectrophotometer | Biochrom | 80-3003-72 |
References
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