Dette papir viser en original metode baseret på fjernbetjeningen aktivering af magnetiske partikler seedede i en bakteriel biofilm og udvikling af dedikerede magnetiske pincet til at måle in situ den lokale mekaniske egenskaber af den komplekse levende materiale bygget af mikroorganismer på grænseflader.
Bakteriel adhæsion og vækst på grænseflader føre til dannelse af tredimensionale heterogene strukturer såkaldte biofilm. Cellerne bolig i disse strukturer er holdt sammen af fysiske interaktioner medieret af et netværk af ekstracellulære polymere stoffer. Bakterielle biofilm påvirke mange menneskelige aktiviteter og forståelsen af deres egenskaber er afgørende for en bedre styring af deres udvikling – vedligeholdelse eller udryddelse – afhængig af deres skadelig eller gavnlig resultat. Dette papir beskriver en roman metode tager sigte på at måle in situ den lokale fysiske egenskaber af biofilm, der havde været, indtil nu, alene undersøges fra en makroskopisk og homogent materiale perspektiv. Den her beskrevne eksperiment involverer indførelse af magnetiske partikler i en voksende biofilm frø lokale prober, der kan fjernstyres aktiveres uden at forstyrre de strukturelle egenskaber af biofilmen. Dedikerede magnetiske pincet var developed at udøve en defineret kraft på hver partikel indlejret i biofilmen. Opsætningen er monteret på scenen af et mikroskop for at muliggøre registrering af time-lapse billeder af partikel-trækker periode. De partikelbaner ekstraheres derefter fra trække sekvens og de lokale viskoelastiske parametre afledt fra hver forskydningskurve partikel, hvorved der tilvejebringes 3D-rumlige fordeling af parametre. Opsamling indsigt i biofilmen mekanisk profil er afgørende fra en ingeniør synspunkt for biofilm kontrolformål, men også ud fra et grundlæggende perspektiv for at afklare forholdet mellem de arkitektoniske egenskaber og den specifikke biologi af disse strukturer.
Bakterielle biofilm er fællesskaber af bakterier forbundet med biologiske eller kunstige overflader 1-3. De udgør med en vedhæftning vækst mekanisme kombineret med produktionen af polysaccharid-rige ekstracellulære matrix, der beskytter og stabiliserer bygningsværk 4,5. Disse biofilm er ikke blot passive samlinger af celler fast på overflader, men organiseret og dynamiske komplekse biologiske systemer. Når bakterierne skifter fra planktoniske til biofilm livsstil, er ændringer i genekspression og celle fysiologi observeret samt øget antibiotikaresistens og vært immunforsvar bliver på oprindelsen af mange vedvarende og kroniske infektioner 6. Men kontrolleret udvikling af disse levende strukturer også tilbyde, muligheder for industrielle og miljømæssige applikationer, såsom bioremediering af farligt affald sites, bio-filtrering af industriel vand eller dannelse af bio-barrierer for at beskytte jord og grundvand fra contamination.
Mens molekylære karakteristika for biofilm livsstil i stigende grad beskrives de mekanismer, der driver udvikling af lokalsamfundet og vedholdenhed fortsat uklare. Brug de seneste fremskridt på mikroskala målinger ved hjælp scanning elektrokemisk eller fluorescens mikroskopi, har disse levende organisationer er blevet vist at udvise en betydelig strukturel, kemiske og biologiske heterogenitet 7. Men indtil nu, biofilm mekanik er hovedsagelig blevet undersøgt makroskopisk. For eksempel observation af biofilm streamers deformation som følge af variationer i fluidstrømningshastigheder 8,9 énakset komprimering af biofilm stykker løfter fra agar medium eller dyrkes på låget glider 10,11, forskydning af biofilm indsamlet fra miljøet og derefter overført til en parallel plade rheometer 12,13, atomic force spektroskopi ved hjælp af en glasperle og belagt med en bakteriel biofilm knyttet til en AFM cantilever 14 eller en dedikeret MICRocantilever metode til at måle trækstyrke løsrevne biofilm fragmenter 15,16 er blevet gennemført i løbet af de sidste ti år, hvilket giver nyttige oplysninger om viskoelastiske af materialets art 17. Men det lader til, sandsynligt, at oplysninger om in situ biofilm mekaniske egenskaber går tabt, når materialet er fjernet fra dets oprindelige miljø, som ofte var tilfældet i disse tilgange. Desuden behandling af biofilm som et homogent materiale misser oplysninger om mulige heterogenitet de fysiske egenskaber i samfundet. Derfor kan de nøjagtige konsekvenser af strukturen mekanik i biofilmdannelse og biologiske egenskaber såsom genekspression mønster eller kemiske gradienter næppe blive anerkendt. For at gøre fremskridt i retning af en mikroskala beskrivelse af biofilm fysiske egenskaber, er nye dedikerede værktøj.
Dette papir beskriver en original tilgang udtænkt til at opnåmåling af lokale mekaniske parametre in situ uden at forstyrre biofilmen og muliggør tegning af den rumlige fordeling af de mikroskala materialeegenskaber og derefter den mekaniske heterogenitet. Princippet i forsøget hviler på doping af en voksende biofilm med magnetiske mikropartikler efterfulgt af deres afsides pålæsning med magnetiske pincet i den modne biofilm. Partikel forskydning under kontrolleret magnetisk kraftpåvirkning afbildet under mikroskop muliggør lokal viskoelastiske parameter afledning, hver partikel rapporterer sin egen lokale miljø. Ud fra disse data kan 3D mekaniske profil biofilmen drages, afslørende rumlige og miljømæssig stand afhængigheder. Hele eksperimentet vil blive vist her på en E. coli biofilm fra en gensplejset stamme, som bærer en derepresseres F-lignende plasmid. Resultaterne er beskrevet i et nyligt papir 18 giver en unik vision af det indre af intakte biofilm mekanik.
Denne magnetisk partikel såning og trække eksperiment aktiveret in situ 3D kortlægning af viskoelastiske parametre for en voksende biofilm i sin oprindelige tilstand. Denne fremgangsmåde viste mekaniske heterogenitet af E. coli biofilm dyrkes her og gav spor at påpege de biofilm komponenter understøtter de biofilm fysiske egenskaber, hvilket kraftigt antyder en grundlæggende konsekvens af den ekstracellulære matrix og mere præcist dens grad af krydsbinding.
Anerken…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde var delvist støttet af tilskud fra Agence Nationale pour la Recherche, PIRIbio program Dynabiofilm og fra CNRS Tværfaglig Risk-program. Vi takker Philippe Thomen for hans kritisk læsning af manuskriptet og Christophe Beloin for at give E. coli-stamme, der anvendes i dette arbejde.
Table 1: Reagents and cells | ||||
Magnetic particles | Life technologies | 14307D | Micrometric magnetic particle, 2.8 µm diameter | |
Ampicillin (Antibiotic) | Sigma-Aldrich | A9518 | ||
Tetracycline (Antibiotic) | Sigma-Aldrich | 87128 | ||
Bacterial strain MG1655gfpF | UGB, Institut Pasteur, France | produces F pili at its surface, resistant to Ampicilllin and tetracycline | ||
Table 2: Capillaries and tubing | ||||
Filters for pediatric perfusion | Prodimed-Plastimed | 6932002 | ||
Hollow Square Capillaries | Composite Metal Scientific | 8280-100 | Manufactured in Borosilicate glass. Square 0.8mm x0.8mm | |
Tubing silicone peroxyde | VWR international | 228-0512 | Diameter 1mm | |
Tubing silicone peroxyde | VWR international | 228-0700 | Diameter 3mm | |
Table 3: Biofilm growth | ||||
Lysogeny Broth (LB) solution | Amresco-VWR | J106-10PK | standard medium used to grow bacteria | |
M63B1 solution | Home-made | Standard minimum medium used to grow bacteria | ||
Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Used to make M63B1 medium with 0.4% glucose | |
Table 4: Electronics | ||||
Camera EMCCD | Hamamatsu | C9100-02 | ||
Heater controller | World precision instruments | 300354 | ||
Function generator | Agilent technologies | 33210A | ||
Power amplifier | Home-made | It gives a current signal with amplitudes up to 4 A. | ||
Syringe pumps | Kd Scientific | KDS-220 | ||
Shutter | Vincent Associates | Uniblitz T132 | ||
Magnetic tweezers | Home-made | Two electromagnetic poles, each made of a copper coil with 2,120 turns of 0.56 mm in diameter copper wire and soft magnetic alloy cores (Supra50-Arcelor Mittal, France) square shaped according to the blueprint shown in Fig. 10. The two cores are mounted north pole facing south pole, in order to generate a magnetic force in one direction along the length of the capillary. See coil wiring details in Figure 11. | ||
Table 5: Optics | ||||
Inverted microscope | Nikon | TE-300 | ||
S Fluor x40 Objective (NA 0.9, WD0.3) | Nikon | This a long working distance ojective enabling observation of the biofilm in the depth | ||
Epifluorescence filters: 1) for green fluorescence: Exc 480/20 nm; DM 495; Em 510/20 2) for Red fluorescence: Exc 540/25 nm; DM 565; Em 605/55 | Chroma | 1)#49020 2)#31002 | Particle displacement upon force application is recorded using the red fluoresecnce filter block. | |
Table 6: Image analysis | ||||
ImageJ | NIH – particle tracker plugin |