Abstract
로 역행 라벨 망막 신경절 세포 (망막 신경절)이 사이트를 죽음에서 망막 신경절의 인 somata를 분리 할 수 있습니다, 그것은 망막 신경절의 생존과 재생 실험에서 망막 신경절을 계산위한 황금 표준이되었습니다. 많은 연구 시신경 손상 후 망막 신경절 생존 조회 포유류 동물에서 수행되었다. 몇 가지 다른 방법은 망막 신경절 세포 레이어 (RGCL)의 세포 수를 셀 수 있지만 그러나, 성인 zebrafish에있는 망막 신경절의 역행 라벨은 아직보고되지 않았습니다. 성인 zebrafish의 두개골의 작은 크기와 두개골에 드릴링 후에 사망 고위험 감안하면 산 - 에칭에 도움으로 두개골을 열고 크게 생존율을 향상시킬 수있는 광 경화성 본드로 구멍을 밀봉. 5 일 동안 염료를 흡수 한 후, 거의 모든 망막 신경절이 표시되어 있습니다. 이 방법은 시신경을 절개 할 필요가 없다, 그것은 성인 zebrafish에있는 시신경의 호감 후 망막 신경절 생존의 연구에 바꾸어 놓을 수없는 것입니다. 여기, 우리는 소개이 방법을 단계별로하고 대표적인 결과를 제공합니다.
Introduction
성인 제브라 피쉬가 계산하는 시신경 손상 1 일 이후 축삭을 재생 할 수있는 강력한 능력, 적절한 방법이으로 전체 망막 신경절은 망막 신경절의 생존과 재생 2을 평가하는 것이 필수적입니다. 포유 동물과 금붕어 3 역행 라벨 망막 신경절의 방법에 따라 - 5, 우리는 성인 제브라 피쉬의 tectum에서 망막 신경절 레이블을하는 방법을 건설했다. 성인 제브라 피쉬의 경우, 두 가지 중요한 기술적 인 문제는 주목해야한다 : 성인 제브라 피쉬의 두개골에는 6 개의 아주 작은; 그들은 물 환경에서 살고있다. 여기, 우리는 5 시추와 관련된 위험을 최소화 에칭액 두개골을 취급합니다. 다음, 우리는 수술 후 동물의 생존을 향상 광중합 결합으로 구멍을 밀봉.
이전에는 몇 가지 다른 기술은 간접 방법으로 망막 신경절의 수를 계산하기 위해 채택되었다. HE가 망막 부분에서 염색하면 RGCL 7 세포의 모든 종류의 라벨. 전체 R 항체 라벨링이러한 섬-1과 etina는 또한 무 축삭 세포 8 레이블을 지정할 수 있습니다. 시신경의 그루터기에서 역행 레이블이 망막에있는 망막 신경절 라벨을 할 수 있지만 그것은 시신경에 추가 부상의 원인이되기 때문에, 그것은 호감 모델에 채택 할 수 없습니다. tectum에서 역행 라벨을 활용, 우리는 시신경의 호감에서 망막 신경절의 생존과 재생을 연구했다. 결과는 거의 모든 망막 신경절이 살아 망막 신경절의 90 % 이상이 호감 모델 9의 첫 번째 주에 tectum에 재생 보여줍니다.
모두 성공적으로 망막 신경절 레이블을하기 위해, DII 페이스트는 여러 가지 다른 상업용 염료 (10)와 비교 후 선택되었다. 첫째, 특히 생체 조직 라벨링을 위해 설계되었습니다. 둘째, 물을 확산 할 수있는 친 유성 염료이다. 또한,이 형광은 망막 신경절 생존 연구를위한 훌륭한 후보하게 오랫동안 지속 할 수 있습니다.
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Protocol
1. 수술기구를 구축
참고 :시 및 작업, 드립 마취 솔루션 에틸 3 - 아미노 벤조 에이트 메탄 (MS-222, 또는 Tricaine) 물고기의 입을 통해 1 방울 / sec의 속도로 반 농도 (0.015 %)에서 후 물고기가 살아 남아 있도록하려면 그림 1 및 자작 물방울 시스템을 사용.
- 도 1a에 도시 된 바와 같이 상자 만들기 (길이 폭 높이 5 cm의 10 cm의 28 cm입니다), 중간 (길이 폭 9cm, 높이 4cm입니다 6 cm입니다) 스폰지를 넣어를 엽니 다 그것에 격차.
- 다음 물고기 입에 삽입됩니다 광중합 결합 (그림 1B)와 바늘의 끝 부분에 부드러운 구형 표면을 확인합니다. 바늘의 표면이 손상되는 물고기의 입을 방지하기 위해 부드러운 지 확인합니다.
- MS-222 (왼쪽 챔버, 길이 6 cm입니다의 절반 농도를 추가, 폭은 10 ℃이다m, 높이 8cm)와 그림 (c)에 도시 한 바와 같이 저수지에 식염수 (오른쪽 챔버, 길이, 높이 8 cm의 폭 10 cm의 4 cm입니다)입니다. 참고 : 신선한 MS-222을 추천합니다.
- 2 분 동안 0.03 % MS-222 물고기를 마취.
- 스펀지의 차이에 물고기를 놓고 가슴 지느러미 뒤에 각각 배설강 기공, 11 옆에 삽입 된 핀, 두 쌍의 물고기를 고정합니다.
- 도 1C에 나타낸 바와 같이 T 형 관 물고기의 입, MS-222와 용수를 연결한다.
- MS-222에 연결된 튜브를 켭니다.
오른쪽 Tectum 2. 역행 라벨 망막 신경절
참고 : 이전에 처음으로, 더 에탄올이 남아 있음을 보장 70~75% 에탄올로 모든 기기를 소독.
- Rossing : 조금 sclerectome 함께 전체 두개골 위에 피부를 제거 (두개골의 등쪽보기는도 2a 및도 2b에 도시
- 지우기 : 식염수로 두개골을 씻어 준 후 귀 세정 전구 말립니다.
- 초기 부식 : 10 초 동안 에칭과 두개골을 부식.
- 지우기 : 완전히 면봉으로 에칭을 닦아 후 식염수로 씻어 내고 건조.
- 보호 : 과잉 부식 오른쪽 tectum을 제외한 다른 지역에서 두개골을 보호하기 위해, 광 경화 결합으로이 분야를 커버하고 휴대용 광원과 푸른 빛에 노출을 치료.
- 완전 부식 : 2 분 완료 에칭 다시 오른쪽 tectum의 중심 지역에 에칭을 넣어. 참고 : 이전 물고기의 두개골은 석회화 때문에, 부식이 오래 걸립니다.
- 지우기 : 완전히 면봉으로 에칭을 닦아 후 식염수로 씻어 내고 다시 말린다.
- 두개골 오프닝 : 조심스럽게 오른쪽 tectum (그림 2D를 노출하는 집게와 malacic 두개골 (그림 2C)를 제거
- 지우기 : gelfoam의 조각 구멍에서 점액과 혈액 effusing 닦아 출혈이 멈출 때까지 생리 식염수로 씻어.
- 염료 위치 : 전체 바로 tectum에 염료 (조직 라벨 붙여 넣기)를 넣어 gelfoam로 커버.
- 분리하는 : 같은 동물에서 멸균 규모로 구멍을 커버합니다.
- 규모에 장소 빛 경화 결합을 한 후 40 초 동안 다시 푸른 빛으로 치료 : 바다 표범 어업.
- 리바이벌 : 채권의 표면을 세척하고 식염수로 동물을 부활.
- 간호 사육 : 5 일 동안 28.5 ° C 배아 매체 (ZFIN)에서 물고기를 유지하고 2 회 / 일 공급. 그 염료 실험에서 5 일 동안 tectum에서 숙박을 실패 물고기를 포함하지 마십시오. 참고 : 배아 매체 (EM) 솔루션은 물고기의 생존에 매우 중요하고 온도가 DII 라벨의 핵심 요소입니다.
3. Wholemounting 망막 및 이미징
- 망막하기 전에 2 시간 동안 어두운 분야에서 물고기를 놓고 누구lemount.
- 얼음 물과 물고기를 마취.
- 각막의 가장자리에 구멍을 찔린 금성 가위로 각막을 제거하여 아이 컵을 만든다.
- 렌즈를 제거하고 얼음처럼 차가운 1X PBS와 망막의 중심을 세척하십시오.
- 더 안료가 남아 있지 될 때까지 망막과 얼음처럼 차가운 1X PBS과 공막 사이의 간격을 세척합니다.
- 디스크에있는 시신경을 잘라.
- 위로 RGC 층을 유지하고 자체 제작 유리 숟가락 (그림 3a 및 3b)와 망막을 잡아. 드롭퍼는 망막을 전송하는 데 사용될 수있다.
- 위로 RGC 층 (그림 3C)와 슬라이드에 얼음 30 %의 글리세린이 저하 망막을 넣어.
- 글리세린을 분리 한 다음 네 개의 사분면 (그림 3D)으로 망막을 절단하기 전에 유리 슬라이드에 망막을 평평하게. RGC 층으로 전개 망막을 유지하는 것은 위쪽으로 망막을 평평하게하는 데 도움이 될 것입니다.
- t에 얼음 50 %의 글리세린 드립그는 안료의 조각을 씻어 망막.
- 글리세린을 제거하고 망막에 얼음 75 %의 글리세린의 20 μl를 놓습니다.
- 1.8 cm X 1.8 인치의 정사각형 커버 슬립으로 샘플을 커버.
- 매니큐어로 커버 슬립을 봉인. 망막의 즉각적인 영상을 권장합니다.
- 비 인터레이스 이미지 DP72 CCD (각 이미지는 1360 X 1024 픽셀)와 20 배의 대물 렌즈에서 전체 망막 (NA가 0.70 =). 각 필드는 세 가지 초점을 맞추고 있습니다.
- 소프트웨어의 "필드의 깊이를 확장"의 도구를 사용하여 각 필드의 깊이를 확장 할 수 있습니다.
- 바로 Photomerge의 기능을 가진 가상 망막을 조립합니다.
- 망막 신경절의 평균 밀도 (그림 4A)를 분석하는 망막의 각 방향으로 680 X 512 픽셀의 3 개의 필드 (실제 면적이 0.092 mm 2, 264 μm의 350 μm의 경우)를 선택합니다.
- 측정의 기능 영역을 구하는 - 이미지에 다각형 형상을 생성소프트웨어.
- 식으로 망막 신경절의 총 수를 계산 "망막 신경절 번호 = 운명의 X 영역"9.
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Representative Results
도 4B-D 쇼 같이, DII + 세포의 수는 RGCL 소재 DAPI + 세포의 3 분의 2이다. 정상적인 망막에서 전체 망막 (그림 4E)의 몽타주 이미지 DII + 망막 신경절이 중앙 지역에있는 망막 신경절이 그들의 목표에 다시 생성되지 않은으로 전체 망막에 있지만, 재생 된 망막 (그림 4 층)에 분포되어 있음을 보여줍니다 첫 주에, 그들은 표시 할 수 없습니다.
도 1. RGC의 역행 라벨에 사용 수술 장치. (A) (A) 물고기를 해결하기 위해 스펀지를 사용합니다. 운영 플랫폼 및 주입 튜브는 금속 바늘 (B)을 통해 연결되어 (길이 폭 높이 5 cm입니다 10cm이며, 28cm입니다.) 금속 바늘 여분의 물이 공동 (C)에 저장된다. (B) 근접. 바늘의 머리는 빛 경화 채권 (D)으로 싸여있다. (C) 저수지는 MS-222를 저장하는 데 사용 (전자, 길이, 높이 8 cm의 폭 10 cm의 6 cm입니다) 및 식염수 (F, 길이가 4된다 cm, 폭은 각각) 높이 8 cm의 10 cm입니다. 주입 관 (g)은 저장조 및 금속 바늘을 연결한다.
그림 2. 성인 제브라 피쉬의 두개골 지느러미보기. rossing 전 (A) 온전한 두개골. 황색 점선은 tectum을 표시; 빨간색 점선은 telencephalon을 표시; 와 녹색 점선은 소뇌를 표시합니다. (B)의 두개골을 제거 피부 후에. (C)에 천트와 부식 한 후, 두개골 malacic과 오목 영역은 집게 (흰색 *)로 지적되고있다. (D) 오른쪽 tectum이 노출 두개골이 제거 된 후. 규모는 500 & #입니다956, m.
그림 3. 망막을 wholemounting의 중요한 단계. 망막을 떠서에 대한 (A) 및 자작 유리 숟가락, 아래 이미지는 전체보기를 보여줍니다. (B) (점선으로 표시) "숟가락"와 망막을 잡아. (C) 얼음처럼 차가운 30 %의 글리세린에 망막을 수송한다. ( D 4) 등분 망막을 잘라; 화살표는 절단의 방향을 나타냅니다. 스케일 바 (A) 1mm; (BD) 500 μm의.
F igure 4. 가상 망막 계산 망막 신경절의 샘플링. (A) 망막의 구성도는 네 개의 필드 (N, D, V, T 필드)가 있고 각각에는흰색 상자에 표시되는 세 개의 필드. 시신경 유두는 일반적으로 복부 시간적 방향 (검은 점) 부근에 자리 잡고 있습니다 확인할 수 있습니다. (B) DII는 망막 신경절을 표시. 망막 신경절 및 핵의 (C) DAPI 표시 핵. (D) 합병 그림. 전체 망막의 (E) 몽타주 이미지 정상적인 제브라 피쉬의. (F) 시신경 손상 후 재생 된 망막을 보여주는 몽타주 이미지. 망막 신경절은 첫 주에 자신의 목표에 다시 생성되지 것처럼 망막의 중앙 지역에 레이블이 표시되지 않습니다. 요약 : N = 코, D = 지느러미, V = 복부, T = 시간. 스케일 바 : 30 μm의 (BD); 500 μm의 (E, F).
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Discussion
망막 신경절의 역행 라벨은 포유류 동물의 망막 신경절의 생존을 연구하는 것이 중요하지만, 제브라 피쉬에서 사용되지 않았습니다. 다른 방법은, 그가 7 염색 및 항체 염색 (8), 망막 신경절의 수를 계산 골드 표준, 표시된 모든 망막 신경절과 유전자 변형 라인하지 않는 것은 아직 12, 13을 구성되지 않았습니다. 이 비디오에서는, 우리는 성인 zebrafish의 망막에 라벨 망막 신경절을 역행하는 방법을 소개합니다. 축삭의 약 1 %가 후각 망울 또는 다른 지역 (14)에 투사하지만,이 방법은 망막에있는 거의 모든 망막 신경절에 레이블을 지정할 수 있습니다.
제브라 피쉬는 메스 절개 3 드릴 5, 15 성인 제브라 피쉬의 두개골을 열고, 부상을 부담하기에 너무 허약으로 사망의 원인이 될 수 있습니다. 에칭과 두개골을 부드럽게하는 것은 뇌의 손상을 최소화 할 수 있습니다. 광 경화 채권에 구멍을 밀봉하고 푸른 빛 아래에 고정하여,대부분의 물고기는 수술 후 생존. 그것은 단지 쥐와 다른 포유류 동물 5와 비교하여보다 편리하고 효율적이다, 실력 작업에서 수술을 수행하기 위해 12 ~ 15 분입니다.
DII 조직 라벨 붙이기는 친 유성 염료입니다. DII 결정 또는 농축액의 미세 주입에 비해,이 모두에서 표면 아래 축삭 레이블, 조직에 염료의 침투를 향상시킵니다. 또한, 형광은 긴 시간주기 (10) 동안 지속 할 수있다. 한편,이 염료는 수동적 운송 통로에 의해 흡수되므로 완전한 라벨링 적어도 5 일 동안 tectum에 염료를 남길 필요가있다.
제브라 피쉬는 시각적 재생의 훌륭한 모델 생물이다. 시신경의 호감 후 7 일에서, 거의 모든 망막 신경절은 tectum에 재생 축삭하지만 망막 신경절의 절반은 시신경 컷 모델 9에 다시 생성합니다. 이 방법은 RGC를 연구 할 수있는 이상적인 방법입니다시신경에 추가 부상을 방지 할 수 시신경의 호감, 이후의 생존과 재생.
우리는 성인 제브라 피쉬와 wholemount 망막에있는 망막 신경절의 수를 측정을 성공적으로 역행 라벨 망막 신경절에 대한 전체 프로토콜을 제시 하였다. 또한, 광 경화 결합을 사용하여, 우리는이 방법이 효과를 높일 수 제브라 피쉬의 생존율을 높일 수 있습니다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MS222 | Sigma Aldrich, USA | E10521 | |
| DiI | Invitrogen, USA | N22880 | |
| Light curing bond | Heraeus Kulzer, Germany | Durafill bond | |
| Gluma Etch | Heraeus Kulzer, Germany | Gluma Etch 35 Gel | |
| Blue LED | Shenruo Medical Equipment Co., China | Power Blue Light Curing Unit |
References
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