Retrograd Merking av retinal ganglion celler i voksen sebrafisk med fluorescerende fargestoffer

Abstract

Som retrograd merking retinal ganglion celler (RGCs) kan isolere RGCs somata fra å dø områder, har det blitt gullstandarden for telling RGCs i RGCs overlevelse og regenerering eksperimenter. Mange studier har blitt utført i pattedyr dyr til forskning RGCs overlevelse etter synsnerven skade. Men retrograd merking av RGCs i voksen sebrafisk har ennå ikke blitt rapportert, selv om noen alternative metoder kan telle celle tall i retinal ganglion cellelag (RGCL). Tatt i betraktning den lille størrelsen av den voksne sebrafisk skallen og den høye risikoen for død etter boring på skallen, vi åpner skallen med hjelp av syre-etsing og forsegle hullet med en lysherdingen obligasjon, som kunne gi en betydelig bedre overlevelse. Etter å absorbere fargestoffer for fem dager, er nesten alle RGCs merket. Denne metoden ikke så trenger ikke å skjære over synsnerven, er det uerstattelig i forskning av RGCs overlevelse etter synsnerven forelsket i voksen sebrafisk. Her introduserer videnne fremgangsmåten trinn for trinn og gir representative resultater.

Introduction

Som voksen sebrafisk har en sterk evne til å regenerere axons etter synsnerven skade ^en, en riktig metode for å telle hele RGCs er viktig å evaluere RGCs overlevelse og regenerering ^to. Basert på metoder for retrograde merking RGCs i pattedyr og gullfisk ^{3 - 5,} bygget vi metoden til å merke RGCs fra Tectum i voksen sebrafisk. For voksen sebrafisk, bør to kritiske tekniske bekymringer bemerkes: skallen av voksen sebrafisk er svært liten ^6; de lever i vann. Her behandler vi skallen med etsemiddel som minimerer farene forbundet med boring ^fem. Så, vi forsegle hullet med lysherdingen obligasjon som forbedrer dyr overlevelse etter operasjonen.

Tidligere ble flere andre teknikker vedtatt å telle RGCs nummer i indirekte måter. HE flekker på netthinnen seksjoner merker alle typer celler i RGCL ^7. Antistoff merking i hele retina, slik som holme-1, kan også merkes amacrine celler ^8. Selv om retrograd etiketten fra synsnerven stubben kan merke alle RGCs i netthinnen, kan det ikke bli vedtatt i trengselen modellen fordi det fører til ekstra skade på synsnerven. Benytte seg av retrograd etiketten fra Tectum, har vi forsket RGCs overlevelse og regenerering i synsnerven knuse. Resultatene viser at nesten alle RGCs levde og over 90% av RGCs regenereres til Tectum ved den første uke i knusemodellen ^9..

For å kunne merke alle RGCs, ble DII lime valgt etter sammenligning med flere andre kommersielle fargestoffer ^10. For det første, er det særlig beregnet for in vivo vev merking. For det andre er det et lipofilt fargestoff som ikke kan diffundere i vann. I tillegg kan denne fluorescens vedvare i lang tid som gjør det til et utmerket kandidat for RGCs overlevelse forskning.

Protocol

En. Konstruer Kirurgi Apparatus

NB: For å sikre at fisken forblir levende under og etter operasjonen, dryppe anestesi løsning etyl-3-aminobenzoat metansulfonat (MS-222, eller Tricaine) ved en halv konsentrasjon (0,015%) med en hastighet av en dråpe / sek gjennom fiskens munn ved hjelp av en homebuilt dryppsystemet vist i figur 1.

1. Lag en boks som vist i figur 1A (lengde er 28 cm, bredden er 10 cm, høyden er 5 cm), sette en svamp (lengde er 6 cm, bredden er 9 cm, høyden er 4 cm) i midten og åpne en gap på den.
2. Foreta en glatt kuleflate på enden av nålen med lysherding bindingen (figur 1B) som deretter vil bli satt inn i fiskens munn. Kontroller at overflaten av nålen er glatt for å hindre fiskens munn fra å bli skadet.
3. Tilsett halvparten konsentrasjonen av MS-222 (venstre kammer, er lengde 6 cm, bredde 10 cm, i høyde 8 cm) og saltvann (høyre kammer, i lengde 4 cm, bredde er 10 cm, høyde på 8 cm) til magasinene, som vist i figur 1C. Merk: Fresh MS-222 anbefales.
4. Bedøve fisk i 0,03% MS-222 i 2 min.
5. Legg fisken i gapet av svampen og fikse fisken med to par pinner, satt inn bak brystfinnen og ved siden av cloacal pore, henholdsvis ^11.
6. Koble fiskens munn, MS-222, og stell vann med et T-type rør som vist i figur 1C.
7. Slå på røret som er koblet til MS-222.

2. Retrograde Etikett RGCs fra Høyre Tectum

MERK: Før begynnelsen, desinfisere alle apparater med 70-75% etanol, noe som sikrer at ingen etanol gjenstår.

1. Rossing: lett fjerne huden over hele skallen med sclerectome (dorsal visning av skallen er vist i figur 2A og 2B
2. Clearing: Vask skallen med saltvannsoppløsning og deretter tørke det med øret vask pære.
3. Initial korrosjon: korrodere skallen med etchant for 10 sek.
4. Clearing: fullstendig tørke bort etchant med en bomullspinne og deretter vaske området med saltvann og tørk den.
5. Beskyttelse: For å beskytte skallen på andre områder utenom høyre Tectum fra overflødig korrosjon, dekke disse områdene med lys herding obligasjon og deretter kurere det ved eksponering for blått lys med bærbar illuminant.
6. Komplett korrosjon: sette etchant i det sentrale området av retten Tectum igjen for fullstendig etsing i 2 min. Merk: Siden hodeskaller av eldre fisk er forkalket, vil korrosjon ta lengre tid.
7. Clearing: fullstendig tørke bort etchant med en bomullspinne og deretter vaske området med saltvann og tørk den på nytt.
8. Skull åpningen: Fjern forsiktig malacic skallen (figur 2C) med tang for å eksponere riktig Tectum (figur 2D
9. Clearing: Tørk slim og blod strømmende fra hullet med biter av gelfoam og vaske det med saltvann til blødningen har stoppet.
10. Dye plassering: sette fargestoff (vev-merking lim inn) på hele høyre Tectum og dekke den med gelfoam.
11. Segregerende: dekke hullet med en steril skala fra samme dyr.
12. Tetting: sted lysherdingen obligasjon på vekten og deretter kurere det med blått lys igjen for 40 sek.
13. Vekkelse: vaske overflaten av bindingen og gjenopplive dyret med saltvann.
14. Pleie-og avl: Hold fisken i 28,5 ° C embryo medium (ZFIN) for fem dager og mate to ganger / dag. Ikke ta med fisk som fargestoff ikke klarer å bo i Tectum for fem dager i forsøket. Merk: Embryo medium (EM) løsningen er viktig for overlevelse av fisk og temperatur er den avgjørende faktoren for DII merking.

Tre. Wholemounting Retina-og Imaging

1. Legg fisken i et mørkt felt i 2 timer før retina somlemount.
2. Anesthetize fisken med isvann.
3. Punktering et hull i margen av hornhinnen og gjør et øye cup ved å fjerne hornhinnen med venus saks.
4. Ta linsen, og deretter skylle sentrum av retina med iskald 1 x PBS.
5. Skyll gapet mellom netthinnen og sclera med iskald 1x PBS inntil ingen pigment som er igjen.
6. Skjær synsnerven på platen.
7. Hold RGC lag oppover og hold hinnen med en selvlaget glass skje (Tall 3A og 3B). En dråpe kan også brukes til å overføre retina.
8. Sett netthinnen i en dråpe isete 30% glyserin på et lysbilde med RGC lag oppover (Figur 3C).
9. Fjern glyserin og deretter flate netthinnen på glasset lysbildet før du skjærer hinnen inn i fire kvadranter (Figur 3D). Holde hinnen utfoldet med RGC lag oppover vil være nyttig for flatere netthinnen.
10. Drypp isete 50% glyserin på than Retina å vaske bort rester av pigment.
11. Fjern glyserin og deretter slippe 20fil isete 75% glyserin på netthinnen.
12. Dekk prøven med en 1,8 cm x 1,8 cm firkantet dekkglass.
13. Tett dekkglass med neglelakk. Umiddelbar avbildning av netthinnen er anbefalt.
14. Non-interlace bildet hele netthinnen under en 20X objekt objektiv (NA = 0,70) med DP72 CCD (hvert bilde er 1360 x 1024 piksler). Hvert felt har tre ulike fokus.
15. Utvid dybden på hvert felt med verktøyet av "utvidet dybdeskarphet" i programvaren.
16. Sett sammen et virtuelt netthinnen med funksjonen til Photomerge.
17. Velg tre feltene i 680 x 512 piksler (aktuelle området er 350 mikrometer ved 264 mikrometer, 0,092 mm ²⁾ i hver retning på netthinnen til å analysere gjennomsnittlig tetthet på RGCs (Figur 4A).
18. Skaff området med funksjonen til målinger - opprette et polygon funksjon i bildetprogramvare.
19. Beregn det totale antall RGCs ved ligningen "RGCs nummer = skjebne x område" ^9.

Representative Results

Som figur 4B-D show, antall Dii ⁺ celler er to tredjedeler av DAPI ⁺ celler i RGCL. I en normal netthinnen, viser en montasje-bilde av en hel netthinnen (figur 4E) som Dii ⁺ RGCs fordeles over hele netthinnen, men i en regenerert retina (figur 4F), som RGCs i det sentrale området ikke regenereres til deres mål på den første uken, de kunne ikke merkes.

Figur 1. Operasjonen apparat som brukes til retrograd merking av RGC. (A) Bruk en svamp (a) for å fikse fisken. Driftsplattform (lengde er 28 cm, bredden er 10 cm, høyden er 5 cm) og infusjonsrør er koblet via et metall nål (b). Overflødig vann er lagret i hulrommet (c). (B) Et nærbilde til metallnålen. Nålen hode er pakket med lysherding bindingen (d). (C)-reservoarene er brukt til oppbevaring av MS-222 (e, i lengde 6 cm, bredden er 10 cm, høyde på 8 cm) og saltvann (f, lengden er fire cm, bredde 10 cm, høyde er 8 cm), henholdsvis. Infusjonsrøret (g) forbinder reservoaret og metall-nålen.

Figur 2. Dorsal visning av skallen av voksen sebrafisk. (A) Intakt skallen før Rossing. Den gule stiplede linjen markerer Tectum; den røde stiplede linjen markerer telencephalon; og den grønne stiplede linjen markerer lillehjernen. (B) Skull etter hud fjernes. (C) Etter korrosjon med fosforsyre, som er skallen malacic og en konkav området er påpekt av tang (hvit *). (D) Høyre Tectum er utsatt etter skallen er fjernet. Scale er 500 & #956; m.

Figur 3. Viktige skritt av wholemounting netthinnen. (A) homebuilt glass skjeen for scooping netthinnen, viser nederste bilde hele visningen. (B) Hold netthinnen med "skje" (markert med stiplet linje). (C) Transporter hinnen inn iskald 30% glyserin. ( D) Skjær netthinnen i 4/4; pil viser retningen på skjæring. Scale barer (A) 1 mm; (BD) 500 mikrometer.

F igure 4 Prøvetaking av RGCs telling i virtuelle netthinnen.. (A) Skjematisk oversikt over netthinnen har fire felt (N, D, V, T felt), og hver av dem hartre felt som er vist i en hvit boks. Legg merke til den optiske platen er vanligvis plassert på ventral-temporal orientering (svart prikk). (B) DII merket RGCs. (C) DAPI merket nucleus. (D) Fusjonert bilde av RGCs og kjernen. (E) Montage bilde av hele netthinnen i normal sebrafisk. (F) Montage bilde som viser regenerert netthinnen etter synsnerven skade. Det sentrale området av netthinnen ikke er merket som RGCs ikke regenereres til deres mål på den første uken. Forkortelser: N = nasal, D = rygg, V = ventral, T = tidsmessig. Scale barer: 30 mikrometer (BD); 500 mikrometer (E, F).

Discussion

Retrograd merking av RGCs er viktig å forske RGCs overlevelse i pattedyr dyr, men det har ikke vært brukt i sebrafisk. De alternative metoder, HE farging ⁷ og antistoffarging ^8, er ikke gull standarder for telling RGCs nummer, og transgene linjer med alle RGCs merket har ennå ikke blitt bygget ^{12, 13.} I denne videoen, introduserer vi en metode for å retrograde label RGCs i netthinnen i voksen sebrafisk. Selv om 1% av axons prosjektet til luktelappen eller andre områder ^14, kan denne metoden merke nesten alle RGCs i netthinnen.

Som sebrafisk er for skjøre til å bære den fysiske skaden, åpner skallen av voksen sebrafisk med skalpell snitt ^tre eller en drill ^{5 15.} kan føre til døden. Nedtoningen skallen med etchant kan minimere skader på hjernen. Ved å tette hullet med en lett herding obligasjon og feste det under blått lys,de fleste fisk overlever etter operasjonen. Det tar bare 12 til 15 minutter å utføre operasjonen i henhold dyktig drift, noe som er mer praktisk og effektivt sammenlignet med rotter og andre pattedyr ⁵ dyr.

DII vev-merking pasta er en lipofil fargestoff. Sammenlignet med Dii krystaller eller mikroinjeksjon av konsentrerte løsninger, forbedrer denne inntrengning av fargestoffet i vevet, merking axoner både på og under overflaten. I tillegg kan fluorescensen vedvare i lang tidsperiode ^10. På den annen side er dette fargestoff absorberes ved passiv transport-bane, slik at det er nødvendig å forlate fargestoff i Tectum i minst 5 dager for fullstendig merking.

Sebrafisk er en utmerket modell organisme av visuell regenerering. På 7 dager etter synsnerven knuse, nesten alle RGCs Axon regenerere til Tectum, men bare halvparten av RGCs regenerere i synsnerven cut modell ^9. Denne metoden er en ideell måte å forske RGCs overlevelse og regenerering etter synsnerven forelsket, noe som kunne unngå ekstra skade på synsnerven.

Vi har presentert en hel protokoll for vellykket retrograd merking RGCs i voksen sebrafisk og måle RGCs nummer i en wholemount netthinnen. I tillegg, ved bruk av en lysherdende binding, øker vi overlevelse av sebrafisk, noe som gjør denne fremgangsmåten mer effektiv.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
MS222	Sigma Aldrich, USA	E10521
DiI	Invitrogen, USA	N22880
Light curing bond	Heraeus Kulzer, Germany	Durafill bond
Gluma Etch	Heraeus Kulzer, Germany	Gluma Etch 35 Gel
Blue LED	Shenruo Medical Equipment Co., China	Power Blue Light Curing Unit