Abstract
Olarak retrograd etiketleme retina ganglion hücrelerinin (RGCs) siteleri ölüyor RGCs somata izole olabilir, bu RGCs hayatta kalma ve rejenerasyon deneylerde RGCs sayma için altın standart haline gelmiştir. Birçok çalışma, optik sinir yaralanmasından sonra RGCs hayatta aratmak için memeli hayvanlarda yapılmıştır. Bazı alternatif yöntemler retina ganglion hücre tabakası (RGCL) hücre sayıları saymak olsa Ancak, yetişkin zebrabalıkları RGCs retrograd etiketleme henüz rapor edilmemiştir. Yetişkin zebrabalıkları kafatasının küçük boyutu ve kafatası üzerinde sondaj sonrası ölüm riski yüksek göz önüne alındığında, biz asit gravür yardımıyla kafatası açık ve önemli ölçüde hayatta kalma oranını getirebileceği bir ışık kür bağ ile delik mühür. 5 gün için boyalar emici sonra, hemen hemen tüm RGCs etiketlenir. Bu yöntem, optik sinir transect gerekmez gibi, yetişkin zebrabalıkları optik sinir ezmek sonra RGCs hayatta araştırma yeri doldurulamaz. Burada, biz tanıtmakBu yöntem, adım adım ve temsili sonuçları sağlar.
Introduction
Yetişkin zebrabalıkları saymak optik sinir hasarı sonrası 1 aksonlar yeniden güçlü bir yeteneği, uygun bir yöntemi var gibi bütün RGCs RGCs yaşam ve yenilenme 2 değerlendirilmesi esastır. Memeli ve akvaryum balığı 3'te retrograd etiketleme RGCs yöntemlere dayalı - 5, biz yetişkin zebrabalıkları TECTUM gelen RGCs etiketlemek yöntemini inşa. Yetişkin Zebra balığı için, iki kritik teknik endişeler dikkat edilmelidir: yetişkin zebrafish kafatası 6 çok küçük; onlar su ortamında yaşıyoruz. Burada, 5 sondaj ile ilişkili tehlikeleri en aza indirir yanığı ile kafatası tedavi. Sonra, biz ameliyattan sonra hayvan yaşamını geliştirir ışık kür bağı ile delik mühür.
Daha önce, diğer bazı teknikler dolaylı yollarla RGCs saymak kabul edildi. HE retina bölümleri boyama RGCL 7 hücrelerinin her türlü etiketler. Bütün r Antikor etiketlemeBöyle adacık-1 gibi etina, ayrıca amacrine hücreleri 8. etiketleyebilirsiniz. Optik sinir güdük retrograd etiket retinada tüm RGCs etiketleyebilirsiniz olsa da optik sinir ekstra yaralanmasına neden olduğundan, bu ezilme modelinde kabul edilemez. TECTUM gelen retrograd etiket yararlanarak, optik sinir ezilme RGCs yaşam ve yenilenme araştırdım. Sonuçlar hemen hemen tüm RGCs hayatta ve RGCs% 90 üzerinde ezilme modelinde 9 ilk hafta TECTUM rejenere olduğunu göstermektedir.
Başarıyla RGCs etiket için, DII macun birçok ticari boyalarda 10 ile karşılaştırılmasından sonra seçildi. İlk olarak, özellikle in vivo doku etiketleme için tasarlanmıştır. İkinci olarak, bu su içinde yaygın olmayan bir lipofilik boyadır. Ayrıca, bu floresan o RGCs hayatta kalma araştırma için mükemmel bir aday yapar uzun süre devam edebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Cerrahi Aparatı Construct
Not: esnasında ve işlem, damla anestezi çözelti etil 3-aminobenzoat metansülfonat (MS-222, ya da Tricaine) balığın ağız yoluyla 1 damla / sn 'lik bir hız ile bir buçuk konsantrasyonunun (% 0.015) ile sonra balık canlı kalmasını sağlamak için, Şekil 1 'de gösterilen bir homebuilt damlama sistemi kullanılarak.
- Şekil 1A gösterildiği gibi bir kutu yapmak (uzunluk x genişlik yüksekliği 5 cm, 10 cm, 28 cm), orta (uzunluk genişlik 9 cm, yüksekliği 4 cm olduğunu, 6 cm) bir sünger koymak ve bir açın Üzerinde boşluk.
- Daha sonra balık ağız içine sokulacaktır ışık sertleştirme bağ (Şekil 1B) ile iğnenin ucunda düz bir küresel yüzey olun. Iğne yüzeyinin hasar görmesini balığın ağzını önlemek için yumuşak olduğundan emin olun.
- MS-222 (sol bölme, uzunluk 6 cm olan yarı konsantrasyonu ekleme, genişlik 10 cm, yükseklik 8 cm) ve Şekil 1C 'de gösterildiği gibi rezervuar salin (sağ odası, uzunluk yüksekliği 8 cm, genişliği 10 cm olan, 4 cm)' dir. Not: Taze MS-222 önerilir.
- 2 dakika boyunca% 0.03 MS-222 balık anestezisi.
- Süngerin boşluğundaki balık yerleştirin ve göğüs yüzgeç arkasında ve sırasıyla Kloak gözenek, 11 yanına yerleştirilen iki çift pim ile balık sabitleyin.
- Şekil 1C 'de gösterildiği gibi, bir T tipi tüp ile ağız balığın, MS-222, ve yetiştirme su bağlayın.
- MS-222 bağlı tüp açın.
Sağ TECTUM 2. Retrograd Etiket RGCs
NOT: Ön başına, hiçbir etanol kalmasını sağlayarak,% 70-75 etanol ile tüm cihazları dezenfekte.
- Rossing: hafif sclerectome ile bütün kafatası üzerinde cilt kaldırmak (kafatası dorsal görünüşüdür Şekil 2A ve 2B'de gösterilmiştir
- Takas: tuzlu su ile kafatası yıkayın ve sonra kulak yıkama ampul ile kurulayın.
- İlk korozyon: 10 saniye boyunca yanığı ile kafatası zarar.
- Takas: tamamen pamuklu çubukla pürüzlendirici silin ve daha sonra tuzlu su ile yıkayın ve kurulayın.
- Koruma: Aşırı korozyona doğru TECTUM dışında diğer alanlarda kafatası korumak için, ışıkla sertleşen bağ ile bu alanları kapsayacak ve daha sonra taşınabilir aydınlatıcı ile mavi ışığa maruz kalma ile onu tedavi.
- Komple korozyon: 2 dakika için tam bir aşındırma için tekrar doğru TECTUM merkezi alanında pürüzlendirici koydu. Not: Büyük balık kafatasları kalsifiye olduğundan, korozyon daha uzun sürer.
- Takas: tamamen pamuklu çubukla pürüzlendirici silin ve daha sonra tuzlu su ile yıkayın ve tekrar kurutun.
- Kafatası açılış: dikkatle sağ TECTUM (Şekil 2D açığa forseps ile malacic kafatası (Şekil 2C) kaldırmak
- Takas: gelfoam adet delikten mukus ve kan taşmayı silin ve kanama durana kadar tuzlu su ile yıkayın.
- Boya yerleştirme: tüm sağ TECTUM üzerine boya (doku-etiketleme yapıştır) koymak ve gelfoam ile örtün.
- Ayrılan: aynı hayvandan steril bir ölçek ile deliği kapsamaktadır.
- Tartının üzerine yer ışık kür bağ ve daha sonra 40 saniye için tekrar mavi ışık ile tedavi: Sızdırmazlık.
- Revival: bağının yüzeyini yıkamak ve tuzlu su ile hayvan canlandırmak.
- Hemşirelik ve ıslah: 5 gün boyunca 28.5 ° C embriyo orta (ZFIN) olarak balık tutun ve 2 kez / gün besleme. Kimin boya deneyde 5 gün boyunca TECTUM kalmak için başarısız balık dahil etmeyin. Not: Embriyo orta (EM) çözümü balık hayatta kalmak için hayati önem taşıyan ve sıcaklık DiI etiketleme için önemli bir faktördür.
3.. Wholemounting Retina ve Görüntüleme
- Retina önce 2 saat için karanlık bir alanda balık yerleştirin olanlemount.
- Buzlu su ile balık anestezisi.
- Kornea marjı bir delik delinerek ve Venus makas ile kornea kaldırarak göz fincan olun.
- Lens çıkarın ve sonra buz gibi soğuk 1x PBS ile retinanın merkezini yıkayın.
- Herhangi bir pigment kalana kadar, retina ve buz gibi soğuk 1 x PBS ile sklera arasındaki boşluğu yıkayın.
- Diskte optik sinir kesti.
- Yukarı RGC katmanı tutmak ve bir self-made cam kaşık (Şekil 3A ve 3B) ile retina tutun. Bir asma teli aynı zamanda retinayı transfer etmek için kullanılabilir.
- Yukarı RGC tabakası (Şekil 3C) ile bir slayt buzlu% 30 gliserin, bir damla retina koydu.
- Gliserin çıkarın ve sonra dört parçaya (Şekil 3D) içine retina kesmeden önce cam slayt retina düzleştirmek. RGC tabakası ile gelişeceğini retina tutarak yukarı retina düzleştirme için yararlı olacaktır.
- T buzlu% 50 gliserin damlao pigment parçaları silsin retina.
- Gliserin çıkarın ve sonra retina üzerinde buzlu% 75 gliserin 20 ul bırakın.
- 1.8 cm x 1.8 cm kare lamel ile örnek örtün.
- Tırnak cilası ile lamel mühür. Retinanın anında görüntüleme önerilir.
- Sigara aralıklı resim dp72 CCD (her görüntü 1360 x 1024 piksel) ile 20X nesne mercek altında bütün retina (NA 0,70 =). Her alan üç farklı odak vardır.
- Yazılım "alanında genişletilmiş derinlik" aracı ile her alanın derinliğini genişletin.
- Photomerge fonksiyonu ile sanal retina birleştirin.
- RGCs ortalama yoğunluğu (Şekil 4A) analiz etmek için retinanın her yönde 680 x 512 piksel üç alan (gerçek alan 0.092 mm 2, 264 mikron ile 350 mikron) seçin.
- Ölçümlerin fonksiyonu ile alan elde - görüntüde bir çokgen özellik oluşturmakyazılım.
- Denklemle RGCs toplam sayısını hesaplayın "RGCs sayısı = kader x alanı" 9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekiller 4B-D gösterdiği gibi, DII + hücrelerinin sayısı in RGCL DAPI + hücrelerinin üçte ikisi. Normal bir retina olarak, bir bütün retina (Şekil 4E) bir montaj resmi DII + RGCs orta bölgesinde RGCs kendi hedef olarak yeniden gibi tüm retina üzerinde olan, ancak bir rejenere retina (Şekil 4F), dağıtılır olduğunu göstermektedir İlk hafta, onlar etiketli olamazdı.
Şekil 1. RGC retrograd etiketlenmesi için kullanılan cerrahi cihaz. (A) (a) balık düzeltmek için bir sünger kullanın. Çalışma platformu ve infüzyon tüpü, metal iğne (b) üzerinden bağlanır (uzunluk x genişlik yükseklik 5 cm olan 10 cm olan, 28 cm.) Metal iğne fazla su boşluğun (c) 'de depolanır. (B) bir yakın çekim. İğnenin baş hafif kür bağ (d) ile sarılır. (C) rezervuarlar MS-222 saklamak için kullanılan (e, boy yüksekliği 8 cm, genişliği 10 cm, 6 cm) ve tuz (f, uzunluğu 4 olan cm, genişlik sırasıyla) yüksekliği 8 cm, 10 cm. Enfüzyon boru (g) rezervuarı ve metal iğne bağlanır.
Şekil 2.. Yetişkin zebrafish kafatasının dorsal görünümü. Rossing önce (A) Sağlam kafatası. Sarı noktalı çizgi TECTUM işaretleri; kırmızı noktalı çizgi telencephalon işaretleri; ve yeşil noktalı çizgi beyincik işaretler. (B) Kafatası çıkarıldı deri sonra. (C) yanığı ile korozyona sonra, kafatası malacic ve bir içbükey alanı forseps (beyaz *) ile işaret edilir. (D) Sağ TECTUM maruz kafatası kaldırıldıktan sonra. Ölçek 500 & # olduğu956, m.
Şekil 3.. Retina wholemounting Anahtar adımlar. Retinayı karıştırıyordu için (A) Homebuilt cam kaşık, alt görüntü bütün görünümünü gösterir. (B) (noktalı çizgi ile işaretlenmiş) "kaşık" ile retina tutun. (C) buz-soğuk% 30 gliserin içine retina taşıyın. ( D) 4 çeyrek içine retina kesin; bir ok yönünü gösterir. Ölçek çubukları (A) 1 mm; (BD) 500 mikron.
F ŞEKIL 4. Sanal retinada sayma RGCs örnekleme. (A) retina şematik görünüşüdür dört alan (N, D, V, T alan) sahiptir ve bunların her birisibeyaz kutu içinde gösterilir üç alanlar. Optik disk genellikle ventral-zamansal yönlendirme (siyah nokta) yer almaktadır dikkat edin. (B) DiI RGCs etiketli. RGCs ve çekirdeğin (C) DAPI etiketli çekirdeği. (D) Birleştirildi resim. Bütün retina (E) Montaj resim Normal Zebrafish. (F), optik sinir hasarı sonrası rejenere retina gösteren Montaj görüntü. RGCs ilk haftasında kendi hedeflerine rejenere değil gibi retinanın merkezi alanı, etiketli değildir. Kısaltmalar: N = burun, D = dorsal, V = ventral, T = zamansal. Ölçek çubukları: 30 mikron (BD); 500 um (E, F).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
RGCs retrograd etiketleme memeli hayvanlarda RGCs hayatta araştırma önemlidir, ancak zebrabalıkları kullanılmamıştır. Alternatif yöntemler, HE 7, boyama ve antikor boyama 8, RGCs sayısını saymak için altın standart ve etiketlenmiş tüm RGCs ile transjenik olmayan ama 12, 13, inşa edilmemiştir. Bu videoda, biz yetişkin zebrafish retinada etiket RGCs retrograd bir yöntemi tanıtmak. Akson yaklaşık% 1 koku ampul veya diğer alanların 14 çıkıntı olsa da, bu yöntem, hemen hemen tüm retinada RGCs etiket olabilir.
Zebra balığı neşter kesi 3 ya da matkap 5, 15 yetişkin zebrafish kafatasını açmadan, fiziksel yaralanma ayı çok kırılgan olduğu gibi ölüme neden olabilir. Yanığı ile kafatası yumuşatma beyin hasarı en aza indirebilirsiniz. Hafif bir kür bağı ile delik sızdırmazlık ve mavi ışık altında sabitlemekEn çok balık ameliyattan sonra hayatta. Bu sadece sıçan ve diğer memeli hayvanlar 5 ile karşılaştırıldığında daha uygun ve etkili olduğu, uzman operasyon kapsamında ameliyatı gerçekleştirmek için 12-15 dakika sürer.
DII dokuya etiket yapıştırma lipofilik bir boyadır. DII kristaller ya da konsantre edilmiş çözeltilerin mikroenjeksiyon ile karşılaştırıldığında, bu iki ve yüzeyin altında aksonlar etiketleme, dokuya boyanın penetrasyonu artırır. Ayrıca, floresan uzun bir süre 10 devam edebilir. Öte yandan, bu boya pasif taşıma yolu ile emilir, bu nedenle tam bir etiketleme için, en az 5 gün için TECTUM içindeki boya bırakmak gerekli olmasıdır.
Zebra balığı görsel yenilenme mükemmel bir model organizmadır. Optik sinir ezmek sonra 7 gün, hemen hemen tüm RGCs TECTUM için yeniden akson, ancak RGCs sadece yarısı optik sinir kesme modelinde 9 yeniden. Bu yöntem RGC araştırma için ideal bir yolduroptik sinir ekstra yaralanmaları önlemek olabilir optik sinir ezmek, sonra s hayatta kalma ve yenilenme.
Biz yetişkin Zebra balığı ve bir wholemount retinada RGCs sayısını ölçen başarıyla retrograd etiketleme RGCs için tam bir protokol sundu. Ayrıca, hafif bir sertleşme bağ kullanarak, bu yöntemin daha etkili hale zebrafish hayatta kalma oranını artırmak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MS222 | Sigma Aldrich, USA | E10521 | |
| DiI | Invitrogen, USA | N22880 | |
| Light curing bond | Heraeus Kulzer, Germany | Durafill bond | |
| Gluma Etch | Heraeus Kulzer, Germany | Gluma Etch 35 Gel | |
| Blue LED | Shenruo Medical Equipment Co., China | Power Blue Light Curing Unit |
References
- Wyatt, C., et al. Analysis of the astray/robo2 zebrafish mutant reveals that degenerating tracts do not provide strong guidance cues for regenerating optic axons. J Neurosci. 30, 13838-13849 (2010).
- Grieshaber, P., Lagreze, W. A., Noack, C., Boehringer, D., Biermann, J. Staining of fluorogold-prelabeled retinal ganglion cells with calcein-AM: A new method for assessing cell vitality. J Neurosci Methods. 192, 233-239 (2010).
- Schwalb, J. M., et al. Two factors secreted by the goldfish optic nerve induce retinal ganglion cells to regenerate axons in culture. J Neurosci. 15, 5514-5525 (1995).
- Watanabe, M., Inukai, N., Fukuda, Y. Survival of retinal ganglion cells after transection of the optic nerve in adult cats: a quantitative study within two weeks. Vis Neurosci. 18, 137-145 (2001).
- Chiu, K., Lau, W. M., Yeung, S. C., Chang, R. C., So, K. F. Retrograde labeling of retinal ganglion cells by application of fluoro-gold on the surface of superior colliculus. J Vis Exp. , (2008).
- Bakken, T. E., Stevens, C. F. Visual system scaling in teleost fish. J Comp Neurol. 520, 142-153 (2012).
- Zhou, L. X., Wang, Z. R. Changes in number and distribution of retinal ganglion cells after optic nerve crush in zebrafish. Shi Yan Sheng Wu Xue Bao. 35, 159-162 (2002).
- Sherpa, T., et al. Ganglion cell regeneration following whole-retina destruction in zebrafish. Dev Neurobiol. 68, 166-181 (2008).
- Zou, S., Tian, C., Ge, S., Hu, B. Neurogenesis of retinal ganglion cells is not essential to visual functional recovery after optic nerve injury in adult zebrafish. PLoS One. 8, (2013).
- Choi, D., Li, D., Raisman, G. Fluorescent retrograde neuronal tracers that label the rat facial nucleus: a comparison of Fast Blue, Fluoro-ruby, Fluoro-emerald, Fluoro-Gold and DiI. J Neurosci Methods. 117, 167-172 (2002).
- Zou, S. Q., et al. Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish. J Vis Exp. , (2010).
- Tokuoka, H., Yoshida, T., Matsuda, N., Mishina, M. Regulation by glycogen synthase kinase-3beta of the arborization field and maturation of retinotectal projection in zebrafish. J Neurosci. 22, 10324-10332 (2002).
- Xiao, T., Roeser, T., Staub, W., Baier, H. A GFP-based genetic screen reveals mutations that disrupt the architecture of the zebrafish retinotectal projection. Development. 132, 2955-2967 (2005).
- Li, L., Dowling, J. E. Disruption of the olfactoretinal centrifugal pathway may relate to the visual system defect in night blindness b mutant zebrafish. Journal of Neuroscience. 20, 1883-1892 (2000).
- Kassing, V., Engelmann, J., Kurtz, R. Monitoring of Single-Cell Responses in the Optic Tectum of Adult Zebrafish with Dextran-Coupled Calcium Dyes Delivered via Local Electroporation. PLoS One. 8, (2013).
