Abstract
Etiquetado células ganglionares de la retina Como retrógradas (CGR) se pueden aislar CGR somata de sitios de morir, se ha convertido en el estándar de oro para el recuento de la CGR en la supervivencia de CGR y los experimentos de regeneración. Muchos estudios se han realizado en animales mamíferos para investigar la supervivencia de CGR después de la lesión del nervio óptico. Sin embargo, aún no se ha informado de marcado retrógrado de CGR en el pez cebra adultos, aunque algunos métodos alternativos pueden contar el número de células en capas de la retina de células ganglionares (RGCL). Teniendo en cuenta el pequeño tamaño del cráneo adultos de pez cebra y el alto riesgo de muerte después de la perforación en el cráneo, se abre el cráneo con la ayuda de grabado ácido y sellar el agujero con una fianza de curado de luz, lo que podría mejorar significativamente la tasa de supervivencia. Después de absorber los colorantes durante 5 días, casi todos los CGR están etiquetados. Como este método no es necesario seccionar el nervio óptico, que es insustituible en la investigación de la supervivencia de CGR después del aplastamiento del nervio óptico en adultos de pez cebra. Aquí, presentamoseste método paso a paso y ofrecer resultados representativos.
Introduction
Como adultos de pez cebra tiene una fuerte capacidad de regenerar axones después de la lesión del nervio óptico 1, un método adecuado para contar toda la CGR es fundamental para evaluar la supervivencia y regeneración de 2 CGR. Sobre la base de los métodos de la CGR etiquetado retrógradas en mamíferos y peces de colores 3-5, se construyó el método para etiquetar CGR del tectum en adultos de pez cebra. Para adultos de pez cebra, dos preocupaciones técnicos críticos deben tenerse en cuenta: el cráneo del pez cebra adulto es muy pequeño 6; viven en un ambiente de agua. Aquí, tratamos el cráneo con mordiente lo que minimiza los riesgos asociados con la perforación de 5. Luego, sellamos el agujero con la luz de bonos de curado que mejora la supervivencia de los animales después de la cirugía.
Anteriormente, se han adoptado varias otras técnicas para contar el número de CGR de manera indirecta. Tinción HE en las secciones de retina etiquetas de todos los tipos de células en el RGCL 7. Etiquetado de anticuerpos en toda la rEtina, tales como islote-1, también puede etiquetar células amacrinas 8. Aunque la etiqueta retrógrada del muñón del nervio óptico puede etiquetar todos los CGR en la retina, no se puede adoptar en el modelo de aplastamiento debido a que causa lesión adicional al nervio óptico. Aprovechando etiqueta retrógrada desde el tectum, hemos investigado la supervivencia y regeneración de la CGR en aplastamiento del nervio óptico. Los resultados muestran que casi todas las CGR y sobrevivieron más de 90% de CGR regeneran a la tectum en la primera semana en el modelo de aplastamiento 9.
Con el fin de etiquetar con éxito todas las CGR, pasta de Dil fue elegido después de la comparación con varios otros colorantes comerciales 10. En primer lugar, está especialmente diseñado para el etiquetado in vivo de tejidos. En segundo lugar, es un colorante lipófilo que no puede difundirse en agua. Además, esta fluorescencia puede persistir durante un largo tiempo que le hace un excelente candidato para la investigación de la supervivencia de CGR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Construya la Cirugía del Aparato
NOTA: Para asegurar el pescado se mantiene vivo durante y después de la operación, la anestesia por goteo solución de acetato de metanosulfonato de 3-aminobenzoato (MS-222, o tricaína) a una media de concentración (0,015%) con una velocidad de 1 gota / segundo a través de la boca del pez usando un sistema de goteo de construcción casera se muestra en la Figura 1.
- Haga una caja, como se muestra en la Figura 1A (longitud es de 28 cm, el ancho es de 10 cm, la altura es de 5 cm), coloque una esponja (la longitud es de 6 cm, la anchura es de 9 cm, la altura es de 4 cm) en el centro y abrir un brecha en él.
- Hacer una superficie globular liso en el extremo de la aguja con el bono de curación de luz (Figura 1B) que luego se inserta en la boca de los pescados. Asegúrese de que la superficie de la aguja es suave para evitar que la boca del pez de ser dañado.
- Añadir la concentración media de MS-222 (cámara de la izquierda, la longitud es de 6 cm, el ancho es de 10 cm, la altura es de 8 cm) y solución salina (cámara derecha, la longitud es de 4 cm, el ancho es de 10 cm, la altura es de 8 cm) para los depósitos como se muestra en la Figura 1C. Nota: Se recomienda Fresh MS-222.
- Anestesie peces en 0,03% de MS-222 durante 2 min.
- Coloque el pescado en la brecha de la esponja y fijar los peces con dos pares de pasadores, insertado detrás de la aleta pectoral y al lado del poro cloacal, respectivamente 11.
- Conectar la boca del pez, MS-222, y agua de cría con un tubo de tipo T como se muestra en la figura 1C.
- Conectar el tubo conectado a la MS-222.
2. CGR etiqueta retrógrados de la derecha Tectum
NOTA: Antes de comenzar, desinfecte todos los aparatos con etanol al 70-75%, lo que garantiza que ningún etanol permanece.
- Rossing, alejar un poco la piel sobre todo el cráneo con sclerectome (vista dorsal del cráneo se muestra en las figuras 2A y 2B
- Compensación: lavar el cráneo con solución salina y luego séquela con oreja bombilla lavado.
- Corrosión inicial: corroer el cráneo con el reactivo de ataque durante 10 s.
- Compensación: completamente limpie el grabador con un hisopo de algodón y luego lave el área con solución salina y se seca.
- Protección: con el fin de proteger el cráneo en otras áreas, excepto el tectum derecha desde el exceso de corrosión, cubrir estas áreas con vínculo lámpara de polimerización y después se cura por exposición a la luz azul con iluminador portátil.
- Corrosión completa: poner el grabador en la zona central de la tectum la derecha de nuevo para el grabado completo para 2 min. Nota: Dado que los cráneos de peces de más edad están calcificados, la corrosión se necesitará más tiempo.
- Compensación: completamente limpie el grabador con un hisopo de algodón y luego lave el área con solución salina y se seca de nuevo.
- Apertura Cráneo: retirar con cuidado el cráneo malacicas (Figura 2C) con unas pinzas para exponer el tectum derecha (Figura 2D
- Compensación: limpiar la mucosidad y effusing sangre del agujero con piezas de espuma de gel y se lava con solución salina hasta que el sangrado se ha detenido.
- Colocación tinte: poner el tinte (pasta de tejido-etiquetado) en todo el tectum derecha y se cubre con espuma de gel.
- Segregar: cubra el orificio con una escala estéril del mismo animal.
- Sellado: Bond Place lámpara de polimerización a la báscula y luego curarla con la luz azul de nuevo durante 40 segundos.
- Revival: lavar la superficie de la fianza y revivir el animal con solución salina.
- Enfermería y cría: Mantener el pescado en 28.5 ° C medio de embrión (ZFIN) durante 5 días y alimentar a 2 veces / día. No incluya pez cuyo tinte no logra permanecer en el tectum durante 5 días en el experimento. Nota: media de Embriones (EM) solución es vital para la supervivencia de los peces y de la temperatura es el factor clave para el marcaje con Dil.
3. Wholemounting Retina e Imagen
- Coloque el pescado en un campo oscuro durante 2 horas antes de la retina quelemount.
- Se anestesia el pescado con agua helada.
- Perforar un agujero en el margen de la córnea y hacer una taza de ojo mediante la eliminación de la córnea con tijeras venus.
- Retire el objetivo y luego vaciar el centro de la retina con helado PBS 1x.
- Enjuague la brecha entre la retina y la esclerótica con helado 1x PBS hasta que no quede ningún pigmento.
- Cortar el nervio óptico en el disco.
- Mantener la capa de CGR hacia arriba y mantenga la retina con una cuchara de cristal hecho a sí mismo (Figuras 3A y 3B). Un gotero también se puede utilizar para transferir la retina.
- Ponga la retina en una gota de hielo 30% de glicerina en una diapositiva con la capa de CGR hacia arriba (Figura 3C).
- Retire la glicerina y luego aplanar la retina en el portaobjetos de vidrio antes de cortar retina en cuatro cuadrantes (Figura 3D). Mantener la retina desarrollado con capa RGC alza será de utilidad para aplanar la retina.
- Por goteo helada 50% de glicerina en tél retina para lavar los fragmentos de pigmento.
- Retire la glicerina y luego dejar caer 20 l de helado 75% de glicerina en la retina.
- Cubra la muestra con 1,8 cm x 1,8 cm cubreobjetos cuadrado.
- Sellar el cubreobjetos con esmalte de uñas. Se recomienda de formación de imágenes inmediata de la retina.
- Imagen no entrelazada toda la retina bajo un lente objetivo de 20X (NA = 0,70) con DP72 CCD (cada imagen es 1360 x 1024 píxeles). Cada campo tiene tres enfoques diferentes.
- Extender la profundidad de cada campo con la herramienta de "profundidad de campo" en el software.
- Montar una retina virtual con la función de photomerge.
- Seleccionar tres campos de 680 x 512 píxeles (área real es de 350 micras por 264 micras, 0,092 mm 2) en cada orientación de la retina para analizar la densidad promedio de CGR (Figura 4A).
- Obtener el área con la función de las mediciones de - crear una entidad poligonal en la imagende software.
- Calcular el número total de CGR mediante la ecuación "número CGR = área destino x" 9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Como figuras 4B-D espectáculo, el número de células Dil + es de dos tercios de + células DAPI en RGCL. En una retina normal, una imagen de montaje de toda una retina (Figura 4E) muestra que con Dil + CGR se distribuyen en toda la retina, pero en una retina regenerada (Figura 4F), como CGR en la zona central no se han regenerado a su objetivo en la primera semana, que no podían ser etiquetados.
Figura 1. El aparato de cirugía que se usa para el etiquetado retrógrada del RGC. (A) Utilice una esponja (a) para fijar el pescado. La plataforma operativa (longitud es de 28 cm, la anchura es de 10 cm, la altura es de 5 cm) y el tubo de infusión están conectados a través de una aguja de metal (b). El exceso de agua se almacena en la cavidad (c). (B) Un primer plano de la aguja de metal. La cabeza de la aguja se envuelve con enlace de curado por luz (d). (C) Depósitos se utilizan para el almacenamiento de MS-222 (E, la longitud es de 6 cm, la anchura es de 10 cm, la altura es 8 cm) y solución salina (f, la longitud es 4 cm, la anchura es de 10 cm, la altura es 8 cm), respectivamente. El tubo de infusión (g) conecta el depósito y la aguja de metal.
Figura 2. Vista dorsal del cráneo del pez cebra adulto. (A) el cráneo intacto antes rossing. La línea de puntos amarilla marca el tectum; la línea de puntos de color rojo marca el telencéfalo; y la línea punteada verde marca el cerebelo. (B) Cráneo después de retirado de la piel. (C) Después de la corrosión con ácido grabador, el cráneo es malacicas y una zona cóncava es señalado por el fórceps (blanco *). (D) tectum derecho se expone después se retira el cráneo. La escala es 500 y #956; m.
Figura 3. Pasos clave de wholemounting retina. (A) cristal cuchara de construcción casera para sacar con pala retina, la imagen inferior muestra la visión de conjunto. (B) Mantenga la retina con la "cuchara" (marcado por la línea de puntos). (C) Transportar la retina en helada 30% de glicerina. ( D) Corte la retina en 4 cuartos; la flecha indica la orientación de corte. Las barras de escala (A) 1 mm; (BD) 500 micras.
F igura 4. El muestreo de la CGR a contar en la retina virtual. (A) Representación esquemática de la retina tiene cuatro campos (N, D, V, T de campo) y cada uno de ellos tienetres campos que se muestran en un cuadro blanco. Observe el disco óptico normalmente se encuentra en la orientación ventral-temporal (punto negro). (E) Imagen Montage de toda la retina (B) marcadas con Dil CGR. (C) DAPI núcleo etiquetado. (D) imagen fusionada de la CGR y el núcleo. en el pez cebra normal. (F) imagen Montage mostrando retina regenerado después de la lesión del nervio óptico. El área central de la retina no se etiqueta como CGR no se han regenerado a sus objetivos en la primera semana. Abreviaturas: N = nasal, D = dorsal, V = ventral, T = temporal. Las barras de escala: 30 m (BD); 500 micras (E, F).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Marcado retrógrado de CGR es importante investigar la supervivencia de CGR en animales mamíferos, pero no se ha usado en el pez cebra. Los métodos alternativos, tinción HE 7 y 8 tinción de anticuerpos, no son normas de oro para contar el número de CGR, y las líneas transgénicas con todas las CGR marcadas aún no se ha construido el 12, 13. En este video, se introduce un método para retrogradar CGR etiqueta en la retina del pez cebra adulto. Aunque aproximadamente el 1% de los axones se proyectan hacia bulbo olfatorio u otras zonas 14, este método puede etiquetar casi todas las CGR en la retina.
Como pez cebra son demasiado frágiles para soportar la lesión física, abrir el cráneo de adultos de pez cebra con bisturí incisión de 3 o un taladro de 5, 15 de causar la muerte. Ablandar el cráneo con grabador puede minimizar el daño en el cerebro. Al sellar el agujero con un lazo de luz de curado y fijándolo con luz azul,la mayoría de los peces sobreviven después de la cirugía. Sólo se tarda 12-15 minutos para realizar la cirugía en funcionamiento competente, que es más conveniente y eficiente en comparación con la rata y otros animales mamíferos 5.
Pasta de tejido-etiquetado Dil es un colorante lipófilo. En comparación con los cristales con Dil o microinyección de soluciones concentradas, esto mejora la penetración del colorante en el tejido, el etiquetado de los axones dentro y debajo de la superficie. Además, la fluorescencia puede persistir por un largo período de tiempo 10. Por otro lado, este colorante se absorbe por vía de transporte pasivo, por lo que es necesario dejar el tinte en el tectum durante al menos 5 días para el etiquetado completa.
El pez cebra es un organismo modelo excelente de la regeneración visual. A los 7 días después del aplastamiento del nervio óptico, casi todos los CGR axón regenerar al tectum, pero sólo la mitad de la CGR se regeneran en el modelo de corte del nervio óptico 9. Este método es una forma ideal para investigar RGCs la supervivencia y la regeneración después de aplastamiento del nervio óptico, que podría evitar lesiones extra en el nervio óptico.
Hemos presentado un protocolo completo de la CGR etiquetado con éxito retrógradas en el pez cebra adultos y que miden el número de CGR en una retina wholemount. Además, mediante el uso de un vínculo lámpara de polimerización, se aumenta la tasa de supervivencia del pez cebra, que hacen que este método sea más eficaz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MS222 | Sigma Aldrich, USA | E10521 | |
| DiI | Invitrogen, USA | N22880 | |
| Light curing bond | Heraeus Kulzer, Germany | Durafill bond | |
| Gluma Etch | Heraeus Kulzer, Germany | Gluma Etch 35 Gel | |
| Blue LED | Shenruo Medical Equipment Co., China | Power Blue Light Curing Unit |
References
- Wyatt, C., et al. Analysis of the astray/robo2 zebrafish mutant reveals that degenerating tracts do not provide strong guidance cues for regenerating optic axons. J Neurosci. 30, 13838-13849 (2010).
- Grieshaber, P., Lagreze, W. A., Noack, C., Boehringer, D., Biermann, J. Staining of fluorogold-prelabeled retinal ganglion cells with calcein-AM: A new method for assessing cell vitality. J Neurosci Methods. 192, 233-239 (2010).
- Schwalb, J. M., et al. Two factors secreted by the goldfish optic nerve induce retinal ganglion cells to regenerate axons in culture. J Neurosci. 15, 5514-5525 (1995).
- Watanabe, M., Inukai, N., Fukuda, Y. Survival of retinal ganglion cells after transection of the optic nerve in adult cats: a quantitative study within two weeks. Vis Neurosci. 18, 137-145 (2001).
- Chiu, K., Lau, W. M., Yeung, S. C., Chang, R. C., So, K. F. Retrograde labeling of retinal ganglion cells by application of fluoro-gold on the surface of superior colliculus. J Vis Exp. , (2008).
- Bakken, T. E., Stevens, C. F. Visual system scaling in teleost fish. J Comp Neurol. 520, 142-153 (2012).
- Zhou, L. X., Wang, Z. R. Changes in number and distribution of retinal ganglion cells after optic nerve crush in zebrafish. Shi Yan Sheng Wu Xue Bao. 35, 159-162 (2002).
- Sherpa, T., et al. Ganglion cell regeneration following whole-retina destruction in zebrafish. Dev Neurobiol. 68, 166-181 (2008).
- Zou, S., Tian, C., Ge, S., Hu, B. Neurogenesis of retinal ganglion cells is not essential to visual functional recovery after optic nerve injury in adult zebrafish. PLoS One. 8, (2013).
- Choi, D., Li, D., Raisman, G. Fluorescent retrograde neuronal tracers that label the rat facial nucleus: a comparison of Fast Blue, Fluoro-ruby, Fluoro-emerald, Fluoro-Gold and DiI. J Neurosci Methods. 117, 167-172 (2002).
- Zou, S. Q., et al. Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish. J Vis Exp. , (2010).
- Tokuoka, H., Yoshida, T., Matsuda, N., Mishina, M. Regulation by glycogen synthase kinase-3beta of the arborization field and maturation of retinotectal projection in zebrafish. J Neurosci. 22, 10324-10332 (2002).
- Xiao, T., Roeser, T., Staub, W., Baier, H. A GFP-based genetic screen reveals mutations that disrupt the architecture of the zebrafish retinotectal projection. Development. 132, 2955-2967 (2005).
- Li, L., Dowling, J. E. Disruption of the olfactoretinal centrifugal pathway may relate to the visual system defect in night blindness b mutant zebrafish. Journal of Neuroscience. 20, 1883-1892 (2000).
- Kassing, V., Engelmann, J., Kurtz, R. Monitoring of Single-Cell Responses in the Optic Tectum of Adult Zebrafish with Dextran-Coupled Calcium Dyes Delivered via Local Electroporation. PLoS One. 8, (2013).
