Summary
Dans cette étude, une nouvelle plate-forme d'enquêter signatures moléculaires intraneuronaux de la réponse au traitement dans le trouble bipolaire (BD) a été développé et validé. Épithélium olfactif chez des patients BD a été obtenue par des biopsies nasales. Puis-microdissection laser a été combinée avec Temps réel RT-PCR pour enquêter sur la signature moléculaire de la réponse de lithium dans BD.
Abstract
Le trouble bipolaire (BD) est un trouble neuropsychiatrique sévère avec physiopathologie mal compris et généralement traité avec le stabilisateur de l'humeur, le carbonate de lithium. Les études animales ainsi que des études génétiques humaines indiquent que le lithium affecte cibles moléculaires qui sont impliqués dans la croissance neuronale, la survie et la maturation, et notamment les molécules impliquées dans la signalisation Wnt. Compte tenu de l'enjeu éthique à l'obtention de biopsies du cerveau pour étudier les changements moléculaires dynamiques associés avec le lithium-réponse dans le système nerveux central (SNC), on peut envisager l'utilisation de neurones obtenus à partir de tissus olfactifs pour atteindre cet goal.The épithélium olfactif contient des neurones récepteurs olfactifs à différents stades de développement et des cellules gliales comme des cellules de soutien. Cette offre une occasion unique d'étudier les changements dynamiques dans le SNC de patients atteints de maladies neuropsychiatriques, en utilisant le tissu olfactif obtenu en toute sécurité à partir de biopsies nasales. Pour pallier l'inconvénient posé par substcontamination antial de tissu olfactif biopsie avec des cellules non neuronales, une nouvelle approche pour obtenir des populations cellulaires enrichies neuronale a été développé en combinant biopsies nasales avec le laser capture microdissection. Dans cette étude, un système pour étudier les changements moléculaires dynamiques traitement associé dans le tissu neuronal a été élaboré et validé, en utilisant un petit échantillon pilote de patients BD recrutés pour l'étude des mécanismes moléculaires de la réponse au traitement au lithium.
Introduction
Le trouble bipolaire (BD) est un trouble neuropsychiatrique sévère, caractérisée par des changements pathologiques de l'humeur, le dynamisme et la cognition 1. Lithium utilisé pour le traitement de BD a été montré pour modifier les niveaux d'ARNm de l'état d'équilibre d'un grand nombre de gènes dans les études animales 2, mais il reste inconnu si l'un de ces molécules est associée à la réponse clinique chez l'homme 2. Comprendre le mécanisme de la réponse au lithium faudrait étudier les changements moléculaires induite lithium dans les tissus neuronaux. Malheureusement, il ne est pas pratique d'obtenir des biopsies du cerveau de patients BD pré et post-traitement lithium pour identifier les signatures moléculaires de la réponse au lithium. Les tissus du cerveau post-mortem ont été utilisés pour étudier des biomarqueurs en BD, cependant, ils ne peuvent pas être utilisés pour évaluer les marqueurs moléculaires associés à des changements dynamiques dans les émotions, la cognition et de conduire; et la validité de la réponse au traitement a posteriori déterminé de lithium peut être problématique 4. Lymphocytes et les autres cellules sanguines pourraient être utiles, mais les changements moléculaires dans les cellules de sang peuvent ne pas refléter les modifications neuronales 3-5. Liquide céphalo-rachidien peut être insuffisant pour obtenir des informations sur les molécules intracellulaires qui peuvent refléter des changements intrinsèques associées à la maladie et des médicaments réversible.
L'épithélium olfactif (OE) est un élément unique du système nerveux central (SNC), embryologiquement liés aux structures limbiques 6; et il est facilement accessible par biopsies nasales. Il est constitué de cellules gliales cellules comme des cellules de soutien (par exemple, sustentaculaires), basales proliférantes, et les neurones récepteurs olfactifs à différents stades de développement 9.7. Par conséquent, OE offre une occasion unique d'étudier de manière accessible changements dynamiques dans le SNC de patients atteints de maladies neuropsychiatriques 7. Des études démontrent l'utilité de l'OE comme un tissu de substitution pour l'étude des maladies associées événements qui reflètent ces occurring dans les neurones du cerveau 8,9. Par exemple, des études ont utilisé OE pour enquêter sur les profils moléculaires associés à des troubles psychiatriques 10-14. Système olfactif sert également à identifier endophenoytpes cliniques tels que des déficits olfactifs qui sont associés à des symptômes négatifs de la schizophrénie 15. En outre, les processus neurodéveloppementaux continuent dans le OE long de la vie, en fournissant un moyen utile pour modéliser la physiopathologie sous-jacente des conditions psychiatriques 8,9.
Cependant, un inconvénient de l'utilisation de ce tissu est la contamination importante des biopsies olfactifs avec des cellules non neuronales 16. Par exemple, l'ARN total utilisé pour les études d'expression génique dans des études précédentes OE contenait l'ARN extrait à partir de l'ensemble du tissu nasal biopsie comprenant l'ARN à partir de cellules non neuronales 17. Par conséquent, les approches précédentes ont été limitées par la qualité des cellules. Pour surmonter ce problème, une nouvelle approche pour obtenir populations de cellules neuronales enrichies en combinant biopsies nasales avec laser capture microdissection (LCM) a été élaboré 18.
LCM est une technique qui permet l'isolement sélectif des cellules en utilisant le découpage au laser UV combinée à infra-rouge de 19 à 21 laser. Combinant LCM à l'approche OE minimiser la contamination importante de OE par les cellules non-neuronales, améliorant ainsi l'enrichissement des cellules neuronales 18. En outre, la couche neuronale peut être distinguée de la couche de sous-muqueuse au microscope, ce qui élimine la nécessité d'une coloration. Types de cellules neuronales peuvent en outre être distinguées des autres populations de cellules en utilisant des anticorps primaires qui sont exprimés par le type d'intérêt 7 de la cellule. Par conséquent, cette procédure établit une méthode plus simple pour l'enrichissement de la population de cellules presque purement neuronale qui peut être utilisé pour des études d'expression génique, immunohistochimie et autres investigations morphologiques.
ve_content "> Cette étude vise à établir une plate-forme expérimentale pour étudier les changements moléculaires dans les neurones olfactifs associés à des états pathologiques et la réponse au traitement. Pour y remédier, un petit groupe de patients non-fumeurs qui ont rencontré les critères diagnostiques du DSM-IV pour BD basée sur l'interview diagnostique pour les études génétiques (DIG) 22 a été recruté pour subir deux biopsies nasales: une biopsie pré-traitement avec le lithium et le deuxième biopsie, après 6 semaines de traitement quotidien de lithium orale outre, les patients BD éligibles doivent être:. symptomatique de la dépression , sur la base marquant ≥10 sur 60 dans le clinicien administré Montgomery Asberg-Rating Scale (MADRS) 23; symptomatique pour hypomanie ou de manie, basé sur un score ≥10 sur 56 sur le clinicien administré Young-Mania Rating Scale (YMRS) 24;. ≥10 ou sur les deux MADRS et YMRS coefficient évaluateur-Inter-évaluateur d'accord entre les cliniciens pour les deux échelles est> 0,96 Après biopsies, les neurones étaient enri.ched d'OE par LCM. Suite à des mesures supplémentaires de contrôle de la qualité, afin d'assurer l'extraction de l'ARN de haute qualité du tissu neuronal et l'enrichissement, en temps réel RT-PCR a été menée pour étudier les niveaux pré- et post-expression de traitement de gènes d'intérêt. Les sections suivantes contiennent une description de la validation de cette approche, soulignant l'optimisation du protocole et les stratégies qui ont été appliquées pour le dépannage du protocole.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
REMARQUE: Tous les bénévoles de recherche dans cette étude ont été administrés documents de consentement éclairé approuvés par la Commission de révision institutionnel de l'Université Howard et l'Université Johns Hopkins. Seuls les participants qui ont accepté en signant les documents de consentement éclairé ont été enrôlés dans l'étude. La base d'étude pour cette analyse a consisté à: 20 sujets (12 BD et 10 contrôles, 30% des hommes) et l'âge (sd) de 38,2 (14,1) ans signifie.
REMARQUE: Vaporiser toutes les surfaces avec Zap RNase pour éliminer la contamination RNase des surfaces de verre et de plastique.
1. Procédure biopsie
- Vaporiser actualité lidocaïne (xylocaïne) liquide 4% et oxymétazoline HCl 0,05% dans la cavité nasale du participant à l'étude et de permettre 15 minutes de temps d'engourdissement.
- Faire tremper cottonoids chirurgicales ½ x 3 pouces dans un mélange de lidocaïne et oxymétazoline et l'insérer dans la cavité nasale long de la partie supérieure de la cloison nasale et laisser reposer pendant 15 min.
- L'utilisation d'un 30 ° rigideendoscope nasal pour localiser la partie supérieure de la cavité nasale, supprimer la muqueuse nasale en utilisant jusqu'à ronger pince nasales de la partie supérieure de la cloison nasale, en prenant plusieurs petits spécimens.
2. Préparation des blocs de tissus
- Immédiatement avant la biopsie, remplissez cryomoules de taille standard avec le tissu milieu de congélation.
- Aide de pincettes autoclave, monter tissu frais dans le milieu de congélation et de geler sur glace sèche. Remplissez reste de cryoblock avec le milieu congélation, cryoblock sur glace sèche, et les blocs de magasins à -80 ° C.
3. Cryosectioning
- Préparer polyéthylène (PEN) des lames de verre de la membrane immédiatement avant cryosectioning. Vaporiser diapositives avec une solution RNase Zap pendant 5 min. Ensuite, rincer les lames dans de diéthyle (DEPC) l'eau et laissez sécher à l'air pendant 30 min. Activer diapositives séché sous lumière UV pendant 30 minutes.
- Cryosection chaque bloc entièrement à 30 um. Gardez diapositives sur i secCE, et des sections congelées autant que possible. Stocker les lames à -80 ºC à la fin.
4. Laser-Microdissection
- Commencez par déshydratation diapositives immédiatement avant microdissection. Laissez diapositives congelés dégeler pendant 10 secondes, puis appliquez la série de l'éthanol suivant pour chaque diapositive: 60% (2 ml, 15 sec), 80% (2 ml, 15 sec), 95% (3 ml, 25 sec), 100 % (7 ml, 60 sec).
- Tournez la microscopie de localisation photoactivé (PALM) microscope et réglez les conditions suivantes: Pour un grossissement 10X mettre l'énergie à 82, se concentrer à 74, et la vitesse à 25 - 30. Pour 20X, définissez l'énergie à 63, se concentrer à 67, et la vitesse à 5 - 6. Réglez que nécessaire pour obtenir des résultats de coupe optimaux.
- Identifier visuellement neurones utilisant 20X ou grossissement 10X. Distinguer la surface fine couche de neurone olfactif de la sous-muqueuse sous-jacente sous un microscope sans l'utilisation de la procédure de coloration. Observer les neurones comme un aspect colonnaire dense 18.
- Utilisation de la fonction Crayon dans le microscope précité à l'étape 4.2, tracer autour de la couche neuronale. Tracez un peu loin de neurones pour éviter de brûler des neurones du laser. Ceci est essentiel pour l'obtention d'ARN de haute qualité. Puis lancer laser guidé coupe.
- Pick-up sections disséqués utilisant pince fine de microdissection de pointe et de mettre le tissu dans un microtube contenant 100 pi de tampon de lyse sur la glace. Répétez l'opération pour toutes les sections de neurones obtenus à partir d'un seul échantillon. Temps de dissection totale par échantillon ne doit pas dépasser 50 min.
- Une fois la dissection est terminée, immédiatement lysats d'échantillons de vortex et de garder sur la glace sèche. Conserver les échantillons à -80 ° C pour l'isolement de l'ARN total.
5. Isolement de l'ARN total et de l'analyse de contrôle de qualité
- Lysats d'échantillons dégel sur la glace. Effectuer un isolement total d'ARN avec RNAqueous Micro Kit avec DNase-je inactivation en suivant le protocole du fabricant sans modifications (voir <strong> Figure 1). Le volume d'élution totale est d'environ 20 ul.
- Mesurer la concentration d'ARN et d'évaluer la qualité de l'ARN avec l'ARN Nombre intégrité (RIN) en utilisant Bioanalyzer. Les échantillons qui satisfont aux critères de contrôle de qualité de la figure 2 peuvent être utilisés pour la synthèse d'ADNc.
6. cDNA Synthesis
- Synthétiser l'ADNc en utilisant un kit commercial validé (voir le tableau des réactifs). Effectuer l'étape de recuit en combinant 0,1 à 1,0 ng d'ARN (selon disponibilité) et RNase eau libre à un volume total de 8 pi par tube. Puis ajouter 1 pl d'oligo d (T) 20 amorce et 1 pl de 10 mM dNTP mix par tube, pour un volume total de 10 ul.
- Doucement échantillons de vortex et centrifuger et des échantillons de recuit à 65 ° C pendant 5 min. Après la réaction est terminée, immédiatement les échantillons frais sur la glace.
- Préparer la solution de mélange maître selon les spécifications du tableau 1. Puis ajouter 9,5 μl mélange maître et 0,5 ul de transcriptase inverse préparation du commerce (RT) à chaque tube. Ajouter 0,5 eau libre de RNase-pi de contrôler le tube à la place de la RT.
- Exécutez une réaction RT avec la première incubation à 50 ° C pendant 50 min, puis 85 ° C pendant 5 minutes et une finale maintien à 4 ° C, sans vélo.
- Diluer tous les échantillons par 5x avec de l'eau et aliquote. Conserver les échantillons à -80 ºC.
7. PCR en temps réel - Confirmez neuronale Enrichissement
- Préparer la solution de mélange maître selon les spécifications dans le tableau 2. Utilisez un contrôle interne tels que GAPDH. Comparer olfactive protéine marqueur (OMP) expression dans le tissu microdisséqués avec l'expression de OMP dans le tissu undissected pour déterminer l'enrichissement neuronale.
REMARQUE: OMP est un marqueur pour les neurones olfactifs.
OMP séquence: avant, 5'-CTGTCGGACCTGGCCAAG-3 '
inverser, 5'-CACCCTCGCCAAAGGTGA-3 '
séquence de GAPDH: avant, 5'-CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-3 '
inverser, 5'-AGTCCTTCCACGATACCAAAGT-3 '. - Mettre en place la plaque PCR en ajoutant 7 pi de mélange maître dans chaque puits et 3 ul d'ADNc.
- Centrifugeuse plaque pendant 5 min à 300 g (1300 rpm). Exécuter réaction PCR en temps réel en utilisant les conditions de cyclage thermique par défaut spécifiées pour supermix commercial comme SYBR Greener qPCR.
- Analyser les données (voir la figure 2 pour les spécifications).
8. PCR en temps réel - Expression des gènes d'intérêt
- Effectuer sur des échantillons qui montrent l'enrichissement neuronale de deux fois ou plus.
- Préparer mélange maître sur la glace pour chaque sonde (sonde FAM marqué d'intérêt et VIC marqué GAPDH) dans des tubes séparés selon les spécifications du tableau 3.
- Mettre en place une plaque PCR avec 8 pi mélange maître dans chaque puits et 2 ul d'ADNc.
- Centrifuger la plaque pendant 5 min à 300 g (1300 rpm). Exécutez réaction PCR en temps réel en utilisant le defconditions de cyclage thermique ault que par l'expression du gène protocole maître de mélange fourni par le fabricant. Analyser les résultats d'expression (voir la figure 2 pour les spécifications).
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Representative Results
La stratégie de protocole et le dépannage dans l'étude des signatures moléculaires ont été optimisés avec succès. la qualité de l'ARN et les critères d'enrichissement neuronaux pour les échantillons à utiliser dans une analyse plus approfondie réel aval PCR en temps ont été normalisés. RIN et la concentration d'ARN ont été examinées comme des facteurs de confusion à des niveaux d'expression détectés. Sur la base de l'analyse de plusieurs échantillons avec RIN allant de 1 à 10, on a déterminé qu'un RIN minimum de ~ 3,0 et au-dessus est suffisante pour l'analyse en aval dans cette étude. En conséquence, la quantité d'ARN pour la synthèse d'ADNc a été standardisé à 1,0 ng. Ainsi, des échantillons de haute qualité avec un RIN ~ 3,0-dessus et de l'ARN quantité de 1,0 ng ont été convertis en ADNc. Les échantillons avec 0,1 à 1,0 ng d'ARN pourraient être utilisées si un échantillon de taille adéquate est difficile à obtenir.
Enrichissement neuronale a été confirmé par analyse PCR en temps réel. OMP niveaux d'expression génique dans des échantillons microdisséqués ont été comparés à ceux de l'échantillon undissecteds pour déterminer si la couche neuronale a été enrichi. Microdisséquées échantillons avec deux expression fois ou plus par rapport à OMP tissu non-disséqué sont utilisés.
Par conséquent, en application de ces critères, la faisabilité de cette approche proposée pour étudier les changements moléculaires dans les neurones OE a été validé. La figure 3 illustre que les niveaux de GSK-3β expression sont affectés par le lithium plutôt que par des facteurs exogènes non-spécifiques, indiquant que cette méthodologie est suffisante pour détecter les changements moléculaires spécifiques avant et après traitement au lithium. Plus précisément, les modifications de signatures moléculaires associés à la réponse au traitement de lithium dans BD peuvent être abordées en combinant ces données avec les données cliniques moléculaires.
Figure 1. Extraction de l'ARN et DNase Protocole inactivation. Le flowchart illustre la procédure d'extraction de l'ARN à partir d'échantillons après LCM. L'ARN total est élue deux fois pour donner un volume d'ARN maximum d'environ 20 ul. Échantillons élues sont ensuite soumis à un traitement de DNase I pour DNase inactivation. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Résumé du protocole. Ce chiffre résume l'ensemble du protocole pour les expériences d'étude. Tissu nasal est d'abord une biopsie et congelé que cryoblocks. Après la coupe du tissu, les couches neuronales sont disséqués utilisent LCM. l'extraction de l'ARN et DNase inactivation sont effectuées en utilisant les directives du fabricant (voir Figure 1). Les échantillons qui répondent aux critères de contrôle de qualité et de quantité (RIN) de l'ARN sont utilisés pour synthétiser l'ADNc et noused pour l'analyse d'enrichissement neuronale. Échantillons enrichis sont utilisés dans l'analyse PCR en temps réel avec les objectifs souhaités. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. GSK-3β expression dans BD et des échantillons témoins. Cette figure illustre les changements dans les niveaux d'expression de GSK-3β dans les échantillons BD avant et après traitement au lithium et l'uniformité des niveaux d'expression de GSK-3β dans des échantillons de contrôle entre la première et la seconde biopsie. Prises ensemble, ces données démontrent que l'expression de GSK-3β est affectée par le lithium, plutôt que des facteurs exogènes non spécifiques.
| Réactifs | Volume |
| 10 x tampon RT | 2 ul |
| 25 mM MgCl | 4 ul |
| 0,1 M DDT | 2 ul |
| RNase Out | 0,5 ul |
| SuperScript III | 0,5 ul |
| Rnase eau libre | 1 ul |
Tableau 1. Solution de synthèse d'ADNc Maître Mix.
| Réactifs | x1 | x (# d'échantillons) |
| Patron de l'ADN | 3 ul | - |
| SYBR Green | 5 ul | |
| Primer Mix | 0,8 pl | |
| Eau | 1,2 pl | |
| Total | 10 ul | - |
Tableau 2. neuronale enrichissement PCR Master Mix Solution.
| Réactifs | x1 | x (# d'échantillons / amorce) |
| dWater | 2 ul | |
| Master Mix | 5 ul | |
| FAM sonde marquée | 0,1 pl | |
| VIC sonde marquée | 0,5 ul | |
| ADNc | 2 ul | - |
Tableau 3. cible PCR Master Mix.
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Discussion
Une nouvelle plate-forme pour obtenir des couches de neurones olfactifs enrichis en combinant la biopsie nasale et LCM est présenté et a été validé dans cette étude. Cette technique peut avoir de vastes répercussions. Il peut être appliqué vers des études de biomarqueurs, y compris ceux pour la réponse au traitement, et les efforts de découverte de médicaments pour d'autres affections neuropsychiatriques, avoir un impact plus large dans le domaine.
Pour obtenir neurones de haute qualité qui se prêtent à des applications en aval, quelques étapes critiques et de dépannage doivent être notés. Tout d'abord, obtenir 4-6 morceaux de tissu olfactif par patient d'avoir un échantillon de taille adéquate. Deuxièmement, puisque les échantillons sont sensibles à la dégradation de l'ARN, gardez tissus à des températures appropriées, travailler avec RNase matériel et les surfaces libres, utilisez des gants, et éviter de respirer directement sur échantillons. Si la qualité de l'ARN est encore faible, envisager de remplir microdissection moins de 50 min et effectuer l'extraction d'ARN immédiatement après la dissection ou vortéchantillons ex garder immédiatement et sur glace sèche jusqu'au stockage à -80 ° C. Pour augmenter le rendement de l'ARN, augmenter le nombre de sections disséqués au cours LCM.
Un défi d'étudier les changements moléculaires cerveau associée dans les troubles neuropsychiatriques existe en raison du manque d'accessibilité pour étudier le cerveau humain. D'autres approches incluent l'étude des cellules du sang périphérique, cerveaux autopsiés, et les cellules souches pluripotentes induites (iPS). Les cellules sanguines ne peuvent pas représenter les changements neuronaux associés à la maladie. Cerveaux autopsiés ne peuvent pas être la ressource pour étudier les changements dynamiques et des États associés à la progression de la maladie et de la réponse aux médicaments. cellules iPS peuvent ne pas refléter directement des changements d'état, parce que ces traces sont susceptibles d'être effacée durant le cours de la reprogrammation et l'entretien des cellules. Par conséquent, les avantages de l'utilisation des tissus OE sont la possibilité d'étudier les deux changements d'état et dynamiques dans le contexte neuronale. En particulier, iPS dérivées souche neuronaleles cellules peuvent ne pas refléter de manière adéquate l'effet de 6 semaines de traitement au lithium, du fait de culture et d'étapes reprogrammation. La méthodologie présentée dans cet article nous permet d'étudier les changements moléculaires associés au traitement et les relier à des changements dans les symptômes cliniques. Il faut noter que, au moins à l'heure actuelle, la quantité de neurones obtenus à partir de tissus OE est suffisante pour des études au niveau moléculaire, mais ne peut pas être limitée à la caractérisation des protéines grâce à des applications d'immunohistochimie. Ainsi, d'autres améliorations techniques sont également attendus.
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Disclosures
Les auteurs rapportent pas de relations financières avec des intérêts commerciaux.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue Preparation | |||
| Tissue-Tek Cryomold Molds | Sakura Finetek | 4557 | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| Cryosectioning | |||
| Membrane Slide 1.0 PEN (D) | Carl Zeiss Microscopy | 415190-9041-000 | |
| Rnase Zap | Ambion | AM9780 | |
| DEPC Treated Water | Quality Biological | 351-068-131 | |
| Microdissection | |||
| Microscope: PALM Series MicroLaser System | Carl Zeiss Microscopy | Model: Axiovert 200M Software: Robo v3.2 |
|
| No. 5 Dumont Microdissction Forceps | Roboz | RS-49085 | |
| RNA Extraction | |||
| RNAqueous Micro Kit | Ambion | AM1931 | |
| cDNA Synthesis | |||
| SuperScript III First Strand Synthesis Kit | Invitrogen | 18080-051 | |
| OMP qPCR | |||
| SYBR GreenER qPCR SuperMix | Invitrogen | 11760-500 | |
| Taqman qPCR | |||
| TaqMan Expression Assay Probes | Applied Biosystems | Various | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Applied Biosystems | 4369016 | |
References
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