Introduction
ניתוח הקטרקט הרלוונטי מבחינה קלינית, מדומה, לשעבר vivo מודל ריפוי פצעי אפיתל המתואר כאן פותח כדי לספק כלי לחקר המנגנונים המווסתים את התיקון של רקמות האפיתל בתגובה לפציעה. תכונות עיקריות שנועדו ביצירת מודל זה כלול 1 תנאים) ובלבד שמשוכפלים מקרוב את התגובה בvivo לנפצע בהגדרת תרבות, 2) להקל בויסות אלמנטי הרגולציה של תיקון, ו- 3) יכולת תמונת תהליך התיקון, בשלמותו, בזמן אמת. האתגר, לכן, היה ליצור מודל תרבות שבה ניתן היה ללמוד, ולטפל, לתקן פצע אפיתל במייקרו-הסביבה האם של התאים. הזמינות של מודל פצע-תיקון זה פותחת אפשרויות חדשות לזיהוי רמזי איתות אנדוגני ממטריצת חלבונים, ציטוקינים וכמוקינים המסדירים את תהליך התיקון. בנוסף, המודל אידיאלי לבחינה איךn האפיתל הוא מסוגל לנוע כגיליון קולקטיבי מחדש epithelialize אזור פצע 2,3, ולקביעת השושלת של תאי מנהיג mesenchymal בשולי הפצע שפועלים בהכוונת ההגירה הקולקטיבית של האפיתל נפצע 4. מודל זה גם מספק פלטפורמה שעם לזהות תרופות שיכולים לקדם את ריפוי פצע יעיל ולמנוע תיקון פצע חריג 5.
יש כבר מספר דגמי פצע-תיקון זמינים, הן בתרבות וin vivo, שספק את רוב מה שידוע על תהליך תיקון הפצע היום. במודלים של בעלי חיים פציעה, כגון קרנית 6-12 ועור 13-17, יש את ההזדמנות ללמוד את התגובה של הרקמה לפציעתם בהקשר של כל מתווכי התיקון שיכול להיות מעורב בתהליך, כוללים תרומות מ מערכת עצבים כלי דם ו. עם זאת, יש מגבלות למניפולציה של ההתנסותתנאים נפשיים in vivo, וזה עדיין לא ניתן לבצע מחקרי הדמיה של תגובת תיקון in vivo, רציף ולאורך זמן. לעומת זאת, רוב דגמי תרבות במבחנה פצע-תיקון, כגון פצע השריטה, ניתן להשפיע בקלות ואחריו לאורך זמן, אבל חסרים את ההקשר הסביבתי של לימוד ריפוי פצעים ברקמות in vivo. בעוד מודלים vivo לשעבר מציעים את היתרון של לימוד תהליך תיקון פגיעה ברציפות לאורך זמן בהקשר של מייקרו-הסביבה של התאים בשילוב עם היכולת לווסת את הרגולטורים המולקולריים של תיקון בכל נקודה בתהליך זמן, יש כמה דגמים שמתאימים אלה פרמטרים.
כאן מתואר הליך כדי ליצור vivo לשעבר פצע אפיתל מאוד לשחזור ריפוי תרבויות שלשכפל התגובה של רקמת האפיתל לפציעה פיזיולוגית. שימוש בעדשה עובר אפרוח כמקור רקמות, vivo לשעבר MOCניתוח קטרקט k מתבצע. העדשה היא רקמה אידיאלית לשימוש עבור מחקרים אלה שכן הוא בתוך כמוסת קרום במרתף עבה עצמאי, avascular, לא innervated, וללא כל סטרומה קשורה 18,19. במחלות של בני אדם, ניתוח קטרקט מתייחס לאובדן ראייה עקב עננות של העדשה, וכרוך בהסרת מסת תאי עדשת סיבים, הכוללת את חלק הארי של העדשה. חזון ניתוח קטרקט בעקבות משוחזר באמצעות ההחדרה של עדשה תוך-עינית מלאכותית. ניתוח הקטרקט, באמצעות הסרת תאי סיבים, גורם תגובת פציעה באפיתל העדשה הסמוכה, שמגיב בepithelialization מחדש של האזור האחורי של הקפסולה העדשה שנכבש על ידי תאי הסיבים. בניתוח קטרקט, כמו ברוב תגובות תיקון הפצע, יש לפעמים מתרחש תוצאה חריגה fibrotic לתגובת ריפוי הפצע, הקשורים בהופעתה של myofibroblasts, אשר בעדשה ידועה כאחורי Capsule העננות 20-22. על מנת ליצור את מודל ריפוי פצע ניתוח קטרקט, ניתוח קטרקט הוא חיקה בעדשות הוסרו מן העין עובר אפרוח לייצר פגיעה פיזיולוגית. הסרת מייקר תוצאות תאי עדשת סיבים באזור פצע עגול מאוד עקבי מוקף תאי אפיתל העדשה. אוכלוסיית תא זה נשארה מחובר היטב לכמוסת הקרום במרתף עדשה והוא נפגע על ידי ההליך כירורגי. תאי האפיתל להעביר על האזור הערום של הקרום במרתף אנדוגני לרפא את הפצע, בראשות אוכלוסייה של תאי mesenchymal vimentin העשיר הידועים בתהליך תיקון תאי מנהיג 1. בעזרת מודל זה התגובה של האפיתל לפציעה ניתן דמיין בקלות ואחריו עם זמן בהקשר של מייקרו-הסביבה של התאים. התאים נגישים לשינויים בביטוי או ההפעלה של המולקולות צפויות לשחק תפקיד בתיקון פצע. תכונה חזקה של ההוא מודל הוא היכולת לבודד ולחקור שינויי הגירה ספציפית במסגרת ריפוי פצעים. היכולת להכין מספר גדול של תרבויות בגילים תואמות vivo לשעבר ריפוי פצע ללימודים היא יתרון נוסף של מודל זה. לפיכך, מערכת מודל זה מספקת הזדמנות ייחודית ללהפריד מנגנוני תיקון פצע ותרופות מבחן להשפעתם על תהליך ריפוי פצע. מודל ניתוח קטרקט המדומה vivo לשעבר צפוי להיות תחולה רחבה, מתן משאבים קריטיים לחקר מנגנונים של תיקון פציעה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הפרוטוקול הבא עומד בהנחיות הטיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדת שימוש אוניברסיטת תומס ג'פרסון ועם הצהרת ארוו לשימוש בבעלי חיים במחקר חזון.
1. התקנה והכנת עדשות לתרבות Ex Vivo פצע
- הנח שלוש 100 מ"מ צלחות פטרי ב, זרימה למינרית סטרילי. מלא שתי צלחות פטרי באמצע הדרך עם חיץ טריס / דקסטרוז (חיץ TD, 140 מ"מ NaCl, 5 מ"מ KCl, 0.7 מ"מ Na 2 PO 4, 5 מ"מ D-גלוקוז, 8.25 מ"מ טריס בסיס, pH 7.4 עם HCl) ב RT , עוזב את ריק שלישי. תקשורת ותרבות טרום חמה (199 מדיה בתוספת, 1% L- גלוטמין ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין) עד 37 מעלות צלסיוס
הערה: הפצע הסטנדרטי ריפוי תקשורת והתרבות הוא סרום ללא, כפי שקורה בvivo; עם זאת, ניתן לגדל תרבויות פצע-תיקון בהצלחה בתנאים שהוגדרו בתקשורת הכוללים סרום או גורמים אחרים. - הסר ד העוברי הפורהאיי 15 ביצת אפרוח ליבורנו לבנה מחממה (מוחזק ב37.7 מעלות צלזיוס עם נדנדה עדינה)
- מקום שנבחרה ביצה בזרימה למינרית ומחוץ נקי של פגז עם אתנול 70% מבקבוק לשטוף. לנהל את כל ההליכים המפורטים להלן בתנאים אספטיים בזרימה למינרית, תוך שימוש בפתרונות וכלים סטריליים.
- לפצח תוכן ביצה ומקום לצלחת פטרי 100 מ"מ הריקים. לערוף עובר באמצעות מלקחיים סטנדרטיים ומספריים עדינים. מניחים את ראש עובר אפרוח בצלחת פטרי המכילה מאגר TD ולהשליך כיאות את השארית של העובר. לחלופין לשמור על הראשים עוברים אפרוח במאגר TD לתקופה קצרה של זמן, לא יותר מ -15 דקות.
- מניחים את ראש עובר אפרוח על מכסה צלחת פטרי. בעזרת מלקחיים דיוק גבוהים, להסיר את העדשה יחד עם ההומור שלה מצורף זגוגית מהעין ברצף הבא. לצבוט את החלק האחורי של העין עם המלקחיים כדי ליצור פתח קטן בחלק האחורי של העין.
- לאחר מכן, לתפוס את הומור זגוגי wמלקחיים ה- i ובעדינות למשוך על הזגוגית בתנועת גלגול, הזגוגית עם העדשה מצורפת, וחילצה מן העין. עדשת מקום / זגוגית בצלחת פטרי שנותרה המכילה מאגר TD. לאפשר העדשות להישאר במאגר TD לא יותר מ -30 דקות.
- הזז את העדשה למכסה צלחת פטרי חדש תחת מיקרוסקופ לנתח. בשלב זה לבצע את כל הפעולות תחת מיקרוסקופ לנתח. עם מלקחיים דיוק גבוהים לצחצח בזהירות כל גוף הריסים (תאי פיגמנט) שחלצו עם העדשה באמצעות קצה המלקחיים, לוקח זהירות שלא לפגוע ברקמת העדשה.
הערה: הסרת גוף הריסים מבטיחה כי סוגי תאים שאינם אנדוגני לעדשה אינם כלולים בתרבות תיקון פצע. - הפרד את העדשה מהזגוגית עם מלקחיים דיוק גבוהים על ידי צובט את הגוף הזגוגי מהקשר שלה עם הקפסולה העדשה האחורית.
- באמצעות דיוק גבוה מלקחיים להעביר את העדשה לירידה קטנהשל חיץ TD (כ -200 μl) בצלחת תרבית רקמת 35mm.
2. ניתוח קטרקט מוק הבמה
- לכוון את העדשה בירידה של חיץ TD בצלחת 35 מ"מ עם ההיבט הקדמי של העדשה פונה כלפי מעלה.
הערה: הקדמי של העדשה מזוהה בקלות על ידי הנוכחות של טבעת צפופה ברקמה שמציינת את הגבול בין קדמי ואזור קו המשווה של האפיתל העדשה. לעומת זאת, יש העדר סימונים על האחורי של הקפסולה העדשה שתאי עדשת הסיבים מחוברים. - שימוש בשני מלקחיים דיוק גבוהים לעשות חתך קטן (כ 850μm) במרכז הקפסולה הקדמית העדשה, הקרום במרתף העבה המקיף את רקמת העדשה, ואפיתל העדשה קדמית הקשורים אליו, תוך כדי אחיזה ברקמה עם מלקחיים בכל יד ו בעדינות מושך בכיוונים מנוגדים.
- הסר את מסת תאי סיבים, מה שהופך את חלק הארי של רקמת עדשה, dislodגינג מנספחיו לאפיתל העדשה ומקיפה כמוסת עדשה על ידי הידרו-elution (גישה המשמשת בניתוחי קטרקט קלאסיים, דגם באיור 1 א).
- ממלאי מזרק 1 מיליליטר עם קצה מחט 27.5 G עם 300 μl של חיץ TD. הכנס את קצה המחט לתוך החתך שנעשה בכמוסת העדשה הקדמית, ובערך באמצע הדרך לעדשה.
- בעדינות לדכא את מזרק הזרקת חיץ TD למסת תאי סיבי עדשה. להזריק בין 50 ל 200 TD μl, ולא יותר מ -300 μl. שים לב למסת תאי סיבי התרופפות עצמו מכמוסת האפיתל ועדשה.
- בעזרת מלקחיים דיוק גבוהים, להסיר את מסת תאי סיבים משוחררת מהעדשה דרך אתר החתך הקדמי.
הערה: הליך זה יוצא הקפסולה העדשה האחורית קרום במרתף כדי שתאי הסיבים היו קשורים ערום של תאים, ואפיתל עדשה נפצע רק בסמוך לאתר זה.
3. ומתכונניםז העדשות הפצועים לאקס תרבות Vivo
- לשטח את שקית קופסית העדשה, הנובעת מניתוח הקטרקט שתואר לעיל על צלחת התרבות, צד עד תא, על ידי ביצוע חמישה חתכים בהיבט הקדמי של תיק קופסית.
- חותך בניצב לאתר החתך המקורי ועד לקו המשווה של הכדור. שטחו את חמישה "הדשים" התוצאה של כמוסת עדשה עם אפיתל המצורף בצד כמוסת צלחת התרבות למטה, בצד עד תא. שים לב לעדשה נפצעה vivo לשעבר עכשיו צריך לקחת על כוכב או צורה דמוית פרחים (ראה איור 1).
- כדי להבטיח את הקפסולה לצלחת, עיתונות ברכות למטה עם המלקחיים בכל נקודה של הכוכב. זה יהפוך את כניסה קטנה בחמשת הטיפים מחוץ ביותר של explant ולגרום לקובץ מצורף מתמשך לצלחת.
הערה: ניתן לפגוע בכמוסה במהלך הליך זה ולכן חשוב להבטיח את הקפסולה לצלחת הקרובה לטיפים של פלורידהנ.ב. ככל האפשר, כמו גם להפוך את הכמות המינימאלית של נקודות הבטחת ככל האפשר (בדרך כלל שתיים, מקסימום שלושה לדש). - הסר את חיץ TD מצלחת 35mm ולהחליף אותו עם 1.5 מיליליטר של תקשורת מחוממת מראש. מכסה את צלחת 35mm עם המכסה שלה ומקום בחממה (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2).
4. הפרדה של מרכז הגירת האזור (CMZ), שבו מחדש epithelialization של האזור הפצוע בקפסולה אחורית מתרחש, מהקובץ המצורף המקורי האזור (OAZ) של תאי אפיתל העדשה, לניתוח כמותי.
הערה: התאים מתחילים לנוע לאזור CMZ מייד בתגובה לפציעה. ביום אחד בתרבות מספיק תאים נודדים ברחבי CMZ לניתוח מולקולרי וביוכימיים, הבאים הפרדת CMZ וOAZ על ידי מיקרו לנתיחה 23. פרוטוקול זה כרוך ההסרה של כנף אחת (OAZ) בכל פעם מהאזור הפצוע של הקפסולה.
- שים לב Demarקטיון, נראה בבירור מתחת למיקרוסקופ לנתח, בין OAZ וCMZ (ראה איור 2 א). שימוש בשני מלקחיים דיוק גבוהים, לתפוס בשני המלקחיים בקצה קו OAZ / CMZ, אחד רק בסמוך לאחר, משני צדי הקו (ראה איור 2 א, ב, חץ).
- שימוש ביד אחת / אחד מלקחיים בצד CMZ להמשיך להחזיק בתרבות הפצועה, בעוד עם היד / מלקחיים אחרים, משוך בעדינות את OAZ לאורך קו OAZ / CMZ. CMZ קלות מפריד מOAZ לאורך הקו הזה. תמשיך לאורך הקו הזה מסביב לכל התרבות עד שני האזורים מופרדים לחלוטין.
- ללמוד את השברים המופרדים OAZ וCMZ לניתוח מולקולרי כמו 24 או ביוכימיים ניתוח RNA-Seq כגון כתם מערבי או שיתוף immunoprecipitation 23,25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ex Vivo דגם נוצר כדי ללמוד את תהליך ריפוי הפצע במייקרו-הסביבה האם של התאים
לחקור מנגנונים מעורבים בויסות ריפוי פצע של האפיתל במייקרו-הסביבה המקומית של התאים, מודל ניתוח קטרקט רלוונטי קליני vivo לשעבר מדומה נוצר. מודל זה נוצר מרקמת עדשה המציעה יתרונות רבים בשל המאפיינים הפנימיים שלה: 1) העדשה היא איבר עצמאי מוקף קרום במרתף עבה נקרא הקפסולה העדשה; 2) זה avascular, 3) לא innervated ו -4) ללא סטרומה קשורה. לכן, תהליך התיקון בדק מוגבל לתאים שהם מולדים לעדשה הנכונה. כדי ליצור מודל זה, עדשות יוסרו מעוברי (E) יום 15 עוברים אפרוח (איור 1 א). חתך קטן נעשה בכמוסה הקדמית העדשה ותאי אפיתל העדשה הקשורים אליו שדרכו מסת תאי סיבי העדשה מוסרתעל ידי הידרו-elution, הליך קטרקט קלאסי שיוצר פציעה רלוונטית מבחינה פיזיולוגית (איור 1 א). אפיתל העדשה, אשר שוהה כmonolayer רציף של תאים לאורך קדמי והיבטים משווניים של הקפסולה העדשה המקיפים את מסת תאי סיבים, יחד עם אוכלוסיית אנדוגני של אבות תא תיקון mesenchymal vimentin עשיר 1, להישאר בעדשה ב מיצוי של תאי סיבים (איור 1 א). בעקבות הסרת מסת תאי סיבים, חמישה חתכים נעשים בהיבט הקדמי של הקפסולה העדשה והאפיתל שטוח תא בצד למעלה, מול בינוני. הליך זה מאפשר הדמיה של התגובה של האפיתל נפגע על ידי גישות מיקרוסקופיות שונות, כוללים מיקרוסקופיה הזמן לשגות (וידאו 1). קיצוצים נוספים אלה בכמוסת העדשה הקדמית ליצור explant כוכבים צורת העדשה הפצועה עם הפצע העגול נוצר על ידי הסרת מסת תאי סיבים בCENter של explant (איור 1). ניתוח והשטחה של הרקמות לאחר קטרקט, האפיתל נפצע ממוקם בנקודות של הכוכב, שנקרא הקובץ המצורף המקורי האזור (OAZ) (איור 1 א ', ב').
הסרת מסת תאי סיבים מהאתר המצורף בכמוסת העדשה האחורית יוצרת אזור מאוד לשחזור פצע על הקרום במרתף, מוקף באפיתל נפצע (איור 1, ג). הקצה החשוף של האפיתל המשווני העדשה, רק בסמוך למקום שבי תאי הסיבים צורפו, הוא חוד החנית של הפצע. מייד לאחר פציעה, תת-אוכלוסייה של תאי תיקון mesenchymal vimentin עשיר מופעלת ונודדת לשולי הפצע של האפיתל 1. אפיתל העדשה, עם תאי תיקון mesenchymal אלה בקצה המוביל שלהם, במהירות נע על אזור התא ללא של ב אנדוגניכמוסת קרום asement, מרכז הגירת האזור (CMZ), להתחיל ריפוי הפצע. תאי אפיתל העדשה לעבור באופן קולקטיבי, כמו סדין, לCMZ בראשות מנהיג תאי mesenchymal 1, המרחיבים בליטות לאורך המצע ולכוון את תהליך ריפוי הפצע (F igure 1D, 1 וידאו). ריפוי פצעים מתקדם, המשתרע על שטח משמעותי של הפצע (67%) ביום 1 בתרבות (איור 1 ג), ומסתיימת בדרך כלל בתוך 3 ימים בתרבות (איור 1, ג).
הבחנה פיזית ברורה יכולה להתבצע בין אזורי OAZ וCMZ כבר ביום 1, אשר סומן כקמט או קמט בין שני אזורים אלה (איור 2 א, חץ). תופעה זו מספקת קו מנחה שעל ידי להפריד אזורים אלה ב כל נקודה בתהליך ריפוי פצע. בעזרת מלקחיים קנס היטה, התרבויות יכולות להיות מיקרו-גזור לseparאכלתי אזורי OAZ וCMZ כדי לנתח הבדלים מולקולריים בין האזורים אלה שונים (איור 2). זוהי גישה רבת עוצמה שנעשתה שימוש כדי לזהות שינויי הגירה ספציפית הקשורים לפצע-תיקון. בעבר, נמצא כי קיימת עלייה במיקוד ההדבקה קינאז הפעלה (FAK) בתרבויות נפצעו vivo לשעבר במהלך תהליך ריפוי הפצע 5. יש FAK תפקיד מבוסס היטב בתא ההגירה 26-29. היכולת להעשיר לOAZ לעומת CMZ איפשר עכשיו לבחון האם עלייה זו בהפעלת FAK היא ספציפית לאזור CMZ ההגירה הספציפית. במחקר זה, אזורי OAZ וCMZ הופרדו ביום 1 - 3 (לאורך כל תהליך ריפוי הפצע) ונותחו לשינויים ביוכימיים בהפעלת FAK (FAK pY397). התוצאות הראו כי העלייה בהפעלת FAK הייתה קשורה באזור CMZ הגירה הספציפית (איור 2 ג).vivo לשעבר מערכת מודל שתוארה כאן מספקת הזדמנות ייחודית ורבה ערך אשר בלחקור את התוכניות מולקולריות מעורבות בתיאום תהליך תיקון פצע.
איור 1. יצירת מודל vivo לשעבר שבו ללמוד את תהליך ריפוי הפצע בתוך מייקרו-הסביבה המקומית של התאים בתגובה לפציעתם פיזיולוגית. ניתוח קטרקט מוק בוצע על עדשות חומוס E15. מסת תאי עדשת סיבים (הלבנה) מוסרת באמצעות חתך בכמוסה הקדמית על ידי הידרו-elution. תהליך זה משאיר מאחורי תאי אפיתל (ירוקה) שיישארו בחוזקה חסיד לכמוסת העדשה וקרום תא ערומה מרתף (BM) על שתאים יעברו ללרפא את הפצע (). חמישה חתכים נעשים לאפיתל לשטח וליצור כוכב לכת דמוית vivo לשעבר יור (B). תאי אפיתל עדשת השייר שממלאים את הנקודות של הכוכב מכונים את הקובץ המצורף המקורי האזור (OAZ) (A, B). BM הערום על שתאים יעברו נקראים מרכז הגירת האזור (CMZ) (A, B). מייד בתגובה לפציעה, תאים מתחילים לנוע לאזור CMZ על BM-ערום התא (B). אזור הפצע הפתוח הוא לכמת לאורך זמן ב( C). ריפוי פצעים הושלם בדרך כלל על ידי D3 בתרבות (B, C). ב( B, C) T0 מציין זמן של פציעה, D1-3 מציין הימים 1-3. בתוך CMZ, שתי אוכלוסיות של תאים יכולות להיות מכובדות, תאי אפיתל עדשה ותאי מנהיג mesenchymal שלמקם את שולי פצע, הארכת בליטות לאורך המצע (ד '). נתון זה הודפס מMenko et al 23.target = "_ blank"> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. הפרדה של אזורי OAZ וCMZ לזהות שינויי הגירה ספציפית הקשורים לריפוי פצעים. ביום 1, ניתן להבחין אזורי OAZ וCMZ זה מזה בקמט (חץ), שיכול לשמש כמדריך להפריד אזורים אלה (). בקפל זה, ניתן להשתמש במלקחיים קנס היטה לאחיזה בקצה קו OAZ / CMZ. התרבות יכולה להיות מופרדת לאורך קו זה מאפשר בידוד של אזורי OAZ וCMZ (B). מיקרו-נתיחה של OAZ וCMZ יומי, מיום 1 (D1) - יום 3 (D3) בוצע על מנת לקבוע אם שינויי הגירה ספציפית בהפעלת FAK להתרחש באזור של תיקון פצע. Lysates מכל אזור נבדק על ידי ניתוח המערבי כתם לאו הפעלת FAK (pFAK Y397) או סך הכל ביטוי FAK (C). בעוד שינוי קטן ברמות FAK הכוללת נצפה, עלייה בהפעלת FAK הייתה קשורה באזור ההגירה הספציפית CMZ (C).
וידאו 1. ריפוי פצעים במודל ניתוח קטרקט המדומה לשעבר vivo ואחריו מיקרוסקופיה זמן לשגות מעת 0 לאחר פציעה ועד ליום 3. סגירת פצעים נתפס ממרכז אזור הפצע.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S271-3 | Use at 140 mM in TD Buffer |
| Potassium Chloride (KCl) | Fisher Scientific | P217-500 | Use at 5 mM in TD Buffer |
| Sodium Phosphate (Na2HPO4) | Sigma | S0876 | Use at 0.7 mM in TD Buffer |
| D-glucose (Dextrose) | Fisher Scientific | D16-500 | Use at 0.5 mM in TD Buffer |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-1 | Use at 8.25 mM in TD Buffer |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144-500 | Use to pH TD buffer to 7.4 |
| Media 199 | GIBCO | 11150-059 | |
| L-glutamine | Corning/CellGro | 25-005-CI | Use at 1% in Media199 |
| Penicillin/streptomycin | Corning/CellGro | 30-002-CI | Use at 1% in Media199 |
| 100 mm petri dishes | Fisher Scientific | FB0875711Z | |
| Stericup Filter Unit | Millipore | SCGPU01RE | Use to filter sterilize Media |
| Dumont #5 forceps (need 2) | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| 35 mm Cell Culture Dish | Corning | 430165 | |
| 27 G 1 ml SlipTip with precision glide needle | BD | 309623 | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| Standard Forceps | Fine Science Tools | 91100-12 | |
| Other Items Needed: General dissection instruments, fertile white leghorn chicken eggs, check egg incubator (humidified, 37.7°C), laminar flow hood, binocular stereovision dissecting microscope |
References
- Walker, J. L., et al. Unique precursors for the mesenchymal cells involved in injury response and fibrosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 13730-13735 (2010).
- Friedl, P., Gilmour, D. Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer. Nature reviews. Molecular cell biology. 10, 445-457 (2009).
- Riahi, R., Yang, Y., Zhang, D. D., Wong, P. K. Advances in wound-healing assays for probing collective cell migration. Journal of laboratory automation. 17, 59-65 (2012).
- Khalil, A. A., Friedl, P. Determinants of leader cells in collective cell migration. Integrative biology : quantitative biosciences from nano to macro. 2, 568-574 (2010).
- Walker, J. L., Wolff, I. M., Zhang, L., Menko, A. S. Activation of SRC kinases signals induction of posterior capsule opacification. Investigative ophthalmology & visual science. 48, 2214-2223 (2007).
- Sta Iglesia, D. D., Stepp, M. A. Disruption of the basement membrane after corneal debridement. Investigative ophthalmology & visual science. 41, 1045-1053 (2000).
- Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Brown, M., Stepp, M. A. A mouse model for the study of recurrent corneal epithelial erosions: alpha9beta1 integrin implicated in progression of the disease. Investigative ophthalmology & visual science. 45, 1775-1788 (2004).
- Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Tadvalkar, G., Stepp, M. A. Removal of the basement membrane enhances corneal wound healing. Experimental eye research. 93, 927-936 (2011).
- Stepp, M. A., et al. Wounding the cornea to learn how it heals. Experimental eye research. 121, 178-193 (2014).
- Kuwabara, T., Perkins, D. G., Cogan, D. G. Sliding of the epithelium in experimental corneal wounds. Investigative ophthalmology. 15, 4-14 (1976).
- Sherrard, E. S. The corneal endothelium in vivo: its response to mild trauma. Experimental eye research. 22, 347-357 (1976).
- Stramer, B. M., Zieske, J. D., Jung, J. C., Austin, J. S., Fini, M. E. Molecular mechanisms controlling the fibrotic repair phenotype in cornea: implications for surgical outcomes. Investigative ophthalmology & visual science. 44, 4237-4246 (2003).
- Escamez, M. J., et al. An in vivo model of wound healing in genetically modified skin-humanized mice. The Journal of investigative dermatology. 123, 1182-1191 (2004).
- Werner, S., Breeden, M., Hubner, G., Greenhalgh, D. G., Longaker, M. T. Induction of keratinocyte growth factor expression is reduced and delayed during wound healing in the genetically diabetic mouse. The Journal of investigative dermatology. 103, 469-473 (1994).
- Tarin, D., Croft, C. B. Ultrastructural studies of wound healing in mouse skin. II. Dermo-epidermal interrelationships. Journal of anatomy. 106, 79-91 (1970).
- Croft, C. B., Tarin, D. Ultrastructural studies of wound healing in mouse skin I. Epithelial behaviour. Journal of anatomy. 106, 63-77 (1970).
- Winstanley, E. W. The epithelial reaction in the healing of excised cutaneous wounds in the dog. Journal of comparative pathology. 85, 61-75 (1975).
- Wormstone, I. M., Wride, M. A. The ocular lens: a classic model for development, physiology and disease. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological. 366, 1190-1192 (2011).
- Danysh, B. P., Duncan, M. K.
- Awasthi, N., Guo, S., Wagner, B. J. Posterior capsular opacification: a problem reduced but not yet eradicated. Archives of ophthalmology. 127, 555-562 (2009).
- Walker, T. D. Pharmacological attempts to reduce posterior capsule opacification after cataract surgery--a review. Clinical & experimental ophthalmology. 36, 883-890 (2008).
- Schmidbauer, J. M., et al.
- Menko, A. S., et al. A central role for vimentin in regulating repair function during healing of the lens epithelium. Molecular biology of the cell. 25, 776-790 (2014).
- Chauss, D., et al. Differentiation state-specific mitochondrial dynamic regulatory networks are revealed by global transcriptional analysis of the developing chicken lens. G3 (Bethesda). 4, 1515-1527 (2014).
- Leonard, M., Zhang, L., Bleaken, B. M., Menko, A. S. Distinct roles for N-Cadherin linked c-Src and fyn kinases in lens development. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 242, 469-484 (2013).
- Sieg, D. J., et al. FAK integrates growth-factor and integrin signals to promote cell migration. Nature cell biology. 2, 249-256 (2000).
- Sieg, D. J., Hauck, C. R., Schlaepfer, D. D. Required role of focal adhesion kinase (FAK) for integrin-stimulated cell migration. Journal of cell science. 112 (Pt 16), 2677-2691 (1999).
- Hauck, C. R., Hsia, D. A., Schlaepfer, D. D. The focal adhesion kinase--a regulator of cell migration and invasion). IUBMB life. 53, 115-119 (2002).
- Zhao, X., Guan, J. L. Focal adhesion kinase and its signaling pathways in cell migration and angiogenesis. Advanced drug delivery reviews. 63, 610-615 (2011).
- Menko, A. S., Bleaken, B. M., Walker, J. L. Regional-specific alterations in cell-cell junctions, cytoskeletal networks and myosin-mediated mechanical cues coordinate collectivity of movement of epithelial cells in response to injury. Experimental cell research. 322, 133-148 (2014).
- Martin, P. Wound healing--aiming for perfect skin regeneration. Science. 276, 75-81 (1997).
- Ferguson, M. W., O'Kane, S. Scar-free healing: from embryonic mechanisms to adult therapeutic intervention. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological. 359, 839-850 (2004).
- Redd, M. J., Cooper, L., Wood, W., Stramer, B., Martin, P. Wound healing and inflammation: embryos reveal the way to perfect repair. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological. 359, 777-784 (2004).
- Nodder, S., Martin, P. Wound healing in embryos: a review. Anatomy and embryology. 195, 215-228 (1997).
- Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T.
