המטרה של הווידאו הזה היא להדגים כיצד לבצע מיצוי DNA אוטומטי מהקווים קבוע פורמלין מוטבע פרפין התייחסות (FFPE) סטנדרטיים תא וניתוח אגל דיגיטלי PCR (ddPCR) כדי לזהות מוטציות נדירות בסביבה קלינית. זיהוי מוטציות בדגימות FFPE מדגים את התועלת הקלינית של ddPCR בדגימות FFPE.
ddPCR is a highly sensitive PCR method that utilizes a water-oil emulsion system. Using a droplet generator, an extracted nucleic acid sample is partitioned into ~20,000 nano-sized, water-in-oil droplets, and PCR amplification occurs in individual droplets. The ddPCR approach is in identifying sequence mutations, copy number alterations, and select structural rearrangements involving targeted genes. Here, we demonstrate the use of ddPCR as a powerful technique for precisely quantitating rare BRAF V600E mutations in FFPE reference standard cell lines, which is helpful in identifying individuals with cancer. In conclusion, ddPCR technique offers the potential to precisely profile the specific rare mutations in different genes in various types of FFPE samples.
ההצטברות של מוטציות גנטיות בגנים רגולטורי מפתח משנה תיכנות תא נורמליות כמו התפשטות תאים, התמיינות, והישרדות, שמוביל לסרטן 1. מסלול קינאז RAS-RAF-MAP מתווך תגובות הסלולר לאותות צמיחה. מוטציות הסרטניות BRAF יכולות לנבוע ממוטציות נהג בגן BRAF, שעלול לגרום לBRAF oncoprotein להפוך פעיל יתר על המידה 2. מוטציות בגן BRAF גם לגרום לאיתות במורד הזרם פעיל יתר על המידה באמצעות MEK וERK 3, אשר, בתורו, מוביל לצמיחת תאים מופרזת והפצה עצמאית של רגולציה בתיווך גורם גדילת 4-6.
מספר כלים זמינים לפרופיל המוטציה בדנ"א, כגון מוטציות V600E BRAF כמותית בזמן אמת ב, קווים קבוע פורמלין מוטבע פרפין התייחסות (FFPE) סטנדרטיים תא על ידי ddPCR. ddPCR היא שיטת PCR מבוסס לכימות מוחלטתמציע דיוק גבוה יותר בהשוואה לזמן האמיתי קונבנציונלי PCR (qPCR) 7,8. ddPCR מספק גם גבוה יותר פתרון כוח ודיוק לגילוי מוטציות נדירות בתבניות DNA, המאפשר חקר סרטן יותר אינפורמטיבי ואבחון 9. יתרונות נוספים של ddPCR על qPCR הקונבנציונלי כוללים רגישות משופרת שלה ודיוק כאשר לומדים מספרי עותק תבנית נמוכה 10-12. במסמך זה, באופן אוטומטי לפרוטוקול חילוץ DNA מהקווים התייחסות FFPE סטנדרטי תא, ואחרי קביעת קיומו או העדרו של מוטציות BRAF V600E ידי ddPCR הוא הוכיח. השימוש בתוכנה לניתוח נתונים וייצוג גרפי של התוצאות גם מתואר. כל ההליך הוא פשוט יחסית ולגמרי תלוי במספר הדגימות שצדודית ומספר מכונות PCR וddPCR קונבנציונליים זמין.
הפרוטוקול הבא מתאר נהלים סטנדרטיים לBR קווי AF-V600E חיובי התייחסות FFPE סטנדרטי תא (HD598, HD593, HD617, HD273 וwildtype (WT)) מתבצע במכשיר אוטומטי לחלוטין באמצעות פרוטוקול רקמות הכנת המערכת (תב"ע). בהמשך לכך, דגימות DNA מבודדות מנותחות לנוכחות מוטציות BRAF V600E באמצעות מערכת ddPCR. ניתוח מוטציה ממוקד מתבצע לאחר כל הדגימות כבר צדודית ונתונים כבר נטענו לתוך תוכנת ניתוח נתונים. תלוי במספר דגימות / קבוצות למדו, ניתוח נתונים עשוי לדרוש מאחד לכמה שעות. הרכיב הניסיוני של המתודולוגיה דורש דיוק בטיפול ב- DNA ובית דגן מטפטף וPipettors, וידאו חינוך מדע יופיטר להסביר יותר על אודות ההקשר של pipetting "> pipetting לתוך 96 צלחות גם, תוך ניתוח נתונים נעשה באמצעות תוכנה.
כאן, אנו מדגישים את תחולתו של ddPCR ובידוד DNA מדגימות שורת תאים סטנדרטי התייחסות FFPE להערכת מוטציה הגנטית ספציפית. במחקר זה, שיטת בידוד תב"ע האוטומטית DNA משמשת שניתן להתאים בקלות, אוטומטי, ויכולה להכיל עד 48 מדגמים שונים בו זמנית, מה שמאפשר לניסויים בקנה מידה גדולים יותר …
The authors have nothing to disclose.
מחקר זה נתמך על ידי תכנית המחקר ופיתוח לחברה של קרן המחקר הלאומית (NRF), ממומנת על ידי משרד המדע, טכנולוגיות מידע ותקשורת ותכנון עתידי (מענק מס '2013M3C8A1075908).
Hamilton MICROLAB STARlet IVD instrument | Siemens | 10701001 | Automated DNA isolation instrument |
QX200 Droplet Generator | Bio-Rad | 772BR1119 | |
QX200 Droplet Reader | Bio-Rad | 771BR1497 | |
Conventional PCR machine capable of ramp-time adjustment | 621BR17718 | ||
PX1 PCR plate sealer | Bio-Rad | 770BR1575 | |
QuantaSoft software | Bio-Rad | ||
DNA isolation kit | |||
VERSANT Tissue Preparation Reagents Box 1 | Siemens | 10632398 | |
VERSANT Tissue Preparation Reagents Box 1 | Siemens | 10632399 | |
CO-RE tips | Siemens | ||
ddPCR mutation analysis | |||
ddPCR Supermix | Bio-Rad | BR186-3010 | 2X concentration |
DG8 cartridge | Bio-Rad | BR186-4008 | |
Droplet Generator oil | Bio-Rad | BR-186-3005 | |
Gasket | Bio-Rad | BR186-3006 | |
Droplet reader oil | Bio-Rad | BR-186-3004 |