Анти-вирулентных Срыв патогенных биопленки с помощью конструктивных Кворум-тушения Lactonases
Summary
Quorum-quenching enzymes are anti-virulent and anti-bacterial options that can mitigate pathogenesis without risk of incurring resistance, by preventing the expression of virulence factors and genes associated with antibiotic resistance and biofilm formation. In this study, we report a method that demonstrates the efficacy of quorum-quenching enzymes in bacterial biofilm disruption.
Abstract
The rapid emergence of multi-drug resistant bacteria has accelerated the need for novel therapeutic approaches to counter life-threatening infections. The persistence of bacterial infection is often associated with quorum-sensing-mediated biofilm formation. Thus, the disruption of this signaling circuit presents an attractive anti-virulence strategy. Quorum-quenching lactonases have been reported to be effective disrupters of quorum-sensing circuits. However, there have been very few reports of the effective use of these enzymes in disrupting bacterial biofilm formation. This protocol describes a method to disrupt biofilm formation in a clinically relevant A. baumannii S1 strain through the use of an engineered quorum-quenching lactonase. Acinetobacter baumannii is a major human pathogen implicated in serious hospital-acquired infections globally and its virulence is attributed predominantly to its biofilm’s tenacity. The engineered lactonase treatment achieved significant A. baumannii S1 biofilm reduction. This study also showed the possibility of using engineered quorum-quenching enzymes in future treatment of biofilm-mediated bacterial diseases. Lastly, the method may be used to evaluate the competency of promising quorum-quenching enzymes.
Introduction
Варианты лечения инфекционных заболеваний осложняется быстрым ростом множественной лекарственной устойчивостью бактерий, которые устойчивы к широкому спектру антибиотиков 1. С высокой заболеваемости и смертности от устойчивых бактерий-опосредованные инфекции, существует необходимость эскалации процессов развития наркотиков и / или исследовать более антибактериальными альтернативы для улучшения терапевтических возможностей. В последнее время, подход анти-вирулентность набирает интерес, учитывая его потенциал в предотвращении вирулентность не через бактерицидные методы, следовательно, смягчению рисков механизмов сопротивления 2.
Кворум зондирования является «главный выключатель" в бактериальной вирулентности и нарушение этого явления сигнализации является перспективным методом борьбы с вирулентность против патогенезе 3. Наступление вирулентности требует накопления кворума молекул в внеклеточной среде после критического бактериального плотность населения достигается. Как-квоМолекулы ром диффундируют обратно в внутриклеточного матрикса, связывание с их родственными рецепторами приводит к активации факторов вирулентности, а также генов, ассоциированных с устойчивостью к антибиотикам и биопленки 4. В общем, нарушение кворума зондирования включает ингибирование кворума молекулу и взаимодействие рецептора, не затрагивая основных метаболических путей. Следовательно, он не имеет никакого прямого последствия на рост клеток. Так фитнес не будет нарушена, есть минимальное давление отбора для бактерий развиваться и сопротивление против таких методов лечения 5 получить. Кроме того, нарушение кворума зондирования может мешать присущих бактериальных защитных механизмов, как в случае образования биопленки, который обеспечивает защиту от антибактериальных агентов и иммунного ответа.
Считается, что 99% микробов на Земле существуют в сложных биопленки, как матриц, присвоении важные преимущества выживания для микроорганизмов, обитающих внутри йESE структуры 6. Что еще более важно, формирование этих сидячих доменов является причиной самых упорных и хронических внутрибольничных инфекций 7. Acinetobacter baumannii является одним из основных человеческих патогенов, что связано с глобальными внутрибольничных инфекций и его вирулентность в значительной степени объясняется кворума зондирования -опосредованной образование биопленки 8. Кворум-тушения ферменты были успешно использованы в срыве кворума опосредованной трансдукции сигнала от ориентации группу соединений, известных как N-ацил гомосериндегидрогеназу лактонов (AHLs), которые производятся грамотрицательных бактерий 9. Несколько исследований также расширены с использованием этих ферментов блокировать бактериальный патогенез путем уменьшения экспрессии фактором вирулентности и клеточных чисел в биопленок 10,11. К сожалению, остается отсутствие ощутимой демонстрацией эффективного использования кворума закалки ферментов против образования биопленки бактериальными патогенами.Re были попытки использовать ингибиторы кворума (AHL), аналоги вместо кворума закалки ферменты, чтобы сорвать А. baumannii образование биопленки 12. Хотя этот метод с использованием ингибиторов малых молекул является действительным подход, поддерживая его биодоступность в трансляционных использования может быть проблемой. Напротив, использование каталитических кворумных закалки ферментов может обойти проблему биодоступность, как ферменты более пригодными в сторону иммобилизации на поверхности биомедицинских устройств для терапевтического воздействия.
Здесь мы опишем оценку последствий инженерных кворума закалки lactonases из Geobacillus kaustophilus (ГКЛ) 13 об образовании бактериальной биопленки, используя кристалл фиолетовый окрашивание и конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (CLSM). Это исследование является первым успешная демонстрация нарушения биопленки в клинически значимых А. baumannii S1 напряжение с помощью кворума закалки ферменты. Описанные методыв данном исследовании являются полезными для оценки эффективности других кворума закалки ферментов в последующих терапевтических усилий в области развития против патогенных грамотрицательных бактерий.
Protocol
Representative Results
Discussion
В обоих наборов эксперимента А. baumannii S1 культивировали в LB среде без NaCl в высокой концентрации соли может уменьшить количество биопленки, образованную бактерий 15. Наличие такого артефакта может недооценивать количество биопленки, образованный, а также эффекты кворумных зак?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by grants from the Academic Research Fund of the Ministry of Education, and the National Medical Research Council and the National Research Foundation, Singapore.
Materials
| Tryptone | BD | 211705 | |
| Yeast Extract | BD | 212750 | |
| 96-well plate | Costar | 3596 | |
| Crystal Violet | Sigma-Aldrich | C6158 | |
| Acetic Acid | Lab-Scan | PLA00654X | Caution: Flammable |
| μ-Dish | Ibidi | 80136 | |
| Alex Fluo 488-conjugated WGA | Invitrogen | W11261 | |
| Hank’s balanced salt solution | Invitrogen | 141475095 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Caution: Corrosive |
| Synergy HT Microplate Reader | BioTek | ||
| 1X-81 Inverted Fluorescence Microscope | Olympus |
References
- Alanis, A. J. Resistance to antibiotics: are we in the post-antibiotic era?. Archives of medical research. 36, 697-705 (2005).
- Cegelski, L., Marshall, G. R., Eldridge, G. R., Hultgren, S. J. The biology and future prospects of antivirulence therapies. Nature reviews. Microbiology. 6, 17-27 (2008).
- LaSarre, B., Federle, M. J. Exploiting quorum sensing to confuse bacterial pathogens. Microbiology and molecular biology reviews : MMBR. 77, 73-111 (2013).
- Waters, C. M., Bassler, B. L. Quorum sensing: cell-to-cell communication in bacteria. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 21, 319-346 (2005).
- Rasko, D. A., Sperandio, V. Anti-virulence strategies to combat bacteria-mediated disease. Nature reviews. Drug discovery. 9, 117-128 (2010).
- Lazar, V. Quorum sensing in biofilms–how to destroy the bacterial citadels or their cohesion/power?. Anaerobe. 17, 280-285 (2011).
- Costerton, J. W. Bacterial Biofilms: A Common Cause of Persistent Infections. Science. 284, 1318-1322 (1999).
- Perez, F., et al. Global challenge of multidrug-resistant Acinetobacter baumannii. Antimicrob Agents Chemother. 51, 3471-3484 (2007).
- Tay, S. B., Yew, W. S. Development of quorum-based anti-virulence therapeutics targeting Gram-negative bacterial pathogens. International journal of molecular sciences. 14, 16570-16599 (2013).
- Igarashi, J., Suga, H., Rumbaugh, K. P. Ch. 19. Quorum Sensing. 692, 265-274 (2011).
- Ng, F. S., Wright, D. M., Seah, S. Y. Characterization of a phosphotriesterase-like lactonase from Sulfolobus solfataricus and its immobilization for disruption of quorum sensing. Applied and environmental microbiology. 77, 1181-1186 (2011).
- Stacy, D. M., Welsh, M. A., Rather, P. N., Blackwell, H. E. Attenuation of quorum sensing in the pathogen Acinetobacter baumannii using non-native N-Acyl homoserine lactones. ACS chemical biology. 7, 1719-1728 (2012).
- Chow, J. Y., et al. Directed evolution of a thermostable quorum-quenching lactonase from the amidohydrolase superfamily. The Journal of biological chemistry. 285, 40911-40920 (2010).
- Chow, J. Y., Yang, Y., Tay, S. B., Chua, K. L., Yew, W. S. Disruption of biofilm formation by the human pathogen Acinetobacter baumannii using engineered quorum-quenching lactonases. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58, 1802-1805 (2014).
- Pour, N. K., et al. Biofilm formation by Acinetobacter baumannii strains isolated from urinary tract infection and urinary catheters. FEMS immunology and medical microbiology. 62, 328-338 (2011).
