Anti-virulente Verstoring van pathogene biofilms met Engineered Quorum-blussen Lactonases

Summary

Quorum-quenching enzymes are anti-virulent and anti-bacterial options that can mitigate pathogenesis without risk of incurring resistance, by preventing the expression of virulence factors and genes associated with antibiotic resistance and biofilm formation. In this study, we report a method that demonstrates the efficacy of quorum-quenching enzymes in bacterial biofilm disruption.

Abstract

The rapid emergence of multi-drug resistant bacteria has accelerated the need for novel therapeutic approaches to counter life-threatening infections. The persistence of bacterial infection is often associated with quorum-sensing-mediated biofilm formation. Thus, the disruption of this signaling circuit presents an attractive anti-virulence strategy. Quorum-quenching lactonases have been reported to be effective disrupters of quorum-sensing circuits. However, there have been very few reports of the effective use of these enzymes in disrupting bacterial biofilm formation. This protocol describes a method to disrupt biofilm formation in a clinically relevant A. baumannii S1 strain through the use of an engineered quorum-quenching lactonase. Acinetobacter baumannii is a major human pathogen implicated in serious hospital-acquired infections globally and its virulence is attributed predominantly to its biofilm’s tenacity. The engineered lactonase treatment achieved significant A. baumannii S1 biofilm reduction. This study also showed the possibility of using engineered quorum-quenching enzymes in future treatment of biofilm-mediated bacterial diseases. Lastly, the method may be used to evaluate the competency of promising quorum-quenching enzymes.

Introduction

Behandelingsopties voor infectieziekten zijn gecompliceerd door de snelle toename van multiresistente bacteriën die immuun zijn voor een breed scala van antibiotica ¹ zijn. Met een hoge morbiditeit en mortaliteit van resistente bacteriën veroorzaakte infecties, bestaat er behoefte aan de ontwikkeling van geneesmiddelen processen escaleren en / of zoeken naar betere anti-bacteriële alternatieven voor therapeutische opties te verbeteren. De laatste tijd is de anti-virulentie benadering wint belang gezien de mogelijkheden in het voorkomen van virulentie via niet-bacteriedodende methoden, vandaar het verminderen van de risico's van resistentie mechanismen ^2.

Quorum-sensing is een 'hoofdschakelaar' in bacteriële virulentie en verstoring van deze signalering fenomeen is een veelbelovende anti-virulentie methode tegen pathogenese ^3. Het begin van virulentie vereist de accumulatie van quorum moleculen in de extracellulaire omgeving na een kritische bacteriepopulatie dichtheid wordt bereikt. Zoals quorum diffunderen terug in de intracellulaire matrix binden aan hun verwante receptors leidt tot de activering van virulentiefactoren en genen geassocieerd met resistentie tegen antibiotica en biofilmvorming ^4. In het algemeen, quorum-sensing verstoring gaat remmen quorum molecuul en receptor interactie zonder dat primaire metabole routes. Daarom heeft het geen directe implicaties voor cellulaire groei. Omdat geschiktheid niet wordt aangetast, er minimale selectiedruk bacteriën evolueren en weerstand tegen dergelijke behandelingen ⁵ krijgen. Bovendien kunnen quorum-sensing verstoring verstoren inherent bacteriële beschermingsmechanismen zoals bij biofilmvorming, die bescherming tegen antibacteriële middelen verschaft en gastheer immuunreacties.

Geschat wordt dat 99% van de microben op aarde bestaat in complexe biofilm-achtige matrices, verleent cruciaal overleving voordelen voor de micro-organismen die binnen these structuren ^6. Belangrijker vorming van deze sessiele domeinen is de oorzaak van de meeste hardnekkige en chronische ziekenhuisinfecties ^7. Acinetobacter baumannii is een van de belangrijkste menselijke pathogenen die verband houden met globale ziekenhuisinfecties en de virulentie is grotendeels toegeschreven aan quorum-sensing gemedieerde biofilmvorming ^8. Quorum-quenching enzymen zijn met succes gebruikt bij het ​​verstoren van quorum-gemedieerde signaaltransductie door zich te richten een groep van verbindingen bekend als N-acyl homoserine lactonen (AHL's) die worden gevormd door Gram-negatieve bacteriën ^9. Verschillende studies hebben ook uitgebreid op het gebruik van deze enzymen om bacteriële pathogenese te blokkeren door de vermindering van virulentiefactor expressie en celaantallen in biofilms ^10,11. Helaas blijft er een gebrek aan tastbare demonstratie van het effectieve gebruik van quorum quenching enzymen tegen biofilmvorming door bacteriële pathogenen. Dere pogingen om quorum remmers (AHL-analoga), in plaats van quorum-quenching enzymen, A. verstoren geweest baumannii biofilmvorming ^12. Hoewel deze methode van het gebruik van kleine moleculen remmers is een geldig aanpak, het behoud van de biologische beschikbaarheid in translationeel toepassingen kan een uitdaging zijn. Daarentegen kan het gebruik van katalytische-quorum quenching enzymen de biobeschikbaarheid probleem omzeilen enzymen ontvankelijker richting immobilisatie op oppervlakken van biomedische inrichtingen voor therapeutische effecten.

Hier beschrijven we een beoordeling van de effecten van gemanipuleerde-quorum blussen lactonases van Geobacillus kaustophilus (GKL) ¹³ op bacteriële biofilmvorming, met behulp van kristalviolet kleuring en confocale laser scanning microscopie (CLSM). Deze studie is de eerste succesvolle demonstratie van biofilm verstoring in een klinisch relevante A. baumannii S1 stam met behulp van quorum-blussen enzymen. De werkwijzen beschrevenin deze studie zijn bruikbaar voor het beoordelen van de werkzaamheid van andere quorum quenching enzymen in latere therapeutische ontwikkelingsinspanningen tegen pathogene Gram-negatieve bacteriën.

Protocol

1. Crystal Violet kwantificering van Biofilm Formation in A. baumannii S1 Groeien een cultuur 5 ml van A. baumannii S1 lysogenie bouillon (LB) (trypton 10 g / l, gistextract 5 g / l) bij 30 ° C in een schudincubator (220 rpm) gedurende 16 uur. Pas de cultuur van A. baumannii S1 een gewenste OD 600 van 0,8. Met behulp van een 96-wells plaat, beënt de bacteriecultuur (1: 100 verdunning) in vers LB dat 10 ui gezuiverd GKL enzym (40 mg / ml); uiteindelijke volume …

Representative Results

In het kristal violet kwantificering experiment werden twee quorum-blussen enzymen die worden gebruikt om de haalbaarheid aan te tonen in het verstoren van biofilmvorming: wild-type GKL en een verbeterde GKL dubbele mutant (E101G / R230C). Beide enzymen bleken lactonase-activiteit vertonen tegen 3-hydroxy-decanoyl-L-homoserinelacton (3-OH-C 10 -HSL), grote quorum molecuul gebruikt door A. baumannii S1 14. Voor geldige beoordeling van de biofilm verstoring, …

Discussion

In beide reeksen experiment A. baumannii S1 werd gekweekt in LB-medium zonder NaCl als een hoge zoutconcentratie kan de hoeveelheid biofilm gevormd door de bacteriën ¹⁵ te verminderen. De aanwezigheid van dergelijke artefact zou de hoeveelheid biofilm gevormd, evenals de effecten van quorum quenching enzymen in verschillende behandelingsomstandigheden onderschat. Het gebruik van een katalytisch inactieve enzym belangrijk als een negatieve controle de mogelijke effecten enzym sekwestratie elimineren….

Materials

Tryptone	BD	211705
Yeast Extract	BD	212750
96-well plate	Costar	3596
Crystal Violet	Sigma-Aldrich	C6158
Acetic Acid	Lab-Scan	PLA00654X	Caution: Flammable
μ-Dish	Ibidi	80136
Alex Fluo 488-conjugated WGA	Invitrogen	W11261
Hank’s balanced salt solution	Invitrogen	141475095
Formaldehyde	Sigma-Aldrich	F8775	Caution: Corrosive
Synergy HT Microplate Reader	BioTek
1X-81 Inverted Fluorescence Microscope	Olympus