Abstract
Das Verhalten des Richtzellmigration unter einem elektrischen Gleichstromfeld (dcEF) als Elektrotaxis bezeichnet. Die bedeutende Rolle von physiologischen dcEF in Führungszellbewegung während der Embryonalentwicklung, Zelldifferenzierung und bei der Wundheilung wurde in vielen Studien gezeigt worden. Durch Anlegen Mikrofluidik-Chips mit einem electro Assay wird der Untersuchungsprozess verkürzt und experimentelle Fehler minimiert werden. In den letzten Jahren mikrofluidischen Vorrichtungen Polymersubstanzen (beispielsweise Polymethylmethacrylat, PMMA, oder Acryl) oder Polydimethylsiloxan (PDMS) wurden weithin bei der Untersuchung der Reaktionen von Zellen auf eine elektrische Stimulation verwendet wird. Im Gegensatz zu den zahlreichen Schritte erforderlich, um eine PDMS-Gerät herzustellen, macht jedoch den einfachen und schnellen Aufbau der Acrylmikro fluidischen Chip ist für beide Geräte Prototyping und die Produktion geeignet. Die effiziente Untersuchung der simultanen chemischen und dcE noch keiner der gemeldeten Geräten erleichternF Wirkungen auf Zellen. In diesem Bericht beschreiben wir unsere Konstruktion und Herstellung eines Acrylbasierten Multichannel-Dual-elektrischen Feldes (MDF) Chip, um die gleichzeitige Wirkung der chemischen und elektrischen Stimulation auf Lungenkrebszellen zu untersuchen. Die MDF-Chip bietet acht Kombinationen von elektrischen / chemischen Reize in einem einzigen Test. Der Chip nicht nur stark verkürzt die erforderliche Versuchszeit, sondern erhöht auch die Genauigkeit in electro Studien.
Introduction
Das Verhalten von adhärenten Zellen sich in Richtung einer Anode oder Kathode unter einem elektrischen Gleichstromfeld (dcEF) als Elektrotaxis bezeichnet. Die electrotactic Verhalten von Zellen spielt eine wichtige Rolle in der Embryogenese, die Nervenregeneration und Wundheilung. 1-Tumorzellen wie Ratte Prostatakrebszellen, Brustkrebszellen, 2, 3 und Lungenadenokarzinomzellen 4-8 haben electrotactic Bewegung unter einem angelegten dcEF gezeigten . Die physiologische EF in Drüsengeweben gemessen. 9,10 electro wurde auch in Drüse assoziierten Tumorzellen berichtet. 2,3 Zusammen bilden die Elektrotaxis von Krebszellen wird als Metastasierung Faktor. 11 Steuerung der elektrischen Leitung von Krebszellen unter dcEF kann ein möglicher Ansatz für die zukünftige Behandlung von Krebs. Heute bleibt jedoch die detaillierte molekulare Mechanismus electro umstritten. Daher eine Untersuchung der influence der elektrischen Stimulation auf Krebszellmigration können die Entwicklung von Strategien für die Krebsbehandlung zu erleichtern.
Vor kurzem haben Bio-Mikrofluidik-Vorrichtungen für die Untersuchung zellulärer Reaktionen in vitro fließen Scherkraft, 12 chemische Gradienten, 13 und elektrische Reize 4 hergestellt worden. Die Herstellung von Bio-Mikrofluidik-Vorrichtungen mit Polydimethylsiloxan (PDMS) oder Polymethylmethacrylat (PMMA, als Acryl bekannt) erfolgreich verringert die Ausfallrate solcher Experimente. Darüber hinaus mit Acrylbasis mikrofluidischen Vorrichtungen als Prototyp für die Untersuchung von biologischen Fächern ist einfacher als mit PDMS-Chips. Verschiedene Funktionen in Acrylbasis Geräte sind für die Elektrotaxis Studie entwickelt. Jedoch keine der vorgenannten Ausführungen sind in der Lage, gleichzeitig zu testen, die Auswirkungen von verschiedenen chemischen Bedingungen und die elektrische Feld auf Zellen für electro Studie. So eine Mikrofluidikvorrichtung-MU entwickelten wirltichannel Dual-elektrischen Feldes (MDF) Chip-haltigen vier unabhängige Kulturkanäle und acht verschiedenen experimentellen Bedingungen in einem Chip.
Die auf Acrylbasis MDF-Chip, die zuerst von Hou et al berichtet., 8 integriert elektrische Stimulation und mehrere chemisch getrennte Kanäle. Diese chemisch isoliert Kanäle können zur Kultur verschiedene Arten von Zellen in einem Experiment verwendet werden. Die dcEF in den Kanälen wird durch eine elektrische Stromversorgung hergestellt wird. Zwei unabhängige elektrische Felder, eine mit angelegten elektrischen Feldstärke (EFS) und ein weiteres mit 0 EFS, sind in jedem chemisch isolierten Kanal durchgeführt. Auf diese Weise bietet der Chip besser gesteuert koexistierenden EF und chemische Stimulation. Ferner ergibt sich aus der numerischen Simulation der chemischen Diffusion innerhalb der MDF-Chips anzuzeigen, dass keine Kontamination zwischen den Kanälen nach 24 h Versuchsdauer aufgetreten. 8
Gegenüber dem Device von Li berichtet, et al., bietet 14 der MDF-Chip einen größeren Kulturbereich, der für die weitere biochemische Analyse der elektrisch stimulierten Zellen ermöglicht. Zusätzlich mit größeren Beobachtungsbereich der MDF-Chips, mehr Zellen können in dem Test beobachtet werden, so dass die Analyse der Migrationsgeschwindigkeit bzw. Gerichtetheit der elektrisch stimulierten Zellen ist genauer. Einkanal-Chip-Designs früherer Studien von Huang et al. 4 und Tsai et al. 15 berichtet erlauben nur einen Zelltyp oder zu testenden Chemikalie. Jedoch kann die MDF-Chip verwendet, um die Wirkungen von verschiedenen Chemikalien auf electro sowie die Wirkungen der elektrischen Stimulation auf verschiedenen Zelltypen zu untersuchen. Mit anderen Worten ermöglicht die effiziente Untersuchung von chemischen Dosis Abhängigkeiten der MDF-Chip.
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Protocol
1. Konstruktion und Herstellung der MDF-Chip
- Zeichnen Sie einen individuellen Acrylschicht Muster unter Verwendung kommerzieller Software wie AutoCAD, und speichern Sie das Muster.
- Überprüfen Sie die Gestaltung des Vier-Schicht-Acrylglas-Muster in 1A und bestätigen Sie die Durchkontaktierungen.
- Herzustellen alle Acrylglasplatten und das doppelseitige Klebeband durch Laserablation unter Verwendung eines CO 2 -Lasers scriber (1B, 2A und 2B). 16
- Schalten Sie den Laser-Anreißer und schließen Sie das Gerät an die Steuerung Laptop.
- Führen Sie das kommerzielle Software und öffnen Sie das Muster in Schritt 1.1 ausgelegt, indem Sie auf "konzipiert Pattern-Datei."
- Legen Sie ein Stück leere Acrylglas oder doppelseitigen Klebeband auf der XYZ-Bühne des Laser-Anreißer.
- Einstellen des Fokus des Laserstrahls auf der Oberfläche der Acrylfolie oder doppelseitiges Klebeband mit einem Auto-alignment-Stick vom Hersteller des Laserreißnadel vorgesehen.
- Senden die entworfenen Muster zum Laserritz zur direkten Bearbeitung der Acrylglasplatte oder doppelseitiges Klebeband.
- Entfernen Sie das Schutzpapier von der Acrylglasplatten mit einer Pinzette und blasen die Oberfläche sauber mit Stickstoffgas.
- Ablegen der Acrylplatten und miteinander zu verbinden unter einem Druck von 2 kg / cm 2 in einem Thermobonder 45 min bei 110 ° C, um den Strom / elektrische Stimulation Kanalanordnung zu bilden.
- Bereiten Sie die Mikroskop-Deckglas als Zellkultursubstrat im Chip.
- Legen Sie das Deckglas in Küvette und füllen das Glas mit einer zehnfachen Verdünnung des Waschmittels in der Materialliste aufgeführt.
- Legen Sie das Deckglas und Küvette in einem Ultraschall-Steri-Reiniger und reinigen Sie das Deckglas 15 min.
- Gießen Sie die verdünnten Reinigungsmittel aus der Küvette füllen Sie das Gefäß mit destilliertem Wasser, und wiederholen Sie Schritt 1.5.2 3 mal.
- Trocknen des gereinigten Abdeckglas durch Ausblasen mit Stickstoff, bevor zu dem doppelseitigen Klebeband Ankleben.
- Halten Sie die gereinigte Deckglas auf das Fluss / elektrische Stimulation Kanalanordnung mit dem doppelseitigen Klebeband in Schritt 1.2 gemustert.
- Anhaften 13 Stücke Acryl Adaptoren an die einzelnen Öffnungen in der Schicht 1 der MDF-Chip-Montage mit Sekundenkleber. Die MDF-Chip-Montage ist dann abgeschlossen (2D).
- Sterilisieren Sie die komplette MDF-Chip-Montage mit 30 Minuten der UV-Bestrahlung vor der Verwendung.
2. Einrichten der Salzbrücke Netzwerk der MDF-Chip
- Vor der Verwendung zu sterilisieren alle Kunststoff-Rohre, fingerfest Muttern und Mikrozentrifugenröhrchen in 3B gezeigt ist, durch Einstellen einer Haltezeit von 15 min bei 121 ° C im Autoklaven.
- Schließen Sie die Fluorkunststoffrohre (3B-i) auf die MDF-Chip-Montage über den Mitteleingangund Ausgangsadaptern in 1A gezeigt.
- Verbinden Sie den Luer-Konus des Mediums Einlass- und Auslass-Kunststoffrohre in 3B-i an die 3-Wege-Hähne.
- Nehmen 2,5 ml CO 2 -equilibrated phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) unter Verwendung einer 3 ml-Spritze und verbinden die Spritze mit dem 3-Wege-Hahn des Einlasskunststoffrohr. Schließen Sie eine leere 3-ml-Spritze mit dem 3-Wege-Hahn der Austrittskunststoffrohr. Die beiden Spritzen werden somit durch die MDF-Chip verbunden sind.
HINWEIS: Inkubieren Sie die PBS in der 37 ° C 5% -CO 2 Zellkulturinkubator O / N zu erhalten, CO 2 -equilibrated PBS. - Verschließen Sie die Öffnungen der blauen und der grünen Adapter (Abbildung 1A) auf dem Layer 1 PMMA-Platte mit weißen Festhandfest Muttern (3B-III).
- Füllen Sie die Salzbrücke Kanälen und Kulturkammern mit dem CO 2 -equilibrated PBS in der im Setup-Schritt 2.4 beschrieben Spritze. Vermeidendie Bildung von Blasen.
- Als nächstes setzen Sie den CO 2 -equilibrated PBS-haltigen MDF-Chip in der 37 ° C 5% -CO 2 Zellkulturbrutschrank für O / N Inkubation. Dies ermöglicht die gelöste Luft in dem doppelseitigen Klebeband um Blasen in den Kammern bilden.
- Wegspülen die Blasen in den Kanälen durch eine schnelle PBS Strömung im Kanal mit Hilfe der zwei Spritzen. Pumpen Sie den PBS hin und her, wenn nötig.
- Ablassen PBS in den Kanälen über die 3-Wege-Hahn zum Medium Auslaßrohr verbunden ist.
- Unter Verwendung einer neuen 3-ml-Spritze nehmen 2,5 ml CO 2 -equilibrated Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium (DMEM) (siehe Schritt 3.5), und ersetzen Sie die Spritze mit dem Einlass mit dem neuen verbunden. Füllen Sie die Kanäle mit dem Medium.
- Herstellung der Salzbrücke Netzwerk.
- Zeitlich entfernen Sie die Feststoffmuttern (3B-iii) auf den grünen Adapter (Abbildung 1A) und injizieren 3% heiß (> 70 ° C) Agarose in die Salz briDGE Kanal durch die Öffnung in dem Grün Adaptern (1A).
HINWEIS: Herstellung von heißen Agarose: Man löst 1,5 g Agarose-Pulver in 50 ml PBS. Sterilisieren durch Einstellen einer Haltezeit von 20 min bei 121 ° C im Autoklaven. - Das Einspritzen der Agarose, wenn die Flüssigkeit drei Viertel der Länge des Salzbrückenkanal ausfüllt.
- Versiegeln der Poren auf die grünen Adapter (1A) durch Einschrauben der Feststoffmuttern (3B-iii) nach der Agarose-Injektion.
- Ersetzen Sie die Feststoffmuttern an den blauen Adaptern (Abbildung 1A) mit den durchscheinenden Rohrhandfest Muttern (3B).
- Laden der 3% Agarose in die Rohrmuttern (3B-iv) vorgewärmt.
- Betten Sie die Ag / AgCl-Elektroden (3B-v) in die rohrförmigen Muttern (3B-IV), bevor dieVerfestigung der Agarose.
- Zeitlich entfernen Sie die Feststoffmuttern (3B-iii) auf den grünen Adapter (Abbildung 1A) und injizieren 3% heiß (> 70 ° C) Agarose in die Salz briDGE Kanal durch die Öffnung in dem Grün Adaptern (1A).
- Nach Abschluss der Einrichtung der Salzbrücke Netzwerk, injizieren die CL1-5 Lungenkrebszellen in die Kulturkammern, eine Kammer zu einer Zeit.
3. Herstellung von Krebszellen und zum beliebig Electrotactic Experiment
- Regelmäßige Kultur der Lungenkrebszelllinie CL1-5.
- Kultur die CL1-5 Lungenkrebszellen, von Prof. Pan-Chyr Yang, 17 in der Vollmedium in einem 75T Zellkulturflasche bei 37 erhalten ° C in einem 5% CO 2 Atmosphäre. Der komplette Medium besteht aus DMEM und 10% fötalem Rinderserum (FBS) zusammengesetzt ist. Subkultur der Zellen alle 3 bis 4 Tage. Die zur Durchführung electro Experimenten verwendeten Zellen sind weniger als 25 Passagen von der ursprünglichen Quelle.
- 2 ml 0,25% Trypsin-Puffer auf die exponentiell wachsenden Zellen CL1-5 und Inkubation für 2 min in der 37 ° C 5% -CO 2 Zellkulturbrutschrank zur Zell detachment.
- Beenden des Ablöseprozesses mit 6 ml 10% FBS DMEM und zentrifugiere die Zellen bei 300 g für 5 min bei RT. Dann werfen Sie die mittlere und die Aussetzung der Zellpellet mit 5 ml PBS.
- Zählen die Anzahl von Zellen in der PBS. Dann nehmen Sie 1 x 10 6 Zellen und Zentrifuge bei 300 g für 5 min bei RT.
- Entsorgen Sie die PBS. Aussetzung der Zellen mit vorgewärmtem CO 2 -equilibrated DMEM und stellen Sie die Zelldichte auf 1 × 10 6 Zellen / ml liegen.
HINWEIS: Inkubieren Sie die Vollmedium in der 37 ° C 5% -CO 2 Zellkulturinkubator O / N, um das CO 2 zu erhalten -equilibrated DMEM.
4. Richten Sie für Electrotactic Experiment
- Von dem Auslaß der MDF-Chip injiziert 0,3 ml, 1 × 10 6 / ml, der Zellen in dem Chip.
- Inkubieren Sie die Zellen ausgesät MDF-Chip in der Zellkultur-Inkubator (bei 37 gesetzt ° C und 5% CO 2) für 2-4 Std.
- Setup von MDF MikroFluidsystems.
- Installieren Sie die MDF mikrofluidischen System auf einen transparenten Indiumzinnoxid-Glas (ITO) Heizung. Messen Sie die Temperatur des MDF-Chip mit einer K-Typ-Thermoelement zwischen dem MDF-Chip und dem ITO-Glas abgeschnitten. Steuern Sie die ITO-Heizung mit einer Proportional-Integral-Differential (PID) Steuerung. Stellen Sie die MDF mikrofluidischen System Inkubationstemperatur auf 37 ° C mit dem PID-Regler.
HINWEIS: Die Herstellung des ITO Heizer und der Aufbau der Zellkultur Heizsystem in früheren Berichten beschrieben 18,19. - Montieren Sie den temperaturgesteuerten MDF-Chip-Montage auf der computergesteuerten XYZ Motortisch auf einem inversen Mikroskop. Die Nutzung des motorisierten Stufe wird in Schritt 5.1 beschrieben. Pumpe das Vollmedium in die Kulturkammern durch die Einlässe mit einem Vierkanal-Spritzenpumpe.
- Installieren Sie die MDF mikrofluidischen System auf einen transparenten Indiumzinnoxid-Glas (ITO) Heizung. Messen Sie die Temperatur des MDF-Chip mit einer K-Typ-Thermoelement zwischen dem MDF-Chip und dem ITO-Glas abgeschnitten. Steuern Sie die ITO-Heizung mit einer Proportional-Integral-Differential (PID) Steuerung. Stellen Sie die MDF mikrofluidischen System Inkubationstemperatur auf 37 ° C mit dem PID-Regler.
- Pumpe das Vollmedium in die MDF-Chip mit einer Flussrate von 20 ul / h. Die Kultur Abfälle aus der auslässt sich in den Reaktionsgefäßen (als "Abfall" in 3A gezeigt) gesammelt.
- Die Zellen für weitere 16-18 h bei 37 ° C in der MDF-Chip.
- Um das Medium zu ersetzen, die Pumpe das Medium, das 50, 25, 5 und 0 & mgr; M-Kinase-Inhibitor jeweils in jeder Kulturkammer mit einer Flussrate von 20 ul / min für 10 min.
HINWEIS: Die Herstellung einer 10 mM Stammlösung des Rho-assoziierten Proteinkinaseinhibitor Y27632 durch Zugabe von 3 ml steriles Wasser zu der 10,6 mg-Kinase-Inhibitor. Verdünne die 10 mM Stammlösung zu 50, 25 und 5 & mgr; M unter Verwendung von 10% FBS DMEM Medium. - Die Zellen in der Kinase-Inhibitor zur weiteren 60 min bei 37 ° C. Stellen Sie den mittleren Strömungsgeschwindigkeit auf 20 & mgr; l / h. Verwenden Sie die gleiche Kultur Temperatur und Strömungs oben in späteren Schritten beschrieben Rate.
- Verwenden elektrischer Drähte an eine Gleichstromversorgung an die MDF-Chip über die Ag / AgCl-Elektroden, die auf dem Chip zu verbinden.
- Seriell verbinden ein Amperemeter in die elektrische Schaltung. Verwenden Sie das Amperemeter, um den elektrischen Strom in der MDF-Chips überwachen.
- Schalten Sie die DC-Stromversorgung und den Strommesser Strom um 86,94 & mgr; A durch Einstellen der Stromversorgungsspannung zwischen 15 und 19 V.
BEMERKUNG: Die Größe des Ohmschen Gesetzes, E = I / (& Sgr; A eff), wobei I der elektrische Strom durch das Schüttgut strömt, dh das Kulturmedium in electrotactic Kammer, σ (= 1,38 Ω -1 m - 1) ist das Leitfähigkeit des Kulturmediums A eff (= 0,21 mm 2 für eine 3 mm Breite · 0,07 mm Höhe) ist die effektive Querschnittsfläche des electrotactic Kammer und der elektrische Strom (I) erforderlich, um eine 300 mV / mm erzeugen EF in der MDF-Chip ist 86,94 & mgr; A.
5. Aufnahme und Analyse von Zellbildern
- Steuern Sie den Motortisch mit Hilfe eines MATLAB GUI-Programm. Mit der MDF mikrofluidischen System auf der microsco montiertpe, bewegen Sie den Chip an den Beobachtungsbereichen mit Hilfe der motorisierten Bühne.
- Rekordzelle Bilder mit einem digitalen Spiegelreflex (SLR) am Mikroskop montiert.
- Nehmen mikroskopischen Bildern mit einem 4X Objektiv in Intervallen von 15 min für 2 Stunden.
- Zellmigration Analyse.
- Führen NIH ImageJ 1,47 V.
- Analyse der Abstand von der Anfangs- in die Endstellung des Schwerpunkts der Zelle.
- Gehen Sie auf "Datei" → "Import" → "Bildsequenz", und importieren Sie neun Bilder für Zellmigration Analyse. Das erste Bild ist das Ergebnis der Zeit Null, und das letzte Bild ist das Ergebnis von 120 min.
- Gehen Sie auf "Analyze" → "Messungen" und aktivieren Sie das Kontrollkästchen neben "Centroid"
- Klicken Sie auf das Symbol "Freihand-Auswahl".
- Stellen den Rand der ausgewählten Zellen in dem ersten Bild.
- Gehen Sie auf "Bearbeiten" → "Auswahl" → "um-Manager hinzufügen"
- Zum neunten Bild und stellen den Rand der gleichen Zellen auf das erste Bild ausgewählt. Die Zellpositionen können mit dem zweiten bis achten Bilder zurückverfolgt werden.
- Gehen Sie auf "Bearbeiten" → "Auswahl" → "um-Manager hinzufügen"
- Die Schritte 5.4.5 bis 5.4.9, um Daten von 90 bis 100 Zellen zu sammeln.
- Gehen Sie auf "Analyze" → "Messen", um das Ergebnis der ersten und letzten Positionen der ausgewählten Zellen zu erhalten.
HINWEIS: Die Migrationsgeschwindigkeit als der durchschnittliche Zellbewegung Länge pro Stunde definiert. Die Gerichtetheit wird als Cosinus, wobei der Winkel zwischen dem Vektor der dcEF (von der Anode zur Kathode) und der Vektor von dem Ausgangspunkt einer Zelle in ihre Endposition definiert. Die Gerichtet -1 ist für Zellen, die Migration in Richtung der Anode und +1 für Zellen migrieren zu der Kathode. Für eine Gruppe der statistisch miGitterzellen, die Gerichtetheit ist 0. 2
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Representative Results
Herstellung und Montage der Vorrichtung MDF
Ein schematisches Diagramm des Acrylbasis MDF-Chip ist in 1A gezeigt. Vier Acrylplatten, einem Deckglas, 13 Acryl Adapter, und ein Stück doppelseitiges Klebeband wurde bei der Montage des fertig gestellten MDF-Chips (2D) verwendet. Es gibt nur vier unabhängige Kulturkanäle in der MDF-Gerät. Jedoch die On-Chip-Salzbrücke Netzwerk erzeugt acht verschiedenen Versuchsbedingungen in der acht Segmente des Chips. Drei Brückenbildung (die blauen Kanäle in der Schicht 2 der Figur 1A), 79, 90 und 80 mm in der Länge, wurden ohne Störung der Bildbeobachtung auf die zweite Schicht des MDF-Chip gekoppelt ist. Die kleinen Poren (blau Quaders Kanäle in den Schichten 3 und 4 der Figur 1A) zwischen der Salzbrückennetzwerk und die Kulturkammern, die eine 0 aufweisen0,25 mm 2 Querschnittsfläche minimiert den Fluidfluss in die Salzbrücke während des Experiments. Der Kulturbereich des MDF-Chip ist etwa 74 mm 2 in jedem Segment. In dieser Demonstration werden die Zellkulturkammern des MDF-Vorrichtung der 70 um dicken doppelseitigem Klebeband und Deckglas besteht. Jedoch, wenn unterschiedliche Zellkulturbedingungen (beispielsweise eine Kollagenbeschichtung Bedarf geringer Strömungsscher oder große Kulturmedium Volumen in der Kulturkammer) zur electro Forschung notwendig, sowohl die Kultursubstrate und die Bänder leicht ausgetauscht werden konnte. Daher können verschiedene Arten von Zellen für electro Studie innerhalb der MDF-Chip verwendet werden.
Konfiguration von MDF mikrofluidischen System
Die MDF mikrofluidischen System-Setup ist in 3A dargestellt. Die in 3B gezeigten Komponenten sind uSed zu Mittelstrom und der elektrische Strom-Netzwerk in der MDF mikrofluidischen System. Die mit den hohlen handfest Muttern (rot und grün) und Luer Kegel (braun) in Abbildung verbundenen Rohren 3B-i verwendet werden, um mittel- bis der MDF Flussnetz zu transportieren. Nachdem die Spritzen an die Luer Kegel verbunden ist und auf das Vierkanal-Pumpe angesiedelt, war die Pipeline-Flow-System abgeschlossen. Kulturmedium und Abfall werden durch die Pipeline System transportiert. Da die Verbindung zwischen den Rohren und Acryl-Adapter werden durch Schraubverbindungen befestigt ist, kann der MDF Medium Netz höhere Hydraulikdruck, als die PDMS-System zu tolerieren. Aufgrund der extrem niedrigen Luftdurchlässigkeit der Acrylglasplatten und den Rohren wird jeder Kontakt zwischen der Mediennetzwerk und der Außenumgebung blockiert. Daher bleibt der pH-Wert des Mediums im System stabil ist, und die Zellen können mit der MDF Mikrofluidiksystem außerhalb einer CO 2 -Inkubator kultiviert werden. Seit der MDF chIP auf einem motorisierten Tisch installiert ist, können Zeitraffer-Zell Bilder von acht Einzelabschnitte genommen werden. Die nach unten offenen Reaktionsgefäßen (3B-ii) auf die lichtdurchlässigen röhrenförmigen fingerfest Muttern (3B-iv) montiert, um die Volumenkapazität Agarose erhöhen. Auf diese Weise können relativ große Elektroden in der Agarose eingesetzt werden, um stabile elektrische Stimulation an die Zellen für längere Zeiträume vorzusehen.
Generation angegebenen elektrischen Gleichstromfeld in der MDF-Chip
Die Spannung jeder Kammer kann über die implantierten Elektroden im Stromkreis geschalteten Chip gemessen werden. Allerdings haben wir nicht die Spannung in der Kammer zu messen. Vielmehr simulierten wir das elektrische Feld in der Salzbrückennetzwerk und die Zellkulturkammern des Chips. Vier electrotactic Kammern waren seriell conin den Stromkreisen verbunden sind. Auf diese Weise wird der gleiche elektrische Strom in jeder dieser Kammern gehalten. Nach dem Ohmschen Gesetz korreliert die EFS mit der Fläche des Querschnitts der Kammern in der Mikrofluidvorrichtung. Zusätzlich wurden alle PMMA-Platten und Bändern, die durch die CO 2 -Laser scriber hergestellt. Die Ausrichtung der Chip-Montagestücke präzise ist und die Strukturfehler des Chips sind minimal. Daher sollten die EFS in jeder Kammer stabil bleiben. Die elektrischen Feldsimulationsergebnisse zeigen, eine homogene Verteilung der EFS mit 300 und 0 mV / mm in den ersten Hälften und die verbleibenden Hälften der Kulturkammern in der Vorrichtung (Daten nicht gezeigt). Zuvor berichtet aus unserem Labor, Huang et al. und Tsai et al., haben gezeigt, dass der Unterschied in der gemessenen und der theoretischen EFS Werte von weniger als 4%. 4,15 Dieses Ergebnis zeigt, daß in unserem System, entspricht das gemessene elektrische Feld gut mit dem simulierten Wert. In diesem work, legten wir großen Ag / AgCl-Elektroden, um eine stabile elektrische Strom über einen längeren Experiment bereitzustellen. Der angelegte Strom auf der MDF-Chip verringert nur 1,85 ± 0,19% nach 7 h EF Stimulation in der electro Experimenten. Darüber hinaus die längste Periode der elektrischen Stimulation wurde 4 Stunden in unserer Studie. Wir glauben daher, die elektrische Eingangsstrom bleibt während electro Tests stabil, und das elektrische Feld in den electrotactic Kammern des MDF-Chip werden durch die in Reihe geschalteten Strommesser überwacht.
Untersuchung der Elektrotaxis von Lungenkrebszellen mit dem MDF mikrofluidischen System
Die electrotactic Regulierung der Rho-assoziierten Coiled-Coil-Kinase (ROCK) wurde in Ovarialzellen des chinesischen Hamsters (CHO), 20 Endothelzellen, 21 und neuronalen Zellen 22 gezeigt, ist jedoch noch nicht für Lungenkrebs c suchtEllen. Daher der ROCK-Inhibitor Y27632, wurde zu der MDF mikrofluidischen System angelegt, um seine Wirkung auf die Elektrotaxis von Lungenkrebs-Zellen untersucht. Wie in Figur 4 gezeigt, Behandlung Y27632 zeigten keinen Effekt bei der Änderung des Zellmigrationsgeschwindigkeit mit oder ohne elektrische Stimulation. Jedoch ist die Anwendung der Y27632, um Krebszellen unter dcEF (300 mV / mm) deutlich reduziert ihre anodischen Migration. Bei 50 & mgr; M-Konzentration, eliminiert die ROCK-Inhibitor die anodische Bewegung der Lungenkrebszellen aber keinen Einfluss auf die Migrationsgeschwindigkeit. Außerdem gab es eine Dosis-abhängige Korrelation zwischen den angewandten chemischen Konzentrationen und der Gerichtetindex (4B). Diese Ergebnisse legen nahe, dass die MDF mikrofluidischen System ist zuverlässig und effizient für das Studium electro.
Abbildung 1. Design der MDF-Chip. (A) Schematische Darstellung des MDF-Chip. Das MDF-Gerät besteht aus vier Schichten von Acrylglasplatten (72 × 50 mm), 13 Acryl Adapter (10 × 10 × 6 mm), doppelseitiges Klebeband und ein Deckglas (24 x 60 mm). Die Dicke der Schicht 2 Acrylplatte beträgt 2 mm und die übrigen drei Schichten sind jeweils 1 mm. In den unteren drei Acrylschichten werden die Salzbrücke und mittlere Strömungsnetze von den blauen und roten Blöcke dargestellt sind. Im ersten Acrylfolienschicht wurden Grünacryl Adapter für die Injektion von Agarose verwendet. Blau Acryl Adapter wurden als Verbindung zu den Ag / AgCl-Elektroden verwendet. Es gibt vier Zellkulturkammern in der MDF-Chip. Die Fläche und die Höhe der einzelnen Zellkulturkammer über 148 mm 2 (3 × 46 mm) und 0,07 mm. Die kleinen blauen Kanal auf den Ebenen 3 und 4 verbinden die Salzbrücke Netzwerk an die Kulturkammern. Der Querschnitt dieser Verbindungskanäle 0,25 mm
Abbildung 2 MDF Chipherstellung und Montageverfahren. (A) Die Muster der Acrylfolie und Doppelklebeband wurden durch CO 2 Laserbearbeitung beschrieben. (B) Die einzelnen Acrylfolie Schichten wurden durch eine CO 2 -Laser gemäß der Konstruktionszeichnung hergestellt. (C) Das gereinigte Acrylglass wurden gebunden zusammen mit einem thermischen Bonder. (D) abgeschlossen MDF-Chip-Montage. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3-System für Elektrotaxis Studie. (A) Schematische Darstellung des Systems für die electro Experiment. Die auf die MDF-Chips verbunden Röhrchen wurden für mittlere Infusions und Abfallauslauf verwendet. Die dcEF im Chip wurde durch die Ag / AgCl-Elektroden und die Stromversorgung durchgeführt. Die Geräte-Setup auf dem XYZ Motortisch eines Mikroskops installiert. Handy-Bilder auf dem Chip wurden von einem kommerziellen digitalen SLR-Kamera gemacht. (B) Lichtbild der Komponenten des Mediums Strömungsnetzwerk und dem dcEF Erzeugung in dem MDF Mikrofluidiksystem, including (i) die Rohrverbinder, (ii) mit offenem Boden Mikrozentrifugenröhrchen, (iii) weißen Feststoff handfest Mutter, (iv) durchscheinenden Rohrhandfest Mutter, und (v) Ag / AgCl-Elektroden. Bitte klicken Sie hier, um vergrößern Version dieser Figur.
Figur 4. Wirkung Y27632 Lungenkrebszellmigration unter den EFS von (A) Null ist und (B) 300 mV / mm. DcEF Stimulation wurde nach einer 1 h Vorbehandlung mit der angegebenen Konzentration an Y27632 aufgetragen. Die elektrische Stimulation dauerte 2 Stunden. Die quantitative Analyse der Gerichtetheit und der Geschwindigkeit der Zellmigration consititute einem repräsentativen Experiment. 90-100 Zellen wurden in der Datenanalyse verwendet. * für P <0,001. Daten sind als Mittelwert ± Standardabweichung ausgedrücktder Mittelwert (SEM). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Wir haben den Prozess der haftenden Acryladapter auf Schicht 1 des MDF-Chip tricky sein. Der Einsatz von nur 1 bis 2 & mgr; l Superkleber ist ausreichend, um fest zu halten den Adapter auf die MDF-Chip. Größere Mengen von Kleber führte zu einer unvollständigen Polymerisation der Superkleber und Misserfolg zu haften. Sobald die Acryl-Adapter wurden fest auf das MDF-Chip geklebt, Flüssigkeitsleckage in der mikrofluidischen System nur selten aufgetreten. Außerdem O / N Inkubation in der Vakuumkammer dazu beigetragen, die Luft zwischen dem doppelseitigen Klebeband / Deckglas oder doppelseitiges Klebeband / Acrylglas-Schnittstelle gefangen zu entfernen. Folglich ist dieses Verfahren verbessert die Stabilität der Kulturkammer in der MDF-Chip.
Temperatursteuerung der 3% Agarose bei der Herstellung der Salzbrücke Netzwerks wichtig. Wenn die Temperatur des Agarose ist nicht hoch genug, während der Injektion, wird die Agarose schnell in der Spritze zu verfestigen und kann nichtin die Salzbrücke Netz eingespritzt werden. Außerdem wird während Agarose Injektion, ist es wichtig, jegliche Blasenbildung in der Salzbrücke Netzwerk zu vermeiden. Das Auftreten von Blasen erhöht den elektrischen Widerstand des Netzes und führt zu experimentellen Fehler. Darüber hinaus, wenn die Agarose bei der Injektion verfestigt, kann es nicht vollständig Flüssigkeitsströmung in der Salzbrücke Kanal blockieren. Als solche können die Chemikalien können dann leicht in andere Kanäle austreten. Der beste Ansatz ist, um heiße Agarose in das Netzwerk zu injizieren und dann lassen Sie die Agarose in den Salzbrücke Kanälen festigen.
Zellinjektion ist ein kritischer Prozess im electro Experiments. Um eine ausreichende Anzahl von Zellen für die Zellaussaat in der Kulturkammer zu gewährleisten, injizierten wir überschüssige Zahl von Zellen. In diesem Ansatz wurden die Zellen aus dem Auslaß injiziert. Die Einspritzgeschwindigkeit sollte langsam und sogar zu einer ungleichmäßigen Verteilung in der Zellkulturkammer zu vermeiden. Darüber hinaus, weil dieKanäle werden in der MDF-Chip getrennt, muss die Injektion ein Kanal zu einem Zeitpunkt durchgeführt werden. Somit ist die vollständige Zelle Injektionsverfahren zeitaufwendig. In Zukunft wird es notwendig sein, eine zusätzliche Zellinjektionskanal zu schaffen, die gleichzeitig Implantat Zellen in allen vier Kulturkammern. Dieses neue Verfahren wird Probenvolumen, die Anzahl der Zellen für die Injektion erforderlich ist, und die Betriebszeit zu reduzieren.
Es gibt mehrere Vorteile bei der Verwendung von Acryl anstatt PDMS als Material zur Herstellung der mikrofluidischen Vorrichtung. Ein Acryl-basiertes Gerät direkt auf eine Heizvorrichtung ohne einen Inkubator betrieben werden. Da das System benötigt keine CO 2 -Angebot können Zellen in einem auf Acryl basierenden Bio-Mikrofluidik-Chip auf einer regelmäßigen inversen Mikroskop mit dem Heizer aufgewachsen werden. Es ist einfacher, Zellenbildern in dem Chip außerhalb eines Inkubators aufzuzeichnen. Wir verwendeten ein verbreitetes Handels digitale SLR-Kamera, um die Zellbildern im System aufzeichnen. Darüber hinaus ist die WeichSoftware für programmierbare Steuerung der Kamera notwendig ist auch leicht zugänglich sind. Dies macht Zeitraffer-Bildgebung der Zellen leicht programmierbar. Daher sind die Kosten für den Bau der bio-Mikrofluidik-Automatik-Aufnahmebildsystems viel geringer als die eines kommerziellen Systems. Im Gegensatz dazu kann bei Verwendung eines PDMS-basierten Chip, muss das System in einem CO 2 -Inkubator betrieben werden. Somit müssen zusätzliche Bildaufzeichnungsgeräte für den Betrieb in den Inkubator erworben werden. Eine solche Ausrüstung ist teuer, relativ sperrig und einen großen Teil des begrenzten Raumes in dem Zellkulturbrutschrank befindet. In einem anderen Aspekt gegenüber dem Prozess der PDMS Chipherstellung, ist die einfache und schnelle Herstellung der Acrylmikro fluidischen Chip eignet sich sowohl für Geräte Prototyping und Produktion. Darüber hinaus, verglichen mit der PDMS-Gerät ist das Acrylbasis mikrofluidischen Chip strukturell stabiler und besser geeignet für die Konstruktion einer komplizierten dreidimensionalen mikrofluidischen Netzwerk-System, wie auchmit der MDF-Chip in dieser Studie durchgeführt. Der On-Chip-Salzbrückennetzwerk in der MDF-Chip kann nicht leicht in einer PDMS-Gerät erzeugt werden. Das Netzwerksystem minimiert die Gesamtgröße des mikrofluidischen Chips und macht electro Forschung einfacher und schneller.
Im Inneren des MDF-Chip erwirtschafteten wir nur zwei elektrische Feldstärken (EFS, 0 und 300 mV / mm) in jedem Kanal getrennt. Allerdings ist die MDF-Chip und der Mehrfeld electrotactic Chip, wie von Huang berichtet, et al., 4 eine ähnliche Kanaldesign im Zellkulturbereich. Durch Änderung der Formen der Kulturkammer in der MDF-Chip können mehrere EFSen auch auf der MDF-Chip erzeugt werden. Mit diesen Modifikationen kann mehrere EFSen und mehrere Chemikalien in dem gleichen Test verwendet werden. Dementsprechend könnte ein Hochdurchsatzscreening-System angelegt werden, um Elektrotaxis unter Verwendung der Vorrichtung zu untersuchen.
Mit nur einem Experiment, in der Lage, die Prüfung der Auswirkungen ist die MDF-Chipverschiedenen Chemikalien auf Zellen unter dcEF oder die Einflüsse der elektrischen Stimulation auf verschiedenen Arten von Zellen. Es kann sogar möglich sein, 20 isolierte parallele Kanäle in der MDF-Chip, ohne die Größe der Vorrichtung wesentlich zu erhöhen implementieren. 8, wie in dieser Arbeit gezeigt, in einem Versuch eine signifikante dosisabhängige Korrelation zwischen der Gerichtetheit der Zellmigration und erhalten wir Y27632 (Abbildung 4). Die MDF-Chip mit vier Kanälen bietet eindeutig einen effizienten Ansatz zur Untersuchung der Elektrotaxis in Krebszellen.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| DMEM medium | Gibco,Invitrogen, USA | 12800-017 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco,Invitrogen, USA | 16000-044 | |
| Trypsin | Gibco,Invitrogen, USA | 25200-072 | |
| PBS | Basic Life | BL2651 | |
| Y-27632 (hydrochloride) | Cayman Chemical Co | 10005583 | |
| agarose | LONZO, USA | SeaKem LE AGAROSE | |
| syringe | Terumo | 3 ml with Luer taper | |
| 3-way stopcock | Nipro | with Luer taper | |
| PMMA (acrylic) | HiShiRon Industries CO., Ltd, Taiwan | thickness 1mm, 2mm | |
| acrylic adaptor | KuanMin Technology Co., Ltd, Taichung, Taiwan | 1/4-28 port, 10x10x6 mm | customized |
| nut | Thermo Fisher Scientific Inc. | UPCHURCH:P-206x, P-200x, F120x, P-659, P-315x | |
| Microscope cover glass | Deckgläser, Germany | 24x60 mm | |
| double-sided tape | 3M | PET 8018 | |
| super glue | 3M | Scotch Liquid Plus Super Glue | |
| TFD4 detergent | Franklab, France | TFD4 | |
| ultrasonic steri cleaner | LEO ULTRASONIC CO., LTD., Taiwan | ||
| Thermo bonder | KuanMin Technology Co., Ltd, Taichung, Taiwan | customized | |
| CO2 laser scriber | LTT group, Taiwan | ISL-II | |
| proportional-integral-derivative (PID) controller | JETEC Electronics Co., Japen | TTM-J40-R-AB, | |
| K-type thermocouple | TECPEL | TPK-02A | |
| 4-channel syringe pump | KdScientific, USA | 250P | |
| DC power supply | GWInstek, Taiwan | ||
| X-Y-Z motor stage | TanLian, E-O Co. Ltd., Taiwan | customized | |
| inverted microscope | Olympus, Japan | CKX41 | |
| digital SLR camera | Canon, Japan | 60D |
References
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