Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Электротаксис Исследования клетки легких рака с использованием многоканального Dual-электрического поля микрофлюидных Chip

Published: December 29, 2015 doi: 10.3791/53340
Automatic Translation
1, 1, 1,2,3,4,5
1Research Center for Applied Sciences, Academia Sinica, 2Institute of Biophotonics, National Yang-Ming University, 3Biophotonics & Molecular Imaging Research Center (BMIRC), National Yang-Ming University, 4Department of Mechanical and Mechatronic Engineering, National Taiwan Ocean University, 5Ph.D. Program in Microbial Genomics, National Chung Hsing University

Abstract

Поведение направленной миграции клеток под постоянным током электрического поля (dcEF) упоминается как электротаксис. Значительную роль физиологического dcEF в руководстве движения клеток во время эмбрионального развития, дифференциации клеток и заживление ран было продемонстрировано во многих исследованиях. Применяя микрожидкостных фишки на электротаксис анализа, процесс расследования сокращается и экспериментальные ошибки к минимуму. В последние годы микрофлюидальные устройства изготовлены из полимерных веществ (например, полиметилметакрилат, ПММА, или акриловую) или полидиметилсилоксана (ПДМС) широко используются при изучении ответов клеток на электрическую стимуляцию. Однако, в отличие от многочисленных шагов, необходимых для изготовления устройства PDMS, простой и быстрый строительство акриловых микро фл uidic чип делает его пригодным как для прототипирования и производства устройств. Тем не менее, ни один из представленных устройств не способствовать эффективному исследование одновременного химического и DCEF воздействие на клетки. В этом докладе мы описываем нашу конструкцию и изготовление акриловой основе многоканального двойного электрического поля (MDF) обломок расследовать одновременный эффект химической и электрической стимуляции на клетках рака легких. Чип МДФ имеет восемь комбинаций электрических / химические раздражения в одном тесте. Чип не только значительно сокращает необходимое время эксперимента, но также увеличивает точность электротаксис исследований.

Introduction

Поведение адгезивных клеток, движущихся по направлению к анода или катода под постоянным током электрического поля (dcEF) упоминается как электротаксис. Electrotactic поведение клеток играет важную роль в эмбриогенезе, регенерации нерва, и заживления ран. 1 Опухолевые клетки, такие как раковые клетки крысы простаты, рак молочной железы клеток 2, 3 и легких клетки аденокарциномы 4-8 показали electrotactic движение при приложенном dcEF , Физиологический EF была измерена в железе тканей. 9,10 электротаксис Также сообщалось в железе ассоциированный опухолевых клеток. 2,3 Взятые вместе, электротаксис раковых клеток, как полагают, является фактором метастазы. 11 Управление электрического руководство раковые клетки под dcEF может быть потенциальным подходом для будущего лечения рака. Тем не менее, сегодня, подробный молекулярный механизм электротаксис остается спорным. Таким образом, исследование инфluence электрической стимуляции по миграции раковых клеток может способствовать развитию стратегий для лечения рака.

Недавно, био-Микрожидкостных устройства были изготовлены для изучения клеточных ответов течь силы сдвига, 12 химических градиентов, 13 и электрических стимулов 4 в пробирке. Изготовление био-Микрожидкостных устройств, использующих полидиметилсилоксана (PDMS) или полиметилметакрилат (ПММА, также известный как акрил) успешно снизили интенсивность отказов таких экспериментов. Кроме того, с помощью акриловых основе микрожидкостных устройства в качестве прототипа для исследования биологических предметы проще, чем с помощью PDMS чипов. Различные функции в устройствах на акриловой основе были разработаны для электротаксис исследования. Тем не менее, ни один из предыдущих конструкций не способны одновременно испытать влияние различных химических условий и электрического поля на клетки для электротаксис исследования. Таким образом, мы разработали устройство микрожидкостных-му вltichannel двойного электрического поля (MDF) чип, содержащий четыре независимых каналов культура и восемь различных экспериментальных условиях в одном чипе.

Акриловый основе МДФ чип, впервые сообщил Хоу и др., 8 интегрируется электрической стимуляции и несколько химически изолированных каналов. Эти химически изолированные каналы могут быть использованы для культуры различных типов клеток в одном эксперименте. DcEF в каналах производится по сети электропитания. Два независимых электрических полей, одна с прикладной напряженности электрического поля (EFS), а другой с 0 EFS, проводятся в каждом химически изолированный канал. Таким образом, микросхема обеспечивает более контролируемый сосуществующих EF и химическое раздражение. Более того, результаты численного моделирования химической диффузии внутри чипа MDF указать, что перекрестное загрязнение не происходило между каналами после экспериментального периода в 24 ч. 8

По сравнению с ДевиCE сообщает Li и др., 14 чип МДФ обеспечивает большую площадь культуры, которая позволяет для дальнейшего биохимического анализа электрически стимулированных клеток. Кроме того, с большей площадью наблюдения чипа МДФ, в несколько ячеек можно наблюдать в тесте, так что анализ скорости миграции или направленности электрически стимулированных клеток является более точным. Чип конструкций одноканальные предыдущих исследований, представленных Хуанг и др. 4 и Цай и др. 15 позволяют только один тип клеток или химических веществ, подлежащих испытанию. Тем не менее, чип МДФ могут быть использованы для изучения влияния различных химических веществ на электротаксис, а также последствия электрической стимуляции на разных типах клеток. Другими словами, чип МДФ позволяет эффективно изучении зависимостей химических доз.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Проектирование и изготовление МДФ Chip

  1. Нарисуйте индивидуальный рисунок акриловой слой, используя коммерческое программное обеспечение, такое как AutoCAD, и сохранить шаблон.
    1. Просмотрите дизайн четыре слоя акрилового листа рисунка на рисунке 1А и подтвердить соединений между слоями.
  2. Изготовление всех акриловые листы и ленту двухсторонний методом лазерной абляции с помощью СО 2 -лазера рисок (фиг 1B, 2A, 2B и). 16
    1. Включите лазерный Чертилка и подключить аппарат к контролирующей ноутбука.
    2. Запустите программное обеспечение и коммерческую открыть шаблон предназначен в шаге 1.1, нажав "предназначен файла шаблона."
    3. Поместите кусок пустой акрилового листа или двухсторонней ленты на сцене XYZ лазерного Чертилка.
    4. Установите фокус лазерного луча на поверхности акрилового листа или двухсторонней ленты с авто-alignmenт палку, предоставляемая производителем лазерного Чертилка.
    5. Отправить на проектную шаблон для лазерного Чертилка для прямого обработки акрилового листа или двухсторонней ленты.
  3. Снимите защитную бумагу с акриловых листов с помощью щипцов и взорвать поверхность чистой газообразным азотом.
  4. Стек акриловые листы и объединить их под давлением 2 кг / см 2 в тепловом тычковых течение 45 мин при 110 ° C, чтобы сформировать поток / электрический монтаж стимуляции канала.
  5. Подготовка микроскопа покровного стекла в качестве клеточной культуральной подложки в кристалле.
    1. Положите крышку стекла в сосуд для окрашивания и заполните банку с десятикратным разбавлением моющего средства, перечисленные в списке материалов.
    2. Положите крышку стекла и окрашивания банку в ультразвуковой очиститель STERI-и очистить защитное стекло в течение 15 мин.
    3. Вылейте моющего средства из окрашивания банку, наполнить банку дистиллированной водой и повторите шаг 1.5.2 3 раза.
    4. Сушат очищенный покровного стекла путем продувки газообразным азотом перед тем придерживаясь его на двусторонней клейкой ленты.
  6. Придерживайтесь очищенный покровного стекла для потока / электрической стимуляции сборки канала с двухсторонней ленты с рисунком в шаге 1.2.
  7. Придерживайтесь 13 штук акриловых адаптеров для отдельных отверстий в слое 1 чип сборки МДФ с супер клеем. Чип сборки МДФ затем полным (рис 2D).
  8. Стерилизацию полный чип сборки MDF с 30 мин УФ-облучения до использования.

2. Настройка Солт Bridge сети МДФ Chip

  1. Перед использованием простерилизовать все пластиковые трубы, от руки гайки и микроцентрифужных трубки, показанные на рис 3B, установив время выдержки 15 мин при 121 ° C в автоклаве.
  2. Подключите фторопластовые трубки (3В-я) с чипом сборки МДФ с помощью среднего входеи выпускной адаптеры показано на фиг.1А.
  3. Подключите Луер конусность среднесрочной входе и выходе пластиковые трубы в 3В-я в 3-полосных кранами.
  4. Возьмем 2,5 мл СО 2 -equilibrated фосфатно-солевом буфере (PBS), используя 3 мл шприц и соединить шприц с 3-ходовым запорным краном на входе пластиковой трубки. Подключение пустой шприц 3 мл с 3-ходовым запорным краном на выходе пластмассовой трубки. Два шприцы, таким образом, между собой через чип MDF.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выдержите PBS в 37 ° С 5% -CO 2 клеточной культуры инкубатор O / N, чтобы получить СО 2 -equilibrated PBS.
  5. Печать отверстия в синий и зеленый адаптеры (рис 1а) на ПММА листа слой 1 с белыми твердыми от руки гайки (3В-III).
  6. Заполните солевой мостик каналы и культуры камеры с CO 2 -equilibrated PBS в шприц, описанной в шаге установки 2.4. Избежатьформирование пузырьков.
  7. Далее, поставить CO 2 -equilibrated PBS, содержащего чип MDF в 37 ° C 5% -CO 2 клеток инкубатора культуры для O / N инкубации. Это позволяет растворенного воздуха в двухсторонней ленты, чтобы сформировать пузырьки в камерах.
  8. Смыть пузыри в каналах быстрым потоком PBS в канал, используя два шприца. Насос PBS и обратно при необходимости.
  9. Слейте PBS в каналах через 3-ходовой кран, подключенного к средней выпускной трубе.
  10. Используя новый шприц 3 мл, принять 2,5 мл СО 2 -equilibrated Дульбекко в модификации Дульбекко (DMEM) (см шаг 3,5), и заменить шприц, соединенный с входом с новым. Пополните каналы со средой.
  11. Подготовка сети соль моста.
    1. Временно удалить твердые орехи (3В-III) на зеленых адаптеров (рис 1а) и ввести 3% горячей (> 70 ° C) агарозы в соль BRIDGE канал через отверстие в зеленый адаптеров (рис 1А).
      Примечание: Получение горячей агарозы: Растворить 1,5 г порошка агарозы в 50 мл PBS. Стерилизовать установки времени выдержки 20 мин при 121 ° С в автоклаве.
    2. Остановка инъекционных агарозы, когда жидкость заполняет три четверти длины канала солевого мостика.
    3. Уплотнение поры на зеленой адаптеров (фиг.1А) путем завинчивания твердые орехи (3В-III) после инъекции агарозном.
    4. Замените твердые орехи на синем адаптеров (рис 1А) со светопрозрачных трубчатых пальцев, плотно орехи (рис 3b).
    5. Загрузите 3% предварительно нагретый агарозы в трубчатых орехов (3В-IV).
    6. Вставить электроды Ag / AgCl (3В-V) в трубчатых орехов (3В-IV), прежде чемЗатвердевание агарозы.
  12. После завершения установки сети солевого мостика, впрыснуть CL1-5 клетки рака легких в культуральные камеры, одну камеру одновременно.

3. Подготовка раковых клеток и настройка для Electrotactic эксперимента

  1. Регулярный культура клеточной линии рака легких CL1-5.
    1. Культура раковые клетки CL1-5 легких, полученные от профессора Пан-Chyr Ян, 17 в полной среде в 75T для культивирования клеток колбу на 37 ° C в 5% CO 2 атмосфере. Полная среда состоит из DMEM и 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS). Суб-культивирования клеток каждые 3 до 4 дней. Клетки, используемые для выполнения электротаксис эксперименты меньше 25 отрывков из оригинального источника.
  2. Добавить 2 мл 0,25% трипсина буфера в экспоненциально растущих клеток CL1-5 и инкубировать в течение 2 мин в 37 ° С 5% -CO 2 ячейки инкубатор культура для сотовых detachmenт.
  3. Завершить отряда процесс с 6 мл 10% FBS среде DMEM и центрифуги клетки при 300 г в течение 5 мин при комнатной температуре. Затем отбросить среды и приостановить осадок клеток 5 мл PBS.
  4. Подсчитайте количество клеток в PBS. Затем принимать по 1 × 10 6 клеток и центрифуге при 300 г в течение 5 мин при комнатной температуре.
  5. Откажитесь от PBS. Приостановить клетки с подогретого CO 2 -equilibrated DMEM и регулировать плотность клеток быть 1 × 10 6 клеток / мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выдержите полной среды в 37 ° С 5% -CO 2 клеточной культуры инкубатор O / N, чтобы получить CO 2 -equilibrated DMEM.

4. Настройка для Electrotactic эксперимента

  1. С выхода микросхемы MDF, вводят 0,3 мл, 1 × 10 6 / мл, из клеток в чипе.
  2. Инкубируйте клеток семенами MDF чип в культуре клеток инкубаторе (при 37 ° С и 5% СО 2) в течение 2-4 ч.
  3. Настройка МДФ микрожидкостный система.
    1. Установите микрожидкостных системы МДФ на прозрачной индия и олова оксида стекло (ITO) нагревателя. Измерьте температуру чипа MDF с К-типа термопары обрезанный между чипом MDF и стеклом ITO. Управление нагревателем ITO с пропорционально-интегрально-дифференциальный (ПИД) регулятор. Установите температуру микрожидкостных система инкубационный MDF до 37 ° C с ПИД-регулятора.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Изготовление в ITO нагревателя и установка системы отопления культуры клеток описаны в предыдущих докладах 18,19.
    2. Установите контролем температуры МДФ чип сборки на XYZ моторизованного столика с компьютерным управлением на инвертированный микроскоп. Использование моторизованной стадии описано в шаге 5.1. Насос полной среды в культуру камер через воздухозаборники с шприцевой насос четыре канала.
  4. Насос полной среды в чип MDF при скорости потока 20 мкл / ч. Культура отходы от отъездапозволяет собираются в микропробирок (показанные как "отходы" на рис 3а).
  5. Инкубируйте клетки для другого 16-18 ч при 37 ° С в чипе MDF.
  6. Для замены среды, насос среду, содержащую 50, 25, 5, 0 и мкМ ингибитора киназы соответственно в каждой культуре камеру при расходе 20 мкл / мин в течение 10 мин.
    Примечание: Подготовка 10 мМ исходного раствора в Ро-ассоциированной ингибитор протеинкиназы Y27632 добавлением 3 мл стерильной воды для ингибитора киназы в 10,6 мг. Развести 10 мМ маточного раствора до 50, 25 и 5 мкм, соответственно, с использованием 10% FBS среду DMEM.
  7. Инкубируйте клетки в ингибитора киназы еще в течение 60 мин при 37 ° С. Установите среднюю скорость потока до 20 мкл / ч. Используйте ту же температуру культуры и скорости, описанной выше в более поздних этапов течь.
  8. Для подключения источника питания постоянного тока к микросхеме MDF через электроды Ag / AgCl на чипе помощью электрических проводов.
  9. Серийно подключить амперметр Iп электрической цепи. Используйте амперметр для контроля электрического тока в кристалле МДФ.
  10. Включите источник питания постоянного тока и установите амперметр тока в мкА 86.94, регулируя напряжение питания в диапазоне от 15 до 19 В.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Учитывая закон Ома E = I / (σA эфф), где я течет через сыпучего материала электрический ток, то есть питательная среда в electrotactic камеры, σ (= 1,38 Ω -1 м - 1) является проводимость в культуральную среду, A эфф (0,21 мм 2 для 3 мм ширина × 0,07 мм в высоту) эффективная площадь поперечного сечения electrotactic камеры, и электрический ток (I), необходимо, чтобы генерировать 300 мВ / мм EF в чипе МДФ 86,94 мкА.

5. Приобретение и анализ изображений клеток

  1. Управление моторизованной этап, используя программу MATLAB GUI. С МДФ микрожидкостных системы, установленной на microscoPE, двигаться чип регионах наблюдений с использованием моторизованных этап.
  2. Запись изображения клеток, используя цифровой сингл зеркальная (SLR) камерой, установленной на микроскопе.
  3. Возьмем микроскопические изображения, используя объектив 4X с интервалом в 15 мин в течение 2 ч.
  4. Миграция клеток анализ.
    1. Запустите NIH ImageJ 1,47 В.
    2. Анализ расстояние от начальной до конечной позиции центра тяжести ячейки.
    3. Перейти к "Файл" → "Импорт" → "Image Sequence", и импортировать девять изображений для анализа миграции клеток. Первое изображение является результатом нулевого времени, и последнее изображение является результатом 120 мин.
    4. Перейти к "Анализ" → "указан измерений" и установите флажок рядом с "центр тяжести"
    5. Нажмите на иконку "Freehand выбранных".
    6. Изображать края выбранных ячеек в первом изображении.
    7. Перейти к "Edit" → "Выбор" → "Добавить в менеджера"
    8. К девятому изображения и изображают краю же клетках, отобранных на первом изображении. Клеточные позиции могут быть прослежены с помощью второго по восьмой изображений.
    9. Перейти к "Edit" → "Выбор" → "Добавить в менеджера"
    10. Повторите шаги 5.4.5 на 5.4.9, чтобы собрать данные от 90 до 100 клеток.
    11. Перейти к "→ Анализ" "Мера", чтобы получить результат начальных и конечных положений отдельных клеток.
      Примечание: Скорость миграции определяется как средняя длина клеточного движения в час. Направленность определяется как косинус, где находится угол между вектором dcEF (от анода к катоду) и вектора от начальной точки ячейки к своей конечной позиции. Направленность -1 для клеток, мигрирующих к аноду и 1 для клеток, мигрирующих к катоду. Для группы случайным мирешетка клетки, то направленность 0. 2

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Изготовление и монтаж прибора МДФ

Принципиальная схема на акриловой основе MDF чипа показано на фиг.1А. Четыре акриловые листы, один покрытие стекла, 13 акриловых адаптеры и кусок двухсторонней ленты были использованы в сборке готовой микросхемы МДФ (рис 2D). Есть только четыре независимых каналов культура в устройстве МДФ. Однако сеть солевой мостик на кристалле создает восемь различных экспериментальных условиях в восьми сегментов чипа. Три солевых мостиков (синие каналы в слое 2 фиг.1А), 79, 90 и 80 мм в длину, были соединены с вторым слоем чипа MDF, не мешая наблюдению изображения. Небольшие поры (синий кубом каналы в слоях 3 и 4 рис 1А) между сетью соль моста и культуры камер, которые имеют 0.25 Мм 2 поперечного сечения, свести к минимуму жидкости поток в солевой мостик в ходе эксперимента. Область культуры чипа МДФ около 74 мм 2 в каждом сегменте. В этой демонстрации, культуры клеток камеры устройства МДФ состоят из толстого двухстороннего скотча и покровного стекла 70 мкм. Тем не менее, если различные условия культивирования клеток (например, требование коллагена покрытие, сдвиг низкий расход, или большой объем культура среда в камере культуры) нужен для исследования электротаксис, оба культуральные субстраты и ленты может быть легко заменена. Таким образом, различные типы клеток можно использовать для исследования электротаксис в чипе MDF.

Конфигурация системы МДФ микрожидкостных

Установка Микрожидкостных система МДФ показано на рисунке 3А. Компоненты, показанные на фигуре 3В являются UСЭД установить средний расход и электрического тока в сети микрожидкостных системы МДФ. Трубы, связанные с полыми от руки гайки (красные и зеленые) и Luer свечей (Brown) в 3В-я используется для транспортировки среды в сети расхода МДФ. После шприцы были связаны с свечей Luer и поселился четыре на-канала насоса, система подачи трубопровода была завершена. Питательная среда и отходы транспортируются через систему трубопроводов. Поскольку связь между трубками и акриловых адаптеров крепятся винтовыми разъемами, среда сеть МДФ может терпеть высокую гидравлическое давление, чем может система PDMS. Из-за крайне низкой воздухопроницаемостью акриловых листов и труб, любой контакт между сетью и средней внешней среды блокируется. Таким образом, значение рН среды в системе остается стабильным, и клетки можно культивировать, используя микрожидкостных систему MDF пределами СО 2 инкубаторе. С ч МДФустановлен IP на моторном этапе изображения покадровой клеток могут быть взяты из восьми отдельных разделах. Трубы открытые дном микроцентрифужные (3В-II) смонтированы на полупрозрачных трубчатых от руки гайки (рис 3B-IV), чтобы увеличить объем мощности агарозы. Таким образом, относительно большие электроды могут быть вставлены в агарозе обеспечить стабильное электрическое возбуждение к клеткам в течение более длительных периодов времени.

Генерация указанного постоянного тока электрического поля в чипе MDF

Напряжение каждой камеры может быть измерена с помощью имплантированных электродов в в печатной соединенных чипа электрической. Тем не менее, мы не измерить напряжение в камере. Напротив, мы имитировали электрическое поле в сети моста соли и клеточных культур камер чипа. Четыре electrotactic камеры были последовательно противподключенные в электрических цепях. Таким образом, тот же электрический ток сохраняется в каждой из этих камер. В соответствии с законом Ома EFS коррелирует с площадью поперечного сечения камер в микрожидкостных устройств. Кроме того, все ПММА листы и ленты были изготовлены СО 2 лазера Чертилка. Выравнивание чип монтажных частей является точным и структурные дефекты микросхемы являются минимальными. Таким образом, EFS в каждой камере должна оставаться стабильной. Электрические результаты моделирования показывают, поле однородное распределение EFS с 300 и 0 мВ / мм первых половинах и оставшиеся половинки культуры камер в устройстве (данные не показаны). Ранее, сообщает из нашей лаборатории, Хуанг и др. и Цай и др., показали, что различие в измеренных и смоделированных значений EFS была меньше, чем 4%. 4,15 Этот результат показывает, что в нашей системе, измеренное электрическое поле также соответствует моделируемой величины. В этом Wорк, мы вставили большие Ag / AgCl электроды обеспечивают стабильный электрический ток в течение длительного эксперимента. Применяемая тока на микросхеме МДФ снизился только 1,85 ± 0,19% после 7 ч EF стимуляции в электротаксис экспериментов. Кроме того, самый длинный период электрической стимуляции было 4 часа в нашем исследовании. Таким образом, мы считаем, что вход электрический ток остается стабильным в течение электротаксис тестирования, и электрическое поле в electrotactic камер чипа МДФ контролируются последовательно соединенные амперметр.

Исследование электротаксис раковых клеток легких с использованием микрожидкостных системы МДФ

Electrotactic регулирование Ро-ассоциированного биспиральных киназы (ROCK) была продемонстрирована в клетках яичника китайского хомячка (СНО), 20 эндотелиальной, 21 и 22 нейронов, но еще не были исследованы рака легких Cлоктей. Таким образом, РОК ингибитор Y27632, был применен к микрожидкостных системы МДФ, чтобы изучить его влияние на электротаксис в клетках рака легких. Как показано на рисунке 4, обработка Y27632 не показал никакого эффекта в изменении скорости миграции клеток с или без электрической стимуляцией. Тем не менее, применение Y27632 к раковым клеткам при dcEF (300 мВ / мм) значительно снижается их анодное миграции. При концентрации 50 мкм, ингибитор ROCK устранены анодный движение клеток рака легких, но не влияет на их скорость миграции. Кроме того, существует корреляция дозозависимое между прикладной химических концентраций и индекса направленности (фиг.4В). Эти результаты показывают, что система Микрожидкостных МДФ надежным и эффективным для изучения электротаксис.

Рисунок 1
Рисунок 1. ДеIGN чипа МДФ. (А) Схематическое изображение чипа МДФ. Устройство МДФ состоит из четырех слоев акриловых листов (72 × 50 мм), 13 акриловых адаптеров (10 × 10 × 6 мм), двухсторонней ленты, и покровного стекла (24 × 60 мм). Толщина акрилового листа слой 2 мм 2, а остальные три слоя, каждый 1 мм. В трех нижних слоев акриловых, соль мост и сетей среднего течения представлены синими и красными блоков, соответственно. В первом слое акриловый лист, зеленый акриловые адаптеры были использованы для инъекции агарозы. Синие акриловые адаптеры были использованы в качестве соединения с электродами Ag / AgCl. Есть четыре камеры для культивирования клеток в чипе MDF. Площадь и высота каждой клеточной культуральной камере 148 мм 2 (3 × 46 мм) и 0,07 мм соответственно. Маленькие голубые каналы на слоях 3 и 4 подключить к сети соль мост к культуре камер. Поперечное сечение этих каналов связи составляет 0,25 мм и др., 8 авторских 2014 года, Американский институт физики). (В) Фотография из всех компонентов сборки МДФ устройство, содержащее ПММА, акриловые адаптеры, двухсторонний скотч, и покровного стекла. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

фигура 2
Рисунок 2. MDF изготовления чипа и процессы сборки. (A) закономерности акрилового листа и двухсторонней ленты были описываемая СО 2 лазерной обработки. (Б) индивидуальные слои акриловых листов были изготовлены с помощью СО 2 -лазера в соответствии с проектной чертеже. (С) Очищенный акриловый листс были соединены вместе с помощью теплового связующие вещества. (D), завершил сборку чип МДФ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3. Система электротаксис исследовании. (А) Принципиальная схема системы для эксперимента электротаксис. Трубки соединены с чипом MDF были использованы для средней инфузии и отходов оттока. DcEF в чипе был проведен через Ag / AgCl электродов и источника питания. Установка устройства был установлен на моторной стадии XYZ микроскопа. Сотовые изображения в чипе были приняты коммерческой цифровой зеркальной камерой. (В) Фотография из компонентов сети потока среды и поколения dcEF в микрожидкостных системы МДФ, incluдинь (я) разъем трубки, (II) с открытым дном микроцентрифужные трубы, (III) белого твердого вещества от руки гайку, (IV) полупрозрачная трубчатый палец плотно гайку, и (v) Ag / AgCl электроды. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 4
Рисунок 4. Влияние Y27632 по миграции клеток рака легких в соответствии с EFS (а) нулю, и (В) 300 мВ / мм. DcEF стимуляции был применен после 1 ч предварительной обработки с указанной концентрацией Y27632. Электрическую стимуляцию продолжалось в течение 2 часов. Количественный анализ направленности и скорости миграции клеток consititute представительный эксперимент. 90-100 клетки были использованы в анализе данных. * для Р <0,001. Данные выражены как среднее ± стандартная ошибкасреднее (SEM). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Мы нашли процесс присоединения акриловых адаптеры на уровне 1 чипа МДФ будет сложно. Применение 1 до просто 2 мкл супер клей достаточно прочно придерживаться адаптер на чипе МДФ. Большие количества клея в результате неполного полимеризации супер клей и несоблюдение. После того, как акриловые адаптеры твердо придерживался на чипе МДФ, утечка жидкости в системе микрожидкостных редко произошло. Кроме того, о / N инкубации внутри вакуумной камеры помогли удалить воздух, находящийся между двухсторонней ленты / покровного стекла или двухсторонней ленты интерфейса / акрилового листа. Следовательно, этот процесс улучшает стабильность культуральной камере в чипе MDF.

Контроль температуры 3% агарозном геле при подготовке сети солевого мостика важно. Если температура агарозы недостаточно высока при инжекции, агароза быстро затвердевают внутри шприца и не можетвводить в сети солевого мостика. Кроме того, в агарозном инъекции, важно, чтобы избежать каких-либо образование пузырьков в сети солевого мостика. Появление пузырьков значительно увеличивает электрическое сопротивление сети и приводит к экспериментальной недостаточности. Кроме того, как только агарозном затвердевает в процессе инъекции, оно не может полностью блокировать поток жидкости в канале солевого мостика. Таким образом, химические вещества могут затем легко течь в другие каналы. Лучше всего, чтобы ввести горячую агарозы в сети и затем позволить агарозном затвердевать внутри каналов солевой мостик.

Инъекции клеток является критическим процессом в эксперименте электротаксис. Чтобы обеспечить достаточное количество клеток для посева клеток в культуральной камере, мы вводили избыточное количество клеток. При таком подходе клетки вводили из розетки. Скорость впрыска должно быть медленным, и даже, чтобы избежать неравномерного распределения клеток в культуральной камере. Кроме того, посколькуканалы изолированы в чипе MDF, инъекции нужно делать один канал одновременно. Таким образом, весь процесс инъекции клеток является трудоемким. В будущем, необходимо будет создать дополнительный канал инъекции клеток, которые могут одновременно имплантат клеток в всех четырех камер культуры. Этот новый процесс позволит уменьшить объем образца, количество клеток, необходимых для инъекций, и время работы.

Есть несколько преимуществ в использовании акрила, а не PDMS в качестве материала для изготовления микрожидкостных устройств. Акриловый основе устройства можно управлять непосредственно на нагревателе без инкубаторе. Так как система не требует подачи СО 2, клетки могут быть выращены в био-чипа Микрожидкостных акриловой основе на регулярной инвертированного микроскопа с нагревателем. Легче записывать изображения клеток в чипе вне инкубатора. Мы использовали широкое распространение коммерческой камеру цифровую зеркальную записывать изображения клеток в системе. Кроме того, мягкаяпосуда, необходимая для программируемых управления камерой также легко доступны. Это делает покадровой визуализации клеток легко программируется. Таким образом, стоимость строительства био-Микрожидкостных авто-записи системы изображения гораздо ниже, чем в коммерческой системе. В противоположность этому, при использовании ПДМС чип на основе, система должна работать в СО 2 инкубатор. Таким образом, дополнительная изображения записывающее оборудование должно быть приобретено для работы в инкубатор. Такое оборудование является дорогостоящим, громоздки и занимают большую часть ограниченного пространства в инкубаторе для клеточных культур. В другом аспекте, по сравнению с процессом производства микросхем PDMS, то легко и быстро изготовление акриловых микро фл uidic чипа подходит как для прототипов устройства и производства. Кроме того, по сравнению с устройством PDMS на основе акриловой основе чипа Микрожидкостных структурно более стабильны и пригодны для построения сложного трехмерного микрожидкостных сетевой системы, как это былоосуществляется с чипом МДФ в данном исследовании. Сетевой мост на чипе соли в чипе MDF не может быть легко получен в устройстве PDMS основе в. Это сетевая система минимизирует общий размер микрожидкостных чипа и делает электротаксис исследования проще и быстрее.

Внутри микросхемы МДФ, мы получили только два электрических поля сильные (EFS, 0 и 300 мВ / мм) в каждой изолированной канала. Тем не менее, чип МДФ и многопрофильное electrotactic чип, как сообщает Huang и соавт., 4 Доля аналогичный дизайн канала в области клеточной культуры. Изменяя форму культуральной камеры в чипе MDF, несколько EFSs также могут быть получены на чипе МДФ. С учетом этих изменений, множественный EFSs и несколько химических веществ, могут быть использованы в том же тесте. Соответственно, высокий система скрининг, могут быть созданы, чтобы исследовать электротаксис, используя устройство.

В одном эксперименте только, чип МДФ способен тестирования эффектовразличных химических веществ на клетки под dcEF, или влияния электростимуляции на различных типах клеток. Это может быть даже можно реализовать 20 изолированных параллельных каналов в чипе MDF без значительного увеличения размера устройства. 8 Как показано в этой работе, в одном эксперименте, мы получили значительное дозозависимое соотношение между направленности миграции клеток и Y27632 (Рисунок 4). Чип МДФ с четырьмя каналами четко предусматривает эффективный подход к изучению электротаксис в раковых клетках.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent
DMEM medium Gibco,Invitrogen, USA 12800-017
Fetal Bovine Serum Gibco,Invitrogen, USA 16000-044
Trypsin Gibco,Invitrogen, USA 25200-072
PBS Basic Life BL2651
Y-27632 (hydrochloride) Cayman Chemical Co 10005583
agarose LONZO, USA SeaKem LE AGAROSE
syringe Terumo 3 ml with Luer taper
3-way stopcock Nipro with Luer taper
PMMA (acrylic) HiShiRon Industries CO., Ltd, Taiwan thickness 1mm, 2mm
acrylic adaptor KuanMin Technology Co., Ltd, Taichung, Taiwan 1/4-28 port, 10x10x6 mm customized
nut Thermo Fisher Scientific Inc. UPCHURCH:P-206x, P-200x, F120x, P-659, P-315x
Microscope cover glass Deckgläser, Germany 24x60 mm
double-sided tape 3M PET 8018
super glue 3M Scotch Liquid Plus Super Glue
TFD4 detergent Franklab, France TFD4
ultrasonic steri cleaner LEO ULTRASONIC CO., LTD., Taiwan
Thermo bonder KuanMin Technology Co., Ltd, Taichung, Taiwan customized
CO2 laser scriber LTT group, Taiwan ISL-II
proportional-integral-derivative (PID) controller JETEC Electronics Co., Japen TTM-J40-R-AB,
K-type thermocouple TECPEL TPK-02A
4-channel syringe pump KdScientific, USA 250P
DC power supply GWInstek, Taiwan
X-Y-Z motor stage TanLian, E-O Co. Ltd., Taiwan customized
inverted microscope Olympus, Japan CKX41
digital SLR camera Canon, Japan 60D

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McCaig, C. D., Rajnicek, A. M., Song, B., Zhao, M. Controlling cell behavior electrically: current views and future potential. Physiol Rev. 85, 943-978 (2005).
  2. Djamgoz, M. B. A., Mycielska, M., Madeja, Z., Fraser, S. P., Korohoda, W. Directional movement of rat prostate cancer cells in direct-current electric field: involvement of voltagegated Na+ channel activity. J Cell Sci. 114, 2697-2705 (2001).
  3. Pu, J., et al. EGF receptor signaling is essential for electric-field-directed migration of breast cancer cells. J Cell Sci. 120, 3395-3403 (2007).
  4. Huang, C. W., Cheng, J. Y., Yen, M. H., Young, T. H. Electrotaxis of lung cancer cells in a multiple-electric-field chip. Biosens Bioelectron. 24, 3510-3516 (2009).
  5. Huang, C. W., et al. Gene expression of human lung cancer cell line CL1-5 in response to a direct current electric field. PLoS One. 6, e25928 (2011).
  6. Sun, Y. S., Peng, S. W., Lin, K. H., Cheng, J. Y. Electrotaxis of lung cancer cells in ordered three-dimensional scaffolds. Biomicrofluidics. 6, 14102-1410214 (2012).
  7. Tsai, H. F., et al. Evaluation of EGFR and RTK signaling in the electrotaxis of lung adenocarcinoma cells under direct-current electric field stimulation. PLoS One. 8, e73418 (2013).
  8. Hou, H. S., Tsai, H. F., Chiu, H. T., Cheng, J. Y. Simultaneous chemical and electrical stimulation on lung cancer cells using a multichannel-dual-electric-field chip. Biomicrofluidics. 8, (2014).
  9. Faupel, M., et al. Electropotential evaluation as a new technique for diagnosing breast lesions. Eur J Radiol. 24, 33-38 (1997).
  10. Szatkowski, M., Mycielska, M., Knowles, R., Kho, A. L., Djamgoz, M. B. Electrophysiological recordings from the rat prostate gland in vitro: identified single-cell and transepithelial (lumen) potentials. BJU Int. 86, 1068-1075 (2000).
  11. McCaig, C. D., Song, B., Rajnicek, A. M. Electrical dimensions in cell science. J Cell Sci. 122, 4267-4276 (2009).
  12. Das, T., Maiti, T. K., Chakraborty, S. Traction force microscopy on-chip: shear deformation of fibroblast cells. Lab Chip. 8, 1308-1318 (2008).
  13. Lin, F., Butcher, E. C. T cell chemotaxis in a simple microfluidic device. Lab Chip. 6, 1462-1469 (2006).
  14. Li, J., Zhu, L., Zhang, M., Lin, F. Microfluidic device for studying cell migration in single or co-existing chemical gradients and electric fields. Biomicrofluidics. 6, 24121-2412113 (2012).
  15. Tsai, H. F., Peng, S. W., Wu, C. Y., Chang, H. F., Cheng, J. Y. Electrotaxis of oral squamous cell carcinoma cells in a multiple-electric-field chip with uniform flow field. Biomicrofluidics. 6, 34116 (2012).
  16. Cheng, J. Y., Wei, C. W., Hsu, K. H., Young, T. H. Direct-write laser micromachining and universal surface modification of PMMA for device development. Sensors and Actuators B: Chemical. 99, 186-196 (2004).
  17. Chu, Y. W., et al. Selection of invasive and metastatic subpopulations from a human lung adenocarcinoma cell line. Am J Respir Cell Mol Biol. 17, 353-360 (1997).
  18. Cheng, J. Y., Yen, M. H., Kuo, C. T., Young, T. H. A transparent cell-culture microchamber with a variably controlled concentration gradient generator and flow field rectifier. Biomicrofluidics. 2, 24105 (2008).
  19. Cheng, J. -Y., Yen, M. -H., Hsu, W. -C., Jhang, J. -H., Young, T. -H. ITO patterning by a low power Q-switched green laser and its use in the fabrication of a transparent flow meter. Journal of Micromechanics and Microengineering. 17, 2316 (2007).
  20. Pu, J., Zhao, M. Golgi polarization in a strong electric field. J Cell Sci. 118, 1117-1128 (2005).
  21. Zhao, M., Bai, H., Wang, E., Forrester, J. V., McCaig, C. D. Electrical stimulation directly induces pre-angiogenic responses in vascular endothelial cells by signaling through VEGF receptors. J Cell Sci. 117, 397-405 (2004).
  22. Yao, L., Shanley, L., McCaig, C., Zhao, M. Small applied electric fields guide migration of hippocampal neurons. J Cell Physiol. 216, 527-535 (2008).

Tags

Биоинженерия выпуск 106 акрил Микрожидкостных электротаксис аденокарциномы легкого одновременно химическая / электрический эффект полиметилметакрилат ПММА
Электротаксис Исследования клетки легких рака с использованием многоканального Dual-электрического поля микрофлюидных Chip
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hou, H. S., Chang, H. F., Cheng, J.… More

Hou, H. S., Chang, H. F., Cheng, J. Y. Electrotaxis Studies of Lung Cancer Cells using a Multichannel Dual-electric-field Microfluidic Chip. J. Vis. Exp. (106), e53340, doi:10.3791/53340 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter