Abstract
Beteendet hos riktningscellmigration under ett likströms elektriskt fält (dcEF) benämnes electrotaxis. Den signifikanta rollen för fysiologisk dcEF i vägleda cellförflyttning under embryoutveckling, celldifferentiering, och sårläkning har påvisats i många studier. Genom att tillämpa mikroflödessystem marker till en electrotaxis analys är utredningsprocessen förkortas och experimentella fel minimeras. Under de senaste åren, mikrofluidikanordningar tillverkade av polymera substanser (t.ex., polymetylmetakrylat, PMMA, eller akryl) eller polydimetylsiloxan (PDMS) har använts i stor utsträckning för att studera svaren hos celler på elektrisk stimulering. Men till skillnad från de många steg som krävs för att tillverka en PDMS enhet, enkel och snabb uppbyggnad av akryl micro fl uidic chip gör den lämplig för både enhet prototyper och produktion. Men ingen av de rapporterade enheter underlätta effektiv studier av samtidiga kemiska och DCEF effekter på celler. I denna rapport beskriver vi vår design och tillverkning av en akrylbaserad flerkanaliga med dubbla elektriska fält (MDF) chip för att undersöka samtidig effekten av kemisk och elektrisk stimulering på lungcancerceller. MDF-chip ger åtta kombinationer av elektriska / kemiska stimuli i ett enda test. Chipet inte bara kraftigt förkortar den erforderliga experimentella tid men ökar också noggrannheten i electrotaxis studier.
Introduction
Beteendet hos vidhäftande celler som rör sig mot en anod eller katod i enlighet med en likström elektriskt fält (dcEF) benämnes electrotaxis. Den electrotactic cellers beteende spelar en betydande roll i embryogenes, nervregenerering, och sårläkning. 1 Tumörceller såsom råttprostatacancerceller, två bröstcancerceller, 3 och lung adenokarcinomceller 4-8 har visat electrotactic rörelse under ett applicerat dcEF . Den fysiologiska EF har mätts i körtelvävnader. 9,10 Electrotaxis har också rapporterats i körtelassocierade tumörceller. 2,3 Sammantaget electrotaxis av cancerceller anses vara en metastas faktor. 11 styra den elektriska ledning av cancerceller under dcEF kan vara en potentiell strategi för den framtida behandlingen av cancer. Men i dag, den detaljerade molekylära mekanismen för electrotaxis fortfarande kontroversiell. Därför, en undersökning av influence av elektrisk stimulering om cancercellmigration kan underlätta utvecklingen av strategier för cancerbehandling.
Nyligen har bio-mikroflödes anordningar tillverkas för att studera cellulära svar att strömma skjuvkraft, 12 kemiska gradienter, 13 och elektriska stimuli 4 in vitro. Tillverkningen av bio-mikroflödes enheter med polydimetylsiloxan (PDMS) eller polymetylmetakrylat (PMMA, även känd som akryl) har framgångsrikt minskat felfrekvens på sådana experiment. Dessutom, med hjälp av akrylbaserade mikrofluidikanordningar som en prototyp för att undersöka biologiska ämnen är enklare än att använda PDMS marker. Olika funktioner i akrylbaserade anordningar har utvecklats för electrotaxis studien. Men ingen av de tidigare konstruktioner har möjlighet att samtidigt testa effekterna av olika kemiska förhållanden och det elektriska fältet på celler för electrotaxis studien. Därför utvecklade vi en mikrofluidikanordning-multichannel dubbla elektriskt fält (MDF) spån innehållande fyra oberoende odlingskanaler och åtta olika experimentella förhållanden i ett chip.
Akrylbaserade MDF chip, rapporterades först av Hou et al., 8 integrerar elektrisk stimulering och flera kemiskt isolerade kanaler. Dessa kemiskt isolerade kanaler kan användas för att odla olika typer av celler i ett experiment. Den dcEF i kanalerna är producerad av en elektrisk kraftkälla. Två oberoende elektriska fält, en med tillämpad elektriska fältstyrkan (EFS) och en annan med 0 EFS, genomförs i varje kemiskt isolerad kanal. På detta sätt åstadkommer spån bättre kontrollerade samexisterande EF och kemisk stimulering. Dessutom resultat från numerisk simulering av kemiska diffusion inne i MDF chip indikerar att ingen korskontaminering inträffade mellan kanalerna efter en 24 timmars försöksperiod. 8
Jämfört med device rapporterats av Li et al., ger 14 MDF chip en större kulturområde, vilket gör det möjligt för ytterligare biokemisk analys av elektriskt stimulerade cellerna. Dessutom med MDF chip större observationsområde, kan observeras flera celler i provet, så att analysen av migrationshastighet eller riktadhet av de elektriskt stimulerade celler är mer exakt. De enkanaliga chip design av tidigare studier som rapporterats av et al. Et al. Huang 4 och Tsai 15 tillåter endast en typ av cell eller kemikalie som ska testas. Emellertid kan MDF chipet användas för att undersöka effekterna av olika kemikalier på electrotaxis, liksom effekterna av elektrisk stimulering på olika typer av celler. Med andra ord tillåter MDF-chip för effektiv undersökning av kemiska dos beroenden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Design och tillverkning av MDF Chip
- Rita en enskild akrylskikt mönster med hjälp av kommersiell programvara, som AutoCAD och spara mönstret.
- Granska utformningen av fyra lager akrylskiva mönster i figur 1A och bekräfta anslutningar mellan skikt.
- Tillverka alla akrylplattor och den dubbelhäftande tejp genom laserablation med användning av en CO2-laser ritsnål (figurerna 1B, 2A och 2B). 16
- Slå på laser ritsnål och ansluta maskinen till den styrande laptop.
- Kör kommersiell programvara och öppna mönstret utformas i steg 1.1 genom att klicka på "utformad mönsterfilen."
- Placera en bit tomt akryl blad eller dubbelhäftande tejp på XYZ skede av laser ritsnål.
- Ställa in fokus för laserstrålen på ytan av akrylarket eller dubbelhäftande tejp med en auto-alignment pinne som tillhandahålls av tillverkaren av laser ritsnål.
- Skicka den utformade mönster till laser ritsnålen för direkt bearbetning av akrylarket eller dubbelhäftande tejp.
- Ta bort skyddspapperet från akrylplattor med hjälp av pincett och blås ytan ren med kvävgas.
- Stapla akrylplattor och binda ihop dem under ett tryck av 2 kg / cm2 i en termisk bönder under 45 minuter vid 110 ° C för att bilda flöde / elektrisk stimulering skena.
- Bered mikroskoptäckglaset som cellodlings-underlaget i chippet.
- Sätt täckglaset i en färgnings burk och fylla burken med en tio-faldig utspädning av tvättmedlet som anges i materiallistan.
- Sätt täckglaset och färgning burk i en ultraljuds Steri-renare och rengör täckglaset under 15 min.
- Häll utspätt rengöringsmedel ur färgnings burken, fylla burken med destillerat vatten, och upprepa steg 1,5.2 3 gånger.
- Torka den rengjorda täckglas genom att blåsa den med kvävgas innan vidhäfta den till den dubbelsidiga tejpen.
- Följ den rengjorda täckglaset till flödet / elektrisk stimulering kanalaggregat med den dubbelsidiga tejpen mönstrad i steg 1,2.
- Följ 13 bitar av akryl adaptrar till de enskilda öppningarna i lager 1 i MDF chip montering med superlim. MDF chip montering är sedan klar (figur 2D).
- Sterilisera den kompletta MDF chipmontage med 30 min av UV-bestrålning före användning.
2. Inställning av Salt Bridge Network på MDF Chip
- Före användning, sterilisera alla plaströr, fingertäta nötter och mikrocentrifugrör som visas i fig 3B genom inställning av en hålltid av 15 minuter vid 121 ° C i autoklaven.
- Anslut fluoroplastic rören (Figur 3B-i) till MDF chipaggregatet via mediuminloppetoch utloppsadaptrar som visas i figur 1A.
- Anslut Luer avsmalningen hos mediuminloppet och utlopps plaströr i fig 3B-I till 3-vägs kranar.
- Ta 2,5 ml CO 2 -equilibrated fosfatbuffrad saltlösning (PBS) med användning av en 3 ml spruta och koppla sprutan till 3-vägs avstängningskran av inlopps plaströr. Anslut en tom 3 ml spruta till 3-vägskranen av utlopps plaströr. De två sprutorna är sålunda sammanlänkade genom MDF chipet.
OBS: Inkubera PBS i 37 ° C 5% -CO 2 cellodlingsinkubator O / N för erhållande av CO 2 -equilibrated PBS. - Täta öppningarna i blå och gröna adaptrar (Figur 1A) på Layer 1 PMMA-ark med vita fasta fingertäta muttrarna (Figur 3B-iii).
- Fyll saltbrygga kanaler och kulturkammare med CO2 -equilibrated PBS i sprutan som beskrivs i installations steg 2.4. Undvikabildandet av bubblor.
- Därefter satte CO2 -equilibrated PBS-innehållande MDF chip i 37 ° C 5% CO 2 cellodling inkubator för O / N inkubation. Detta medger att upplöst luft i den dubbelsidiga tejpen för att bilda bubblor i kamrarna.
- Spola bort bubblorna i kanalerna av en snabb PBS flöde i kanalen med hjälp av de två sprutorna. Pumpa PBS och tillbaka om det behövs.
- Dränera PBS i kanalerna via 3-vägskranen förbunden med mediet utloppsröret.
- Med hjälp av en ny 3-ml spruta, ta 2,5 ml CO 2 -equilibrated Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM) (se steg 3,5), och ersätta sprutan ansluten till inloppet med den nya. Fyll kanalerna med mediet.
- Framställning av saltet bryggnät.
- Tidsmässigt avlägsna de fasta muttrar (Figur 3B-iii) på de gröna adaptrar (Figur 1A) och injicera 3% varm (> 70 ° C) agaros in i salt briDGE kanalen genom öppningen i gröna adaptrar (Figur 1A).
OBS: Framställning av varm agaros: Lös 1,5 g agaros pulver i 50 ml PBS. Sterilisera genom inställning av en hålltid av 20 minuter vid 121 ° C i autoklaven. - Sluta injicera agarosen när vätskan fyller tre fjärdedelar av längden av saltbryggan kanalen.
- Täta porerna på de gröna adaptrar (Figur 1A) genom att skruva fast muttrarna (Figur 3B-iii) efter agarosen injektion.
- Byt ut fasta muttrarna på blå adapter (Figur 1A) med genomskinliga rörformiga fingertäta muttrar (Figur 3B).
- Fyll på 3% förvärmas agaros i de rörformiga muttrar (Figur 3B-IV).
- Bädda in Ag / AgCl-elektroder (Figur 3B-V) till de rörformiga muttrar (Figur 3B-iv) innanstelning av agarosen.
- Tidsmässigt avlägsna de fasta muttrar (Figur 3B-iii) på de gröna adaptrar (Figur 1A) och injicera 3% varm (> 70 ° C) agaros in i salt briDGE kanalen genom öppningen i gröna adaptrar (Figur 1A).
- När grundinställningen av saltet bryggnät, injicera CL1-5 lungcancerceller i odlingskamrarna, en kammare åt gången.
3. Beredning av cancerceller och ställa upp för Electrotactic Experiment
- Regelbunden kultur av lungcancercellinje CL1-5.
- Kultur CL1-5 lungcancerceller, erhållna från professor Pan-Chyr Yang, 17 i fullständigt medium i en 75T cellodlings kolv vid 37 ° C i en 5% CO 2 atmosfär. Den fullständigt medium är sammansatt av DMEM och 10% fetalt bovint serum (FBS). Subkultur cellerna var 3 till 4 dagar. De celler som används för att utföra electrotaxis experiment är mindre än 25 passager från den ursprungliga källan.
- Tillsätt 2 ml av 0,25% trypsin-buffert till de exponentiellt växande CL1-5 celler och inkubera under 2 min i 37 ° C 5% -CO 2 cellodlingsinkubator för cell detachment.
- Avsluta lösgör processen med 6 ml 10% FBS DMEM och centrifugera cellerna vid 300 g under 5 min vid RT. Sedan kasta på medellång och suspendera cellpelleten med 5 ml PBS.
- Räkna antalet celler i PBS. Så 1 x 10 6 celler och centrifugera vid 300 g under 5 min vid RT.
- Kassera PBS. Suspendera cellerna med förvärmda CO 2 -equilibrated DMEM och justera celldensiteten att vara 1 x 10 6 celler / ml.
OBS: Inkubera det kompletta mediet i 37 ° C 5% -CO 2 cellodlingsinkubator O / N för erhållande av CO 2 -equilibrated DMEM.
4. Ställ in för Electrotactic Experiment
- Från utloppet av MDF-chip, injicera 0,3 ml, 1 x 10 6 / ml, för cellerna i chipet.
- Inkubera cell-seedade MDF chip i cellodlingsinkubator (inställd på 37 ° C och 5% CO2) under 2-4 timmar.
- Uppsättning av MDF microfluidic systemet.
- Installera MDF mikroflödessystem på ett transparent indiumtennoxid glas (ITO) värmeelement. Mäta temperaturen på MDF-chip med ett termoelement av K-typ klippt mellan MDF chip och ITO glas. Styr ITO värmaren med en proportionell-integral-derivata (PID) regulator. Ställ MDF mikrofluidsystem inkubationstemperatur till 37 ° C med PID-regulatorn.
OBS: Tillverkningen av ITO värmaren och installationen av cellodlings värmesystem beskrivs i tidigare rapporter 18,19. - Montera temperaturreglerade MDF chip montering på datorstyrda XYZ motoriserade scenen på ett inverterat mikroskop. Användningen av motoriserade steget beskrivs i steg 5,1. Pump det kompletta mediet i odlingskamrarna genom inloppen med fyra-kanals sprutpump.
- Installera MDF mikroflödessystem på ett transparent indiumtennoxid glas (ITO) värmeelement. Mäta temperaturen på MDF-chip med ett termoelement av K-typ klippt mellan MDF chip och ITO glas. Styr ITO värmaren med en proportionell-integral-derivata (PID) regulator. Ställ MDF mikrofluidsystem inkubationstemperatur till 37 ° C med PID-regulatorn.
- Pump det kompletta mediet in i MDF-chipet med en flödeshastighet av 20 | j, l / timme. Kulturen avfall från utlåter samlas i mikrocentrifugrör (visas som "avfall" i figur 3A).
- Inkubera cellerna under ytterligare 16 till 18 h vid 37 ° C i MDF-chip.
- För att byta ut mediet, pumpa mediet innehållande 50, 25, 5, och 0 ^ M-kinashämmare, respektive, in i varje odlingskammare med en flödeshastighet av 20 ul / min under 10 min.
OBS: Bered en 10 mM stamlösning av Rho-associerade proteinkinasinhibitor Y27632 genom tillsats av 3 ml sterilt vatten till 10,6 mg kinashämmare. Späd 10 mM stamlösning till 50, 25, och 5 pM, respektive, med användning av 10% FBS DMEM-medium. - Inkubera cellerna i kinashämmare för en annan 60 minuter vid 37 ° C. Ställ in medelhastigheten flödet till 20 fil / h. Använd samma odlingstemperaturen och flödeshastigheten beskriven ovan i senare steg.
- Använd elektriska ledningar för att ansluta en likström till MDF chip via Ag / AgCl elektroder på chipet.
- Serie ansluta en amperemeter in den elektriska kretsen. Använd amperemätaren för att övervaka den elektriska strömmen i MDF-chip.
- Slå på DC strömförsörjning och ställ in amperemeter strömmen till 86,94 iA genom att justera matningsspänningen till mellan 15 och 19 V.
OBS: Med tanke Ohms lag, E = I / (ZA eff), där I är den elektriska strömmen som flyter genom bulkmaterialet, dvs odlingsmediet i electrotactic kammaren, σ (= 1,38 Ω -1 m - 1) är den konduktivitet av odlingsmediet, A eff (= 0,21 mm 2 till 3 mm bredd x 0,07 mm höjd) är den effektiva tvärsektionsarean hos electrotactic kammaren, och den elektriska strömmen (I) som krävs för att generera en 300 mV / mm EF i MDF-chip är 86,94 iA.
5. Förvärv och analys av cellbilder
- Styr motoriserade scenen med hjälp av ett MATLAB GUI-program. Med MDF mikroflödessystem monterat på microscope, flytta chipet till observationsområden med hjälp av motoriserade scenen.
- Spela cellbilder med hjälp av en digital spegelreflex (SLR) kamera monterad på mikroskopet.
- Ta mikroskopiska bilder med hjälp av en 4X objektiv med intervaller om 15 min under 2 timmar.
- Cellmigration analys.
- Kör NIH ImageJ 1,47 V.
- Analysera avståndet från den initiala till den slutliga positionerna för cellens centroiden.
- Gå till "Arkiv" → "Importera" → "bildsekvens" och importera nio bilder för cellmigrationsanalys. Den första bilden är resultatet av tiden noll, och den sista bilden är ett resultat av 120 minuter.
- Gå till "Analysera" → "Ställ Measurements" och markera rutan bredvid "Centroid"
- Klicka på ikonen "Freehand Selections".
- Skildrar kanten av de markerade cellerna i den första bilden.
- Gå till "Edit" → "Val" → "Lägg till Manager"
- Gå till den nionde bilden och visar kanten av samma celler som valts ut på den första bilden. Cell positioner kan spåras med hjälp av den andra till åttonde bilder.
- Gå till "Edit" → "Val" → "Lägg till Manager"
- Upprepa steg 5.4.5 till 5.4.9 för att samla in data från 90 till 100 celler.
- Gå till "Analyze" → "Measure" för att få resultatet av den inledande och avslutande positionerna för de markerade cellerna.
OBS: Migrationen hastighet definieras som den genomsnittliga cellrörelse längd per timme. Riktad definieras som cosinus, där är vinkeln mellan vektorn enligt dcEF (från anod till katod) och vektorn från startpunkten för en cell till sin slutliga ståndpunkt. Den riktadhet -1 för celler som migrerar mot anoden och en för celler som migrerar mot katoden. För en grupp av slumpmässigt migaller celler är 0. 2 riktad
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tillverkning och montering av MDF-enheten
Ett schematiskt diagram för den akrylbaserade MDF-chip visas i figur 1A. Fyra akrylskivor, ett skyddsglas, 13 akryl adaptrar och en bit av dubbelhäftande tejp användes vid monteringen av den färdiga MDF-chip (Figur 2D). Det finns bara fyra oberoende odlings kanaler i MDF-enheten. Emellertid skapar on-chip saltbrygga nätverk åtta olika experimentella förhållanden i de åtta segmenten av chipet. Tre saltbryggor (de blå kanaler i Skikt 2 i fig 1 A), 79, 90, och 80 mm i längd, kopplades till det andra skiktet av MDF-chip utan att störa bildobservation. De små porer (blå Cuboid kanaler i skikten 3 och 4 i fig 1A) mellan saltbryggan nätet och odlingskammare, som har en 00,25 mm 2 tvärsnittsarea, minimeras fluidflödet in i saltbryggan under experimentet. Odlings område av MDF chip är ca 74 mm 2 i varje segment. I denna demonstration, är cellodlingskamrar MDF-enheten bestående av 70 pm tjock dubbelhäftande tejp och skyddsglas. Men om olika cellodlingsbetingelser (t.ex., en kollagenbeläggning krav, lågt flöde skjuvning, eller stora odlingsmedium volym i odlingskammaren) behövs för electrotaxis forskning, både kultursubstrat och tejperna lätt kan bytas ut. Därför kan olika typer av celler användas för electrotaxis studie inom MDF chipet.
Konfiguration av MDF mikroflödessystem
Den mikroflödessysteminstallation MDF visas i figur 3A. De komponenter som visas i figur 3B är used att etablera medieflödet och den elektriska strömmen nätverk i MDF mikroflödessystem. Rören i samband med de ihåliga fingertäta muttrarna (röd och grön) och Luer vaxljus (bruna) i figur 3B-i används för att transportera medium till flödesnätverk MDF. Efter sprutorna anslöts till Luer smalnar och bosatte sig på fyra kanaler pump, rörledningssystemet flödet var fullständig. Odlingsmedium och avfallet transporteras genom rörledningssystemet. Eftersom anslutningen mellan rören och akryl adaptrar fästs med skruvkontakter kan MDF mediet nätverket tål högre hydraultryck än kan PDMS-systemet. På grund av den extremt låg luftpermeabilitet av akrylplattor och rören, är all kontakt mellan mediet nätverket och den yttre omgivningen blockeras. Därför förblir pH-värdet hos mediet i systemet stabilt och celler kan odlas med användning av MDF mikroflödessystem utanför en CO2-inkubator. Eftersom MDF chip installeras på en motordriven skede kan cellbilder tidsförlopp tas från åtta individuella sektioner. De öppna bottnade mikrocentrifugrör (Figur 3B-ii) är monterade på de genomskinliga rörformiga fingertäta muttrarna (Figur 3B-iv) för att öka volymkapaciteten av agaros. På detta sätt kan relativt stora elektroder införas i agarosen att åstadkomma stabil elektrisk stimulering till cellerna under längre tidsperioder.
Generation anges likström elektriska fältet i MDF-chip
Spänningen i varje kammare kan mätas via de implanterade elektroderna i den elektriska kretsen kopplade chips. Men vi inte mäta spänningen i kammaren. Snarare simulerade vi det elektriska fältet i saltbryggan nätet och cellodlingskamrar chipet. Fyra electrotactic kammare var seriellt conanslutna i de elektriska kretsarna. På detta sätt används samma elektriska strömmen upprätthålles i var och en av dessa kammare. Enligt Ohms lag, EFS korrelerar med arean av tvärsnittet av kamrarna i mikrofluidanordningen. Dessutom var alla PMMA blad och band tillverkas av CO2-laser ritsnål. Inriktningen av flismonteringsstyckena är exakt och de strukturella bristerna i chipet är minimala. Sålunda bör EFS i varje kammare förblir stabila. De elektriska fältsimuleringsresultat visar en homogen fördelning av EFS med 300 och 0 mV / mm under de första halvorna och de återstående halvorna av kulturkammare i enheten (data visas ej). Tidigare rapporter från vårt labb, Huang et al. och Tsai et al., har visat att skillnaden i uppmätta och simulerade EFS-värdena var mindre än 4%. 4,15 Resultatet visar att det i vårt system motsvarar den uppmätta elektriska fältet väl med den simulerade värde. I det här inlägget work införde vi stora Ag / AgCl-elektroder för att åstadkomma en stabil elektrisk ström under en längre experiment. Den applicerade strömmen på MDF chip minskade endast 1,85 ± 0,19% efter 7 timmar av EF stimulering i electrotaxis experiment. Dessutom den längsta perioden av elektrisk stimulering var fyra timmar i vår studie. Därför tror vi att ingångs elektrisk ström förblir stabil under electrotaxis tester, och det elektriska fältet i electrotactic kamrarna i MDF chip övervakas av seriekopplade amperemeter.
Undersökning av electrotaxis av lungcancerceller med användning MDF mikroflödessystem
Den electrotactic reglering av Rho-associerad ringlad-coil-kinas (ROCK) har visats på kinesiska hamsterovarie (CHO), 20 endotel, 21 och neuronala celler 22, men har ännu inte undersökts för lungcancer calnar. Därför ROCK-inhibitor, Y27632, anbringades på MDF mikrofluidsystem för att studera dess effekt på de electrotaxis av lungcancerceller. Såsom visas i fig 4, behandling av Y27632 visade ingen effekt i att förändra cellmigration hastigheten med eller utan elektrisk stimulering. Men tillämpningen av Y27632 till cancerceller under dcEF (300 mV / mm) minskade sin anodiska migration betydligt. Vid 50-iM koncentration, ROCK-hämmare eliminerat anodiska rörelse lungcancerceller men inte påverka deras migrationshastighet. Dessutom fanns en dosberoende samband mellan de applicerade kemiska koncentrationer och riktadindex (Figur 4B). Dessa resultat tyder på att MDF mikroflödessystem är pålitliga och effektiva för att studera electrotaxis.
Figur 1. Design av MDF-chip. (A) Schematisk bild av MDF-chip. MDF-enheten består av fyra skikt av akrylskivor (72 × 50 mm), 13 akryladaptrar (10 × 10 × 6 mm), dubbelhäftande tejp, och ett täckglas (24 × 60 mm). Tjockleken på Layer 2 akrylarket är 2 mm och de andra tre skikten är vardera 1 mm. I de lägre tre akryl skikt, är saltbryggan och medelstora nätverk flödes representeras av de blå och röda block, respektive. I det första akrylfolieskikt, var gröna akryl adaptrar används för insprutning av agaros. Blå adaptrar akryl användes som anslutningen till Ag / AgCl-elektroder. Det finns fyra cellodlingskammare i MDF-chip. Området och höjden på varje cellodlingskammaren är 148 mm 2 (3 × 46 mm) och 0,07 mm, respektive. De små blå kanaler på Lager 3 och 4 ansluta saltbryggan nätet till odlingskamrarna. Tvärsnittet av dessa anslutningskanaler är 0,25 mm
Figur 2. MDF chip tillverknings- och monteringsprocesser. (A) Mönstren av akryl blad och dubbelhäftande tejp ritsades av CO 2 laserbearbetning. (B) De enskilda akrylskikten ark tillverkades av en CO2-laser enligt konstruktionsritning. (C) Den rengjorda akrylskivas bands ihop med en termisk bondnings. (D) Avslutat MDF chip montering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. System för electrotaxis studie. (A) Schematisk beskrivning av system för electrotaxis experimentet. Rören är anslutna till MDF chip användes för medel infusion och avfall utflöde. Den dcEF i chippet genomfördes genom Ag / AgCl elektroder och strömförsörjning. Ställa in enheten installerades på XYZ motorstadium ett mikroskop. Cellbilder i chipet togs av en kommersiell digital SLR-kamera. (B) Ett fotografi av de komponenter i nätet medieflödet och dcEF generationen i MDF mikroflödessystem, inkluding (i) slangförbindningen, (ii) öppna botten mikrocentrifugrör, (iii) vitt fast med fingrarna mutter, (iv) genomskinliga rörformiga fingrarna mutter, och (v) Ag / AgCl-elektroder. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Effekt av Y27632 på lungcancercellmigrering under EFS av (A) noll och (B) 300 mV / mm. DcEF stimulering anbringades efter en 1 h förbehandling med den angivna koncentrationen av Y27632. Den elektriska stimuleringen varade i 2 timmar. Den kvantitativa analysen av riktadhet och hastigheten för cellmigration consititute ett representativt experiment. 90-100 celler användes i dataanalysen. * för P <0,001. Data uttrycks som medelvärde ± standardfel förmedelvärdet (SEM). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi hittade processen att fästa akryl adaptrar på Layer 1 av MDF-chip för att vara knepigt. Tillämpningen av bara 1 till 2 | il av superlim är tillräcklig för att stadigt fästa adaptern på MDF-chipet. Större mängder av lim resulterade i en ofullständig polymerisering av superlim och underlåtenhet att följa. När adaptrarna akryl var fast fäst på MDF-chip, vätskeläckage i mikroflödessystem sällan inträffade. Dessutom O / N inkubation inuti vakuumkammaren hjälpte till att avlägsna luften instängd mellan den dubbelhäftande tejp / skyddsglas eller dubbelhäftande tejp / akrylarket gränssnitt. Följaktligen förbättrar detta förfarande stabiliteten av odlingskammaren i MDF-chip.
Temperaturreglering av den 3% agaros under framställningen av saltet bryggnät är viktig. Om temperaturen på agarosen inte är tillräckligt hög under injektionen kommer agarosen snabbt stelna inuti sprutan och kan inteinjiceras i salt bryggnät. Dessutom under agaros injektion, är det viktigt att undvika varje bubbelbildning i salt bryggnät. Utseendet av bubblor ökar i hög grad det elektriska motståndet hos nätet och leder till experimentella fel. Dessutom, när agarosen stelnar under injektionen, kan det inte helt blockera vätskeflöde i saltbryggan kanalen. Som sådan, kan kemikalierna sedan enkelt läcka in i andra kanaler. Det bästa sättet är att injicera varm agaros i nätverket och sedan låta agarosen stelna inuti saltbrygga kanalerna.
Cellinjektion är en kritisk process i electrotaxis experimentet. För att säkerställa ett tillräckligt antal celler för cellsådd i odlingskammaren, injicerade vi överskott antal celler. I detta tillvägagångssätt ades celler som injiceras från utloppet. Injektions hastigheten skall vara långsam och även för att undvika en ojämn cell fördelning i odlingskammaren. Dessutom, eftersom denkanaler är isolerade i MDF krets måste injektionen ske en kanal åt gången. Sålunda är tidskrävande hela cellinjektionsprocessen. I framtiden kommer det att bli nödvändigt att skapa ytterligare en cellinjektion kanal som kan samtidigt implantat celler i alla fyra kulturkammare. Detta nya förfarande reducerar prowolymen, antalet celler som krävs för injektion, och operationstiden.
Det finns flera fördelar med att använda akryl snarare än PDMS som material för tillverkning av den mikrofluidanordning. En akrylbaserad anordning kan drivas direkt på en värmare utan en inkubator. Eftersom systemet inte kräver någon CO 2 tillförsel, kan celler odlas i ett akrylbaserad bio-mikroflödeschip på en regelbunden inverterat mikroskop med värmaren. Det är lättare att spela in cellbilder i chipet utanför en inkubator. Vi använde en allmänt tillgänglig kommersiellt digital SLR-kamera för att spela in cellbilder i systemet. Dessutom den mjukaware nödvändig för programmerbar styrning av kameran är också lätt tillgängliga. Detta gör time-lapse avbildning av cellerna lätt programmerbara. Därför är kostnaden för att bygga bio-mikroflödes auto-recording bildsystem är mycket lägre än för ett kommersiellt system. I motsats, när man använder en PDMS-baserade chip, måste systemet köras i en CO2-inkubator. Därför måste extra bildfärdskrivare köpas för drift i inkubatorn. Sådan utrustning är dyr, relativt skrymmande, och upptar en stor del av det begränsade utrymmet i cellodlingsinkubator. I en annan aspekt, i jämförelse med förfarandet enligt PDMS chiptillverkning, är den enkla och snabba tillverkningen av akryl mikro fl uidic chip lämpligt för både enheten prototyper och produktion. Dessutom, jämfört med PDMS-baserade enhet, är strukturellt mer stabil och mer lämpade för konstruktion av en komplicerad tredimensionell mikroflödes nätsystem akrylbaserade mikroflödeschip, som varutfördes med MDF chip i denna studie. On-chip saltbrygga nätverk i MDF-chip kan inte enkelt produceras i en PDMS baserad anordning. Detta nätverk minimerar den totala storleken på mikroflödessystem chip och gör electrotaxis forskning enklare och snabbare.
Inne i MDF chip, genererade vi bara två elektriska fältstyrkor (EFS, 0 och 300 mV / mm) i varje isolerad kanal. Emellertid MDF chipet och fler fältet electrotactic chip, såsom rapporterats av Huang et al., 4 delar en liknande kanaldesignen i cellodlingsområdet. Genom att ändra formerna hos odlingskammaren i MDF-chip, kan flera EFSs också alstras på MDF-chipet. Med dessa modifikationer kan multipel EFSs och flera kemikalier användas i samma test. Följaktligen kan en hög genomströmning screeningssystem skapas för att undersöka electrotaxis med användning av anordningen.
På bara ett experiment, är MDF chip kan testa effekterna avolika kemikalier på celler under dcEF eller influenser av elektrisk stimulering på olika typer av celler. Det kan även vara möjligt att implementera 20 isolerade parallella kanaler i MDF-chip utan att signifikant öka storleken för anordningen. 8 Såsom visas i detta arbete, i ett experiment, erhöll vi en signifikant dosberoende samband mellan riktadhet av cellmigration och Y27632 (Figur 4). MDF-chip med fyra kanaler ger helt klart en effektiv strategi för att studera electrotaxis i cancerceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| DMEM medium | Gibco,Invitrogen, USA | 12800-017 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco,Invitrogen, USA | 16000-044 | |
| Trypsin | Gibco,Invitrogen, USA | 25200-072 | |
| PBS | Basic Life | BL2651 | |
| Y-27632 (hydrochloride) | Cayman Chemical Co | 10005583 | |
| agarose | LONZO, USA | SeaKem LE AGAROSE | |
| syringe | Terumo | 3 ml with Luer taper | |
| 3-way stopcock | Nipro | with Luer taper | |
| PMMA (acrylic) | HiShiRon Industries CO., Ltd, Taiwan | thickness 1mm, 2mm | |
| acrylic adaptor | KuanMin Technology Co., Ltd, Taichung, Taiwan | 1/4-28 port, 10x10x6 mm | customized |
| nut | Thermo Fisher Scientific Inc. | UPCHURCH:P-206x, P-200x, F120x, P-659, P-315x | |
| Microscope cover glass | Deckgläser, Germany | 24x60 mm | |
| double-sided tape | 3M | PET 8018 | |
| super glue | 3M | Scotch Liquid Plus Super Glue | |
| TFD4 detergent | Franklab, France | TFD4 | |
| ultrasonic steri cleaner | LEO ULTRASONIC CO., LTD., Taiwan | ||
| Thermo bonder | KuanMin Technology Co., Ltd, Taichung, Taiwan | customized | |
| CO2 laser scriber | LTT group, Taiwan | ISL-II | |
| proportional-integral-derivative (PID) controller | JETEC Electronics Co., Japen | TTM-J40-R-AB, | |
| K-type thermocouple | TECPEL | TPK-02A | |
| 4-channel syringe pump | KdScientific, USA | 250P | |
| DC power supply | GWInstek, Taiwan | ||
| X-Y-Z motor stage | TanLian, E-O Co. Ltd., Taiwan | customized | |
| inverted microscope | Olympus, Japan | CKX41 | |
| digital SLR camera | Canon, Japan | 60D |
References
- McCaig, C. D., Rajnicek, A. M., Song, B., Zhao, M. Controlling cell behavior electrically: current views and future potential. Physiol Rev. 85, 943-978 (2005).
- Djamgoz, M. B. A., Mycielska, M., Madeja, Z., Fraser, S. P., Korohoda, W. Directional movement of rat prostate cancer cells in direct-current electric field: involvement of voltagegated Na+ channel activity. J Cell Sci. 114, 2697-2705 (2001).
- Pu, J., et al. EGF receptor signaling is essential for electric-field-directed migration of breast cancer cells. J Cell Sci. 120, 3395-3403 (2007).
- Huang, C. W., Cheng, J. Y., Yen, M. H., Young, T. H. Electrotaxis of lung cancer cells in a multiple-electric-field chip. Biosens Bioelectron. 24, 3510-3516 (2009).
- Huang, C. W., et al. Gene expression of human lung cancer cell line CL1-5 in response to a direct current electric field. PLoS One. 6, e25928 (2011).
- Sun, Y. S., Peng, S. W., Lin, K. H., Cheng, J. Y. Electrotaxis of lung cancer cells in ordered three-dimensional scaffolds. Biomicrofluidics. 6, 14102-1410214 (2012).
- Tsai, H. F., et al. Evaluation of EGFR and RTK signaling in the electrotaxis of lung adenocarcinoma cells under direct-current electric field stimulation. PLoS One. 8, e73418 (2013).
- Hou, H. S., Tsai, H. F., Chiu, H. T., Cheng, J. Y. Simultaneous chemical and electrical stimulation on lung cancer cells using a multichannel-dual-electric-field chip. Biomicrofluidics. 8, (2014).
- Faupel, M., et al. Electropotential evaluation as a new technique for diagnosing breast lesions. Eur J Radiol. 24, 33-38 (1997).
- Szatkowski, M., Mycielska, M., Knowles, R., Kho, A. L., Djamgoz, M. B. Electrophysiological recordings from the rat prostate gland in vitro: identified single-cell and transepithelial (lumen) potentials. BJU Int. 86, 1068-1075 (2000).
- McCaig, C. D., Song, B., Rajnicek, A. M.
- Das, T., Maiti, T. K., Chakraborty, S. Traction force microscopy on-chip: shear deformation of fibroblast cells. Lab Chip. 8, 1308-1318 (2008).
- Lin, F., Butcher, E. C. T cell chemotaxis in a simple microfluidic device. Lab Chip. 6, 1462-1469 (2006).
- Li, J., Zhu, L., Zhang, M., Lin, F. Microfluidic device for studying cell migration in single or co-existing chemical gradients and electric fields. Biomicrofluidics. 6, 24121-2412113 (2012).
- Tsai, H. F., Peng, S. W., Wu, C. Y., Chang, H. F., Cheng, J. Y. Electrotaxis of oral squamous cell carcinoma cells in a multiple-electric-field chip with uniform flow field. Biomicrofluidics. 6, 34116 (2012).
- Cheng, J. Y., Wei, C. W., Hsu, K. H., Young, T. H. Direct-write laser micromachining and universal surface modification of PMMA for device development. Sensors and Actuators B: Chemical. 99, 186-196 (2004).
- Chu, Y. W., et al. Selection of invasive and metastatic subpopulations from a human lung adenocarcinoma cell line. Am J Respir Cell Mol Biol. 17, 353-360 (1997).
- Cheng, J. Y., Yen, M. H., Kuo, C. T., Young, T. H. A transparent cell-culture microchamber with a variably controlled concentration gradient generator and flow field rectifier. Biomicrofluidics. 2, 24105 (2008).
- Cheng, J. -Y., Yen, M. -H., Hsu, W. -C., Jhang, J. -H., Young, T. -H. ITO patterning by a low power Q-switched green laser and its use in the fabrication of a transparent flow meter. Journal of Micromechanics and Microengineering. 17, 2316 (2007).
- Pu, J., Zhao, M. Golgi polarization in a strong electric field. J Cell Sci. 118, 1117-1128 (2005).
- Zhao, M., Bai, H., Wang, E., Forrester, J. V., McCaig, C. D. Electrical stimulation directly induces pre-angiogenic responses in vascular endothelial cells by signaling through VEGF receptors. J Cell Sci. 117, 397-405 (2004).
- Yao, L., Shanley, L., McCaig, C., Zhao, M. Small applied electric fields guide migration of hippocampal neurons. J Cell Physiol. 216, 527-535 (2008).
