Utilisant une bande Dissoudre Oralement pour les études pharmacologiques et toxicologiques: une alternative simple et Humane à Oral Gavage pour les animaux

Summary

Le protocole suivant décrit une nouvelle méthode pour l'administration de médicaments par voie orale chronique à l'aide d'une bande de dissolution par voie orale (ODS) au lieu de la méthode de gavage plus communément utilisée par voie orale. Nous démontrons que la délivrance de médicaments précliniques, par voie orale selon la méthode ODS représente une alternative sûre, pratique et humain de gavage oral.

Abstract

Avant de tester de nouveaux produits thérapeutiques chez l' homme, à court et à long terme préclinique (c. -à- animal), pharmacologique répétitif et les tests toxicologiques sont nécessaires. Dans la plupart des cas, la voie d'administration préférée est par administration orale. A l'heure actuelle, l'administration orale est le plus souvent réalisée en utilisant une procédure de gavage oral, en partie, parce qu'elle peut obtenir un dosage constant et précis dans le modèle animal. Bien que cette méthode est bien établi qu'il n'ont des complications qui peuvent entraîner un taux élevé d'attrition des animaux. A cette fin, la procédure instituée ici décrit une alternative à la méthode de gavage oral, dans lequel le médicament souhaité est incorporé dans un exhausteur de goût, la dissolution par voie orale bande (ODS) qui peut être simplement présentée à l'animal d'essai où il est ensuite repris rapidement avec manipulation minimale du sujet d'essai. Ici, nous démontrons que la délivrance de médicaments précliniques, par voie orale selon la méthode ODS représente un alte sûr, pratique et humainrnative à un gavage oral.

Introduction

Pour la traduction réussie d'un médicament à partir de (expérimentation animale) préclinique au développement clinique, une série de bien définie, les études pharmacologiques et toxicologiques aiguës et chroniques doivent être effectuées dans des modèles animaux en utilisant la voie d'administration clinique d'administration envisagée (qui est normalement la voie orale). Pour atteindre cet objectif, la plupart des études pré-cliniques utilisent actuellement une procédure de gavage oral étant donné que les résultats de cette méthode dans une prestation uniforme et précise du composé d'essai à l'animal. Cependant, dans de nombreux cas, par gavage oral est pas bien tolérée par l'animal et accumulation de preuves suggère que la méthode est associée à une quantité importante de stress induction ^1.

Cela est particulièrement vrai dans le développement de traitements pour les conditions de vie à long chroniques qui nécessitent des études précliniques à plus long terme, comme est le cas, mais sans s'y limiter, presque tous les troubles neuropsychiatriques. Pour instance, dans un modèle de souris transgénique de la maladie d'Alzheimer, il a été récemment suggéré que la méthode de gavage lui - même pourrait brouiller les résultats expérimentaux en raison de le dosage du stress ² induite. De même, dans un modèle de souris de la consommation d'alcool, les résultats non publiés de notre propre laboratoire ont montré que l'insertion répétitive du tube de gavage - en soi - peut réduire de manière significative le niveau de consommation d'alcool au point de mettre en péril l'intégrité de l'expérimentation paradigme (voir Figure 1).

Compte tenu des limitations mentionnées ci-dessus associés à la procédure de gavage oral, un effort considérable a été mis vers le développement de nouvelles méthodes de prestation préclinique de médicaments par voie orale. Approches actuelles comprennent l' incorporation du composé d'essai dans des mélanges de beurre d'arachide ^3, moules gélatineux ^4-5, pastilles de chocolat ^6, l' eau ^7, et des craquelins de plaquettes ⁸ potable, qui sont tous associATED avec des degrés de questions , y compris l'incapacité variant à utiliser de manière fiable dans le modèle animal, le manque d'adoption de l' absorption du composé d'essai par le sujet de test ou de préférence individuelle pour la saveur qui rend le médicament moins facilement consommé ^9.

La procédure introduite ici décrit un procédé dans lequel le médicament souhaité est incorporé dans une aromatisée, bande de dissolution par voie orale (ODS) qui peut être facilement et rapidement être utilisé pour administrer oralement le composé d'essai à l'animal d'essai. Ce document met l'accent sur la démonstration de l'efficacité de la méthode ODS en utilisant des souris. Cependant, il n'y a aucune raison de penser que la même méthode ne serait pas aussi utile dans d'autres rongeurs, ainsi que des sujets mammifères plus grands. Cliniquement, l'utilisation des SAO commence à être adoptée chez les patients pédiatriques et gériatriques, comme un moyen de surmonter les difficultés de déglutition ^10. Nous proposons que les SAO peut également être utilisé avec succès dans les programmes de découverte de médicaments précliniques comme un coffre-fort, pratiqueEt alternative humaine au gavage oral.

Protocol

Toutes procédure décrite ont été approuvés par le Comité institutionnel des animaux soin et l'utilisation (IACUC) de l'Université de Californie du Sud.

1. Manipulation des animaux et habituation

1. introduction
   1. Permettre aux souris à acclimater aux conditions d'élevage et de la technique de l'expérience de manipulation pour réduire le stress au cours des procédures d'administration de médicaments qui en découlent. Pendant ce temps, enregistrer le poids corporel et la consommation alimentaire de chaque souris; si on le désire, ils peuvent ensuite être utilisés comme point de comparaison pour évaluer la toxicité des médicaments (en option) non invasive. L'ancien peut également être utilisé pour déterminer en fonction du poids dosage des médicaments.
      Remarque: Soit dit en passant, la durée de la période d'habituation doit être déterminée en fonction du nombre d'expérimentateurs qui interagissent avec l'animal. Dans notre expérience, les souris de la souche C57BL / 6J ont été observés à avoir des problèmes habituant à la manipulation par plus de ~ 5 personnes au sein de notre période typique d'une semaine habituation. Si possible,expérimentateur (s) sont également encouragés à ne pas utiliser des lotions parfumées, savons et parfums avant de manipuler les animaux comme les rapports précédents indiquent de nouveaux stimuli, tels que les odeurs, peut entraver la période d'habituation ^11.
2. Des pas
   1. À compter au moins 5 jours avant le début de l'étude, le transfert des animaux à la pièce dans laquelle les expériences ultérieures auront lieu.
   2. Noter le poids de la souris en tenant fermement le milieu de la queue et soulevant doucement l'animal hors de la cage et dans le bateau de poids.
      1. Placez la souris sur l'échelle dès qu'il est sorti de l'cagekeeping à l' esprit de bien saisir l'aspect médial / proximal de la queue, pour éviter les blessures dégantage qui peuvent se produire en saisissant la partie distale de la queue ^12.
      2. Notez la valeur de poids une fois la souris a été placé en toute sécurité dans le bateau peser.
   3. Noter le poids de la nourriture pour une recommandé 2 jours consécutifs, afin d'établir des niveaux de consommation alimentaire de base qui vous aideront à capturer les toxicités potentielles lors de l'expérience ^13.

2. Préparation de l'alimentation Aiguille, Solution Sucrée et individuelle ODS

1. Utiliser un autoclave pour stériliser les aiguilles en acier inoxydable de gavage en acier en vue de l'expérience. Préparer 2 aiguilles / groupe et 1 aiguille supplémentaire pour être utilisé comme un back-up en cas de besoin.
   Remarque: Cette étude a utilisé une colonne de 1,5 pouces, courbes, G 18, en acier inoxydable aiguille d'alimentation d'une bille de 2,25 mm à l'extrémité de l'aiguille.
2. Ajouter 20 ml d'eau et 0,85 g de saccharose pour créer un 4,25% (p / v) d'une solution de saccharose.
   Remarque: En fonction des paramètres en cours d' évaluation d' autres faibles doses de saccharose pourraient également être utilisés ^14.
3. Préparer la bande de dissolution orale (ODS) pour chaque animal en coupant la bande de test standard rectangulaire dans une pièce qui est de 0,5 cm pouces de diamètre noustion d'un quart de pouce unique trou-perforateur disponible dans le commerce. La bande de test rectangulaire utilisé dans cette démonstration a été formulée pour contenir 6 mg d'ivermectine (IVM), et quand on les coupe à cette taille, alloue un 0,21 mg dose à chaque pièce circulaire individuelle se rapprochant d'une dose de 10 mg / kg pour chaque animal (notre désiré dose / animal). Cette dose peut être ajustée par la concentration / dilution de la formulation globale de la bande rectangulaire et / ou en coupant la bande en taille différente.

3. Drug - Livraison

1. Enregistrer les valeurs de poids comme décrit précédemment dans les étapes 1,1-1,2.
2. Après avoir enregistré le poids, déplacez la souris vers le haut métal grille de cage. Une fois là - bas, en utilisant le pouce dominant, l' index, et 3 ^ème doigt, tirez doucement sur ​​la queue. Cela entraînera la souris pour saisir, par inadvertance, le fil cage haut et étirer son dos, étirant son corps loin de l'expérimentateur.
3. Attrapez la peau du cou avec le non-dopouce minant, index et 3 ^ème doigt pour retenir confortablement l'animal avec une poignée qui est sécurisé.
   Remarque: Un expérimentateur avec une main plus faible peut également utiliser le 4 ^e doigt, de la même main, de se retirer la peau du dos et d' obtenir une prise plus sûre de la souris. En outre, selon la préférence individuelle, l' annulaire, et / ou petit doigt peut également être utilisé pour fixer la queue mais ce n'est pas nécessaire ^12.
4. Maintenir la souris dans une position verticale.
5. Attention: Observer la couleur des muqueuses de la souris. Un aspect violet / bleu est une indication que l'expérimentateur est cinching le scruff trop serré et la souris ne peut pas respirer.
   1. Si cela se produit, mettez immédiatement la souris vers le bas sur le dessus de la cage métallique et laisser reposer pendant environ 2-3 minutes avant de retenter d'empêcher l'animal.
6. Immerger la pointe de l'ampoule de l'aiguille de gavage dans une solution de saccharose 4,25% pour servir exhausteur de goûtadhésif à l'ODS.
7. Appuyez sur un ODS prédécoupés avec la pointe de l'ampoule de l'aiguille de gavage pour attacher la bande de dissolution par voie orale.
8. Présenter les ODS à la souris en le plaçant près des narines et / ou de la bouche, et permettre à l'animal de consommer le film. En variante, les ODS peuvent être livrés par voie topique dans la cavité buccale en plaçant la mince bande directement sur la langue pour les souris à avaler.
9. Remplacer l'aiguille mi-groupe au cours de la session de la drogue-dosage pour prévenir la propagation de l'infection.

Representative Results

Dans les enquêtes représentatives suivantes, boire social a été modélisée à l' aide d' un 24 h deux bouteilles choix ( à confirmer) paradigme comme décrit précédemment ^15. En bref, les souris ont eu accès à deux bouteilles de solution, dont l'une contient de l'eau, et l'autre à 10% (v / v) d'éthanol. Les sujets ont ensuite été affectés à des groupes de traitement de la toxicomanie de sorte que le 10E (10% d'éthanol / 90% d'eau v / v) la consommation moyenne était similaire entre les groupes.

La figure 1 illustre les effets de l' ivermectine (IVM) sur l' alcool de préférence administré par voie orale en utilisant un véhicule de gavage. Cette étude pilote avait 3 groupes: N / A, le placebo, et IVM représentant pas gavage, huile de maïs (véhicule) gavage et IVM (10 mg / kg, dilué dans de l'huile de maïs), respectivement gavage. Les souris ont été traitées pendant 10 jours, 5 jours consécutifs par semaine pendant 2 semaines. Comme on peut le voir ci-dessous, IVM a réussi à réduire de manière significative 10E iNtake à travers l'étude par rapport au groupe placebo. Par rapport à N / A, les valeurs d'apport d'éthanol du groupe placebo (~ 5 g / kg), sont beaucoup trop faible (48% inférieure à la N non gavées / Un groupe), et donc, ne peut pas être une représentation précise ou «modèle», du comportement de consommation sociale (~ 10-15 g / kg). Ce qui signifie que un facteur inconnu associé à la procédure de gavage a réussi à mettre en péril l'intégrité du paradigme de la consommation d'alcool.

La figure 2 montre la même expérience a ensuite effectuée en utilisant le système de délivrance de SAO ^15. L'étude avait 3 groupes: 1) pas de film orale, 2) citron vert pellicule orale aromatisée sans IVM et 3) citron vert pellicule orale aromatisée avec IVM (0,21 mg, ce qui est équivalent à 10 mg / kg administrées dans l'étude mentionnée ci-dessus ) dénommé contrôle placebo et IVM, respectivement. Les souris ont été traitées pendant 20 jours, 5 jours consécutifs par semaine pendant 4 semaines. Il n'y avait pas diffé significativerence de la consommation d'éthanol entre la N / A et les souris ayant reçu le placebo, ce qui indique que le groupe placebo ODS a représenté un contrôle valable avec laquelle une comparaison avec le groupe IVM pourrait alors être effectué. En accord avec les travaux antérieurs ^13,15, IVM considérablement et systématiquement réduit la consommation de 10E.

Une représentation schématique de la technique est représentée sur la figure 3.

Souris Figure 1. Contrôle gavées sont incapables de maintenir les niveaux d' éthanol d'admission Représentant du 24 h TBC Paradigm. Male C57BL / 6J ont été traités pendant 10 jours (5 jours consécutifs par semaine pendant 2 semaines). le traitement par gavage du véhicule du groupe placebo ont changé de manière significative les valeurs d'apport d'éthanol de 48% par rapport à la non-gavage N / groupe. Bien que l'IVM a réduit significativement la consommation de 10E par rapport àplacebo, les faibles valeurs d'admission 10E du groupe placebo ont ajouté une deuxième confondre à l'étude, ce qui pourrait avoir pour effet de compromettre l'utilité du groupe en tant que contrôle potable en quantité suffisante pour l'étude. rentrantes graphiques illustrent l'apport 10E moyenne au cours du traitement de 10 jours. Les valeurs représentent la moyenne ± écart-type pour n = 6-8 souris / groupe. +++ P <0,001 par rapport au placebo, et *** P <0,001 par rapport à N / A, la Turquie post-hoc de test. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2. Traitement ODS de l' IVM. Femme C57BL / 6J souris ont été traitées pendant 20 jours (5 jours consécutifs par semaine pendant 4 semaines). Traitement placebo ODS n'a eu aucun effet significatif sur la prise 10E, par rapport à l'extrémité N non traité / groupe A, en maintenant la Validity du placebo ODS comme témoin potable sociale adéquate. IVM a réduit significativement la consommation de 10E par rapport au contrôle de placebo. graphiques Inset illustrent l'apport de 10E moyenne sur le traitement de 20 jours. Les valeurs représentent la moyenne ± écart-type pour n = 6-8 souris / groupe. *** P <0,001 par rapport au placebo, Test Turquie post-hoc .. Ce chiffre a été modifié depuis Yardley et al. ¹⁵ S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3. Représentation Pictorial de livraison ODS. De représentation photographique de la procédure. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

Gavage oral est associée à de nombreuses complications qui résultent de la collecte des données potentiellement compromis et des taux élevés d'attrition des animaux ^1. Voici une méthode simple de délivrance de médicaments par voie orale est introduit à travers laquelle des souris (et potentiellement d'autres animaux) peuvent facilement et de manière fiable consommer le médicament de choix par le biais d'une bande de dissolution par voie orale (ODS). Notamment, l'utilisation de cette méthode représente une alternative sûre, pratique et humain de gavage oral.

D'autres alternatives actuelles à gavage oral, bien que quelque peu prometteur, sont associés à diverses limitations qui les empêchent de couvrir toute la gamme des besoins associés aux études de drogue-dosage, comme une incapacité à être utilisé chez la souris, ou les préférences individuelles pour la saveur qui font de la médicament moins facilement consommé ^9. En revanche, les SAO peuvent être formulés dans une large variété de saveurs qui est important que les préférences individuelles de la saveur peut changer au fil du temps et de la saveurles préférences peuvent varier selon les différentes souches et espèces.

manipulation des animaux adéquate est un élément essentiel de cette technique. Soulignant l'importance de la période d'habituation, il convient de noter qu'une souris donnée peut être plus difficile à retenir si elle est particulièrement jeune ou peu habitués à la manipulation. Toute difficulté à saisir la souris devrait se résorber au fil du temps que l'animal se familiarise à la manipulation et devient moins peur de l'expérimentateur (s). La souche de souris C57 illustré dans les résultats représentatifs a été observé pour habituer à la manipulation des procédures relativement rapidement (dans environ 1-3 sessions de manipulation). Bien que cette durée peut différer dans diverses espèces et souches, il n'y a aucune raison de supposer l'acclimation délai serait dégénérer de manière significative. techniciens débutants travaillant avec les rongeurs doivent être conscients que, quand il est suspendu et qui pendent dans l'air pendant plus de quelques secondes, les souris sont sensibles à l'élaboration d'un dégantageblessures à la queue ^12. Les chances de cette augmentation se produisant avec le poids de la souris ainsi que le positionnement de la main, avec une portée plus proche de l'extrémité de la queue plus susceptibles de causer une blessure. Spécifique à la portée de ce protocole, il est impératif que la souris est placé sur la grille métallique cage supérieure, ou dans un autre appareil, lorsqu'il est transféré de la cage à l'échelle, ainsi que dans la préparation pour l'administration de médicaments. Retenue pendant le processus de délivrance de médicament est une autre étape cruciale dans le protocole. la consommation de SAO peut se produire en plaçant le film mince près des narines et / ou de la bouche de la souris, dans ce cas, le sujet va se pencher en avant de consommer le film. En variante, les ODS peuvent être livrés par voie topique dans la cavité buccale en plaçant manuellement le film directement sur la langue pour la souris à avaler.

Les enquêtes qui impliquent l'évaluation des paramètres sensibles au stress peuvent être confondus par l'usage de l'homme normetechniques de retenue uel décrits dans ce protocole et de simples ajustements à la méthodologie peuvent facilement être faits pour accueillir des études dans lesquelles la retenue est interdite. Dans cette approche modifiée, l'ODS pourrait être placé directement dans la cage de l'animal à consommer. Observations tirées des études pilotes dans notre propre laboratoire indiquent que ce serait mieux réalisée en plaçant les animaux dans une cage sans literie / matériaux de nidification, juste pour la durée de la procédure de délivrance de médicaments, afin d'augmenter la facilité avec laquelle la consommation de SAO peut être contrôlée visuellement par l'expérimentateur (s). En outre, il pourrait être opportun d'engager une période de formation au cours de laquelle les animaux sont introduits à l'ODS afin qu'ils puissent surmonter l'évitement innée initiale de nouveaux aliments ^4. Bien sûr, d'autres études seront nécessaires pour optimiser un protocole sans contention pour la livraison des SAO, mais il n'y a aucune raison de croire qu'une telle procédure ne peut pas être fait avec facilité.

Notamment, en ce qui concerne la reproductibilité des données, ODS peuvent être formulées pour adhérer à la langue ou de la joue de l'animal et conçues pour la désintégration orale rapide pour libérer rapidement le médicament, assurant ainsi un dosage correct est atteint. Et, avec l'administration ODS, le besoin de gavage et d'autres expériences invasives désagréables pour l'animal est éliminé. Non seulement cela est plus humain, mais il minimise également les effets du stress comme une variable dans l'expérience. Il convient de noter eà la méthode ODS peut encore être optimisé, comme dans de nombreux nouveaux procédés de fabrication, qui peut en outre améliorer la pharmacocinétique du composé d'essai ODS est élargi pour des thérapies supplémentaires. Une limitation qui devrait être souligné concerne le fait que le développement des SAO est dans les premiers stades de développement. Les questions concernant le chargement des différentes drogues caractéristiques physico-chimiques sur la exhausteur de goût / plateforme ODS reste un défi à la polyvalence et à la généralisation de cette technique. Ceci est un domaine de recherche en cours.

La technique proposée est une technique simple et originale qui peut être adoptée pour une utilisation dans les études animales précliniques à court et à long terme et pour la fourniture de médicaments aux animaux (par exemple, les chiens). La livraison de drogue par le biais ODS représente une approche nouvelle, rapide, pratique et humaine par rapport aux approches traditionnelles existantes comme des comprimés, des capsules, des liquides, des poudres et des gels et, gavage oral.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Orally Dissolving Strip	Cure Pharmaceutical		Available upon special request. Alternatively, ODS may also be prepared in-house.
Gavage Feeding Needle	VWR	7912	Our rodent studies utilized a 18 gauge feeding needle. This size may need to be adjusted for use in other mammilian species.
Sucrose	Sigma Aldrich	S0389-500G