Summary
Следующий протокол описывает новый способ введения хронического пероральное лекарственное средство с использованием перорально растворяя полоску (СОД) вместо более распространенного метода оральной зондового. Показано, что доклинические, пероральной доставки лекарственного средства с использованием ODS метод представляет собой безопасный, удобный и гуманная альтернатива пероральной затравки.
Abstract
Перед тестированием новых терапевтических средств в организме человека, краткосрочной и долгосрочной перспективе доклинической (то есть, животных), повторяющихся фармакологические и токсикологические испытания требуется. В большинстве случаев предпочтительным способом введения является пероральным доставки. В настоящее время, пероральное введение, в основном, осуществляется с использованием пероральной процедуру через зонд, в частности, потому, что она может достичь последовательной и точной дозировки в животной модели. Хотя этот метод хорошо установлено, что действительно имеет осложнения, которые могут привести к высокой скорости животного истирания. С этой целью, процедура введена здесь описана альтернатива устного метода зондового, в котором желаемое лекарственное средство вводят в tastant, устно растворения полосы (ODS), который просто не может быть представлен к тестируемому животному, где она затем быстро поглощают минимальное манипулирование обследуемого. Здесь мы покажем, что доклинические, пероральной доставки лекарственного средства с использованием ODS метод представляет собой безопасный, удобный, и гуманного Alternative к оральному затравки.
Introduction
Для того, чтобы успешного перевода лекарства в доклинических (подопытных животных) в стадии клинической разработки, ряд четко определенных, острые и хронические фармакологические и токсикологические исследования должны быть выполнены в моделях на животных с использованием предполагаемого клинического пути введения (который как правило, пероральный путь). Для достижения этой цели, большинство доклинические исследования в настоящее время используют устную процедуру через зонд, учитывая, что этот метод приводит к последовательной и точной доставки тестируемого соединения животному. Тем не менее, во многих случаях, перорально через зонд не хорошо переносится животным и накапливать данные свидетельствуют о том, что метод связан со значительным количеством стресса индукции 1.
Это особенно актуально при разработке методов лечения хронических пожизненных условиях, которые требуют более долгосрочных доклинических исследований, таких, как в случае с, но не ограничиваясь этим, почти во всех психоневрологических расстройств. Для модулейстояние, в трансгенной мышиной модели болезни Альцгеймера, недавно было предложено , что сам метод с принудительным кормлением может запутать экспериментальные результаты из - за дозированием индуцированной стрессом 2. Точно так же, в мышиной модели потребления алкоголя, неопубликованные данные из нашей лаборатории обнаружили, что повторная вставка зондового трубки - в и себя - может значительно снизить уровень потребления алкоголя до точки ставит под угрозу целостность экспериментального парадигма (см рисунок 1).
Принимая во внимание вышеупомянутые ограничения, связанные с устной процедурой зондового значительные усилия были поставлены к разработке новых методов доклинической пероральной доставки лекарственных средств. Современные альтернативные подходы включают встраивание испытуемое соединение в арахисовое масло смесей 3, желатиновые формы 4-5, шоколадные гранулы 6, питьевой воды 7, и вафельных крекеры 8, все из которых являются associованные с различной степенью вопросов , в том числе невозможность быть надежно использованы в животной модели, отсутствие принятия тестируемого соединения поглощение тестируемого субъекта или индивидуальных предпочтений для вкуса , что делает препарат менее легко потребляется 9.
Процедура введена в настоящем документе описывается способ, в котором желаемое лекарственное средство вводят в ароматизированной, в устной форме растворяющейся полоски (ODS), который может быть легко и без труда использоваться для перорально администрировать тестируемого соединения испытуемого животного. Данная статья посвящена демонстрации эффективности СОД метода с использованием мышей. Тем не менее, нет никаких оснований ожидать, что тот же самый метод, который также не будет полезным и в других грызунов, а также более крупных млекопитающих. Клинически, использование ОРВ начинает приниматься в педиатрических и гериатрических пациентов, как способ преодолеть трудности с глотанием 10. Мы полагаем, что ODS также могут быть успешно использованы в доклинических программах поиска новых лекарственных препаратов, как безопасный, удобныйИ гуманной альтернативой пероральной затравки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Вся процедура описана были одобрены Animal Care и использование комитета Institutional (IACUC) из Университета Южной Калифорнии.
1. Животное Обработка и Привыкание
- Введение
- Разрешить мышей, чтобы акклиматизироваться к условиям земледелия и методики эксперимента обработки, чтобы уменьшить стресс в течение последующих процедур введения лекарственного средства. В течение этого времени, записывают массу тела и потребление пищи каждой мыши; При желании, они впоследствии могут быть использованы в качестве неинвазивной пункт сравнения для оценки токсичности лекарственного средства (по желанию). Прежний также может быть использован для определения на основе веса дозировки лекарственного средства.
Примечание: Анекдотично, длина периода привыкания должна быть определена на основе количества экспериментаторов, взаимодействующих с животным. По нашему опыту, наблюдались мышей / 6J штамма C57BL иметь проблемы приучая к обработке более чем ~ 5 человек в нашей типичной недельной период привыкания. Если это возможно,Экспериментатор (ы) также рекомендуется воздерживаться от использования душистые лосьоны, мыла и духов перед обращением с животными , как и предыдущие отчеты показывают новые стимулы, такие как запахи, может препятствовать период привыкания 11.
- Разрешить мышей, чтобы акклиматизироваться к условиям земледелия и методики эксперимента обработки, чтобы уменьшить стресс в течение последующих процедур введения лекарственного средства. В течение этого времени, записывают массу тела и потребление пищи каждой мыши; При желании, они впоследствии могут быть использованы в качестве неинвазивной пункт сравнения для оценки токсичности лекарственного средства (по желанию). Прежний также может быть использован для определения на основе веса дозировки лекарственного средства.
- меры
- Начиная по крайней мере, за 5 дней до начала исследования, передача животных в помещении, в котором будет происходить последующие эксперименты.
- Запишите вес мыши, крепко ухватившись за середину хвоста и аккуратно поднимая животное из клетки и в весовой лодки.
- Поместите курсор на шкале , как только она поднимается из cagekeeping в виду , чтобы правильно понять медиальной / проксимальных аспект хвоста, чтобы избежать травм скальпирующий, которые могут возникнуть при захватывая дистальной стороны хвоста 12.
- Запишите значение веса, как только мышь была благополучно помещена в взвешивании лодки.
- Запишите вес пищи для рекопочинил 2 дня подряд, с тем чтобы установить базовые уровни потребления пищевых продуктов , которые помогут захвата потенциальных токсичностью в ходе эксперимента 13.
2. Подготовка для кормления Needle, раствор сахарозы, а также индивидуальный ODS
- Используйте автоклав для стерилизации игл из нержавеющей стали с принудительным кормлением в рамках подготовки к эксперименту. Подготовьте 2 игл / группа и 1 дополнительный иглу для использования в качестве резервного варианта, если это будет необходимо.
Примечание: В данном исследовании использовали 1,5 дюйма, изогнутые, 18 г, из нержавеющей стали подавая иглы с 2,25 мм шару в конце иглы. - Добавить 20 мл воды к 0,85 г сахарозы, чтобы создать 4,25% (вес / объем) раствор сахарозы.
Примечание: В зависимости от параметров при оценке других низких доз сахарозы может также потенциально быть использованы 14. - Подготовить пероральная растворяющую полоску (ODS) для каждого животного путем разрезания стандартного прямоугольного тест-полоску в части, которая составляет 0,5 см дюймов в диаметре насING коммерчески доступный одиночный четверть дюйма отверстие-нокаутер. Прямоугольная индикаторная полоска используется в этой демонстрации была сформулирована, чтобы содержать 6 мг ивермектина (IVM), и при разрезании на этот размер, выделяет 0,21 мг дозу для каждого отдельного круговой части, аппроксимирующей 10 мг / кг в течение каждого животного (желаемых доза / животное). Эта доза может быть отрегулирована путем концентрирования / разбавления всей композиции на прямоугольной полосы и / или разрезания полосы на разного размера.
3. Drug - Доставка
- Запись значений веса, как описано выше в пунктах 1.1-1.2.
- После записи веса, переместите мышь к верхней металлической сетки клетку. Оказавшись там, используя доминирующую большой палец, указательный палец, и 3 - й палец, осторожно потяните на себя за хвост. Это приведет к мыши, чтобы нечаянно зажимают клетку верхней проволоки и протянуть свою спину, вытянув тело от экспериментатора.
- Возьмитесь за шиворот с не-доСМОРОДИНСКИЙ большой палец, указательный палец, и 3 - й палец , чтобы комфортно удержать животное с рукояткой , который является безопасным.
Примечание: экспериментатор с меньшим стороны также можно использовать 4 - й палец, той же руки, чтобы вытащить обратно загривок спину и получить более надежную фиксацию мыши. Кроме того, в зависимости от индивидуальных предпочтений, безымянного пальца и / или мизинца также может быть использован для закрепления хвоста , однако это не является необходимым 12. - Держите мышь в вертикальном положении.
- Внимание: обращайте внимание на цвет слизистых оболочек мыши. Фиолетовый / синий внешний вид является признаком того, что экспериментатор cinching загривок слишком плотно и мышь не может дышать.
- Если это произошло, немедленно поставить курсор вниз на верхней металлической клетке и дайте ему отдохнуть в течение ~ 2-3 минут до повторной попытки удержать животное.
- Погрузить кончик луковицы зондового иглы в 4,25% растворе сахарозы, чтобы служить в качестве tastantклей на ОРВ.
- Надавите на предварительно вырезанное ОРВ с наконечником луковичные зондового иглы, чтобы прикрепить устно растворяя полосу.
- Представить ODS к мыши, поместив его рядом с ноздрями и / или рот, и позволяют животному потреблять пленку. В качестве альтернативы ГДП могут быть доставлены местно в полость рта, поместив тонкую полоску непосредственно на язык для мышей проглотить.
- Замена иглы в середине группы во время сеанса лекарственной дозировки, чтобы предотвратить распространение инфекции.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В следующих представительных исследований, социальной питьевой был смоделирован с использованием 24 ч две бутылки выбор (TBC) парадигмы , как описано выше 15. Вкратце, мыши имели доступ к двум бутылкам раствора, одна из которых содержала воду, а другой 10% (об / об) раствор в этаноле. Субъекты были впоследствии отнесены к группам лечения наркотической зависимости, так что средний 10E (10% этанол / 90% вода / о) потребление было одинаковым во всех группах.
На рисунке 1 показаны эффекты ивермектина (ИВМ) на привилегированную питья при пероральном введении с использованием транспортного средства через зонд. Это экспериментальное исследование было 3 группы: N / A, плацебо, и IVM не представляющих не принудительным кормлением, кукурузное масло (транспортное средство) через желудочный зонд, и IVM (10 мг / кг, разводят в кукурузном масле) с принудительным кормлением соответственно. Мыши получали лечение в течение 10 дней, 5 последовательных дней в неделю в течение 2-х недель. Как можно увидеть ниже, IVM удалось значительно уменьшить 10E INtake по исследованию по сравнению с группой плацебо. По сравнению с N / A, значения потребления этанола в группе плацебо (~ 5 г / кг), являются слишком низкими (48% ниже, чем не-через желудочный зонд N / группа), и, таким образом, не может быть точным представлением , или "модель", социального поведения питьевой (~ 10-15 г / кг). Это означает, что неизвестный фактор, связанный с процедурой зондового удалось поставить под угрозу целостность питьевой парадигмы.
На рисунке 2 показан тот же самый эксперимент с использованием последовательно выполняется в ODS систему доставки 15. Исследование было 3 группы: 1) нет пероральное пленки, 2) лаймовый ароматизированной пероральной пленки с не IVM и 3) лаймовый ароматизированной пероральной пленки с IVM (0,21 мг, что эквивалентно 10 мг / кг в вышеупомянутом исследовании ) упоминается как контроль, плацебо и IVM соответственно. Мышей обрабатывали в течение 20 дней, 5 последовательных дней в неделю в течение 4-х недель. Там не было никакого существенного раключение контакта в потреблении этанола между N / A и плацебо лечение мышей, что свидетельствует о том, что СОД группа плацебо представляла собой действительный контроль, с помощью которого сравнение с группой IVM тогда можно было бы сделать. В соответствии с предыдущей работы 13,15, IVM значительно и последовательно снижается потребление 10E.
Наглядное представление метода показана на рисунке 3.
Мыши Рисунок 1. Контроль через желудочный зонд неспособны поддерживать Этанол Впускной Уровни Представитель 24 ч TBC Paradigm. У самцов мышей C57BL / 6J обрабатывали в течение 10 дней (5 последовательных дней в неделю в течение 2 -х недель). Транспортное средство лечения с принудительным кормлением из группы плацебо значительно измененные значения впускные этанола на 48% по сравнению с не-принудительным кормлением N / A группы. Хотя IVM существенно снижается потребление 10E по сравнению сплацебо, низкие значения потребления 10E группы плацебо добавили второй посрамить к изучению, что может оказать влияние снижения полезности группы в качестве адекватного контроля питьевой для изучения. Врезка графики иллюстрируют среднее потребление 10E в течение лечения 10 дней. Значения представляют собой среднее ± SEM при п = 6-8 мышей / группу. +++ P <0,001 по сравнению с плацебо, и *** р <0,001 по сравнению с N / A, Турция ретроспективном испытания. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. ODS Лечение IVM. Женский C57BL / 6J мышей обрабатывали в течение 20 дней (5 последовательных дней в неделю в течение 4 -х недель). Лечение Плацебо ODS не оказало существенного влияния на потребление 10E, по отношению к необработанной N / A группы, поддерживая Валидити плацебо ОРВ в качестве адекватного социального контроля питьевой. ИВМ значительно снижается потребление 10E по сравнению с плацебо-контролем. Врезка графики иллюстрируют среднее потребление 10E в течение лечения 20 дней. Значения представляют собой среднее ± SEM при п = 6-8 мышей / группу. *** Р <0,001 по сравнению с плацебо, Турция ретроспективном испытания .. Этот показатель был изменен с Ярдли и др. 15 Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3. наглядного представления ODS поставки. Фотографическое описание процедуры. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Желудочный зонд связан с многочисленными осложнениями , которые приводят к потенциально скомпрометированы сбор данных и высокий уровень животного убыли 1. Вот простой метод пероральной доставки лекарственного средства вводят через которые мышей (и потенциально других животных), легко и надежно может потреблять препаратом выбора через орально растворяющейся полоски (СОД). Следует отметить, что использование этого метода представляет собой безопасный, удобный и гуманная альтернатива пероральной затравки.
Другие текущие альтернативы пероральной затравки, хотя и несколько многообещающим, связаны с различными ограничениями, которые не позволяют им охватывающих весь спектр потребностей, связанных с изучением наркотиков дозирования, таких как невозможность использовать у мышей или индивидуальных предпочтений для аромата, которые делают препарат менее легко потребляется 9. В отличие от этого, СОД может быть сформулировано в широком разнообразии вкусов, который имеет важное значение в качестве индивидуальных предпочтений для вкуса могут изменяться с течением времени и вкусапредпочтения могут отличаться в различных штаммов и видов.
Правильное обращение с животным является одним из важнейших компонентов этой техники. Подчеркивая важность периода привыкания, следует отметить, что данная мышь может быть труднее сдерживать, если она особенно молодой или не привыкшие к обработке. Любая трудность захватывая мышь должна спадать с течением времени, как животное ознакомившись с обработкой и становится меньше опасаться экспериментатором (ов). Штамм мыши C57 видно на примере представительных результатов наблюдается приучить к обработке процедур относительно быстро (в течение примерно 1-3 сеансов обработки). Хотя эта продолжительность может отложить в различных видов и штаммов, нет никаких оснований считать акклиматизации сроки значительно возрастут. Начинающие специалисты, работающие с грызунами должны быть осведомлены, что, при зависании и оборванных в воздухе в течение более чем несколько секунд, мыши восприимчивы к развитию скальпирующийповреждение хвоста 12. Шансы что это произойдет увеличение с веса мыши, а также с позиционированием стороны, при обхвате ближе к кончику хвоста более вероятно, чтобы привести к травме. Конкретные сферы охвата этого протокола, крайне важно, чтобы мышь помещается на клетку сверху металлической сеткой, или в альтернативном устройстве, когда передаются из клетки в масштабе, а также в рамках подготовки к лекарственной доставки. Сдержанность в процессе доставки лекарственных средств является еще одним важным шагом в рамках протокола. Потребление ОРВ может происходить путем размещения тонкой пленки вблизи ноздрей и / или рот мыши, и в этом случае субъект будет наклониться вперед, чтобы потреблять пленку. В качестве альтернативы ГДП могут быть доставлены местно в полость рта, вручную помещая пленку непосредственно на язык для мыши, чтобы проглотить.
Исследования, которые включают оценку стресс-чувствительных параметров могут быть искажены использованием стандартного человекаметоды удерживающие UAL, изображенные в этом протоколе и простых корректировок в методологию можно легко сделать, чтобы приспособить исследования, в которых запрещена сдержанность. В этом модифицированном подходе ODS могут быть размещены непосредственно в клетке для животного, чтобы потреблять. Наблюдения почерпнутые из экспериментальных исследований в нашей лаборатории, показывают, что это было бы лучше всего быть выполнена путем размещения животных в клетке без постели / гнездового материала, только на время процедуры доставки лекарственного средства, с целью повышения легкости, с которой потребление ОРВ можно визуально контролировать экспериментатором (ов). Кроме того, было бы целесообразно инициировать подготовительный период , во время которого животные знакомятся с ОРВ таким образом , чтобы они могли преодолеть первоначальную врожденную предотвращение новой пищи 4. Конечно, необходимы дальнейшие исследования будут необходимы, чтобы оптимизировать удерживаемая свободный протокол для ODS доставки, однако нет никаких оснований полагать, что такая процедура не может быть сделано с легкостью.
Следует отметить, что с точки зрения воспроизводимости данных, СОД может быть приготовлена придерживаться языка или щеки животного и предназначен для быстрого орального дезинтеграции, чтобы быстро высвобождают лекарственное средство, тем самым обеспечивая правильное дозирование достигается. И, с ODS администрации, необходимость затравки и других неприятных инвазивных опыта для животного устраняется. Мало того, что это более гуманно, но она также сводит к минимуму последствия стресса в качестве переменной в эксперименте. Следует отметить, йна ODS метод можно дополнительно оптимизировать, как и во многих новых производственных процессов, что может дополнительно улучшить фармакокинетику тестируемого соединения в качестве СОД расширяется для дополнительных методов лечения. Одним из ограничений, которые следует отметить, что касается того, что развитие СОД на ранних стадиях развития. Вопросы, касающиеся загрузки различных физико-химических характерных препаратов над / ODS платформы tastant остается проблемой универсальности и обобщения этой техники. Это область продолжающегося расследования.
Предложенная методика представляет собой простой и новый метод , который может быть принят для использования в краткосрочных и долгосрочных исследованиях доклинические животных и для доставки лекарственных средств для животных (например, собак). Доставка лекарств по ОРВ представляет собой новый, быстрый, удобный и гуманный подход по сравнению с существующими традиционными подходами, как таблетки, капсулы, жидкости, порошки и гели и, перорально через зонд.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ДД подал заявку на патент в качестве соизобретателем об этом методе и заинтересован в обмене этот метод с научным комитетом , чтобы сделать этот метод хорошо известны и легко доступны для хронических испытаний на животных (пероральной доставки лекарственных средств Actives в лабораторных животных с использованием быстро- Растворение пероральные пленки (Davies, соизобретателем, заявка на патент подана 6-23-2014).
Не отмечены никакие другие конкурирующие между собой финансовые интересы.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить Джейми Thuy за техническую работу. Эта работа была поддержана, в частности, путем исследовательских грантов SC CTSI NIH / NCRR / NCATS - UL1TR000130 (DLD), AA022448 (DLD), и ОСК Школа фармации. Кроме того, быстро растворяющиеся пероральные пленки, содержащие IVM были любезно предоставлены Cure Pharmaceutical (Oxnard, CA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Orally Dissolving Strip | Cure Pharmaceutical | Available upon special request. Alternatively, ODS may also be prepared in-house. | |
| Gavage Feeding Needle | VWR | 7912 | Our rodent studies utilized a 18 gauge feeding needle. This size may need to be adjusted for use in other mammilian species. |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S0389-500G |
References
- Brown, A. P., Dinger, N., Levine, B. S. Stress produced by gavage administration in the rat. Contemp Top Lab Anim Sci. 39 (1), 17-21 (2000).
- Gonzales, C., et al. Alternative method of oral administration by peanut butter pellet formulation results in target engagement of BACE1 and attenuation of gavage-induced stress responses in mice. Pharmacol Biochem Behav. 126, 28-35 (2014).
- Walker, M. K., et al. A less stressful alternative to oral gavage for pharmacological and toxicological studies in mice. Toxicol Appl Pharmacol. 260 (1), 65-69 (2012).
- Zhang, L. Voluntary oral administration of drugs in mice. Protocol Exchange: Nature Publishing Group. , (2011).
- Froehlich, J. C., Hausauer, B. J., Federoff, D. L., Fischer, S. M., Rasmussen, D. D. Prazosin reduces alcohol drinking throughout prolonged treatment and blocks the initiation of drinking in rats selectively bred for high alcohol intake. Alcohol Clin Exp Res. 37 (9), 1552-1560 (2013).
- Goldkuhl, R., Carlsson, H. E., Hau, J., Abelson, K. S. P. Effect of subcutaneous injection and oral voluntary ingestion of buprenorphine on post-operative serum corticosterone levels in male rats. Eur Surg Res. 41 (3), 272-278 (2008).
- Marx, J. O., Vudathala, D., Murphy, L., Rankin, S., Hankenson, F. C. Antibiotic administration in the drinking water of mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 53 (3), 301-306 (2014).
- Ferguson, S. A., Boctor, S. Y. Use of food wafers for multiple daily oral treatments in young rats. J Am Assoc Lab Anim Sci. 48 (3), 292-295 (2009).
- Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. Administration of substances to laboratory animals: routes of administration and factors to consider. J Am Assoc Lab Anim Sci. 50 (5), 600-613 (2011).
- Bala, R., Pawar, P., Khanna, S., Arora, S. Orally dissolving strips: A new approach to oral drug delivery system. Int J Pharm Investig. 3 (2), 67-76 (2013).
- Potashkin, J. A., Blume, S. R., Runkle, N. K. Limitations of animal models of Parkinson's disease. Parkinsons Dis. 2011, (2010).
- Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. Journal of Visualized Experiments JoVE. (67), e2771 (2012).
- Yardley, M. M., et al. Ivermectin reduces alcohol intake and preference in mice. Neuropharmacology. 63, 190-201 (2012).
- Hoggatt, A. F., Hoggatt, J., Honerlaw, M., Pelus, L. M. A spoonful of sugar helps the medicine go down: a novel technique to improve oral gavage in mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 49, 329-334 (2010).
- Yardley, M. M., Huynh, N., Rodgers, K. E., Alkana, R. L., Davies, D. L. Oral delivery of ivermectin using a fast dissolving oral film: implications for repurposing ivermectin as a pharmacotherapy for alcohol use disorder. Alcohol. 49 (6), 553-559 (2015).
