Utnytte en muntlig Oppløsning Strip for farmakologiske og toksikologiske studier: En enkel og Humane Alternativ til oralt inntak for dyr

Summary

Følgende protokoll beskrives en ny fremgangsmåte for kronisk oral legemiddeladministrering ved hjelp av et oralt oppløsning av strimmel (ODS) i stedet for den mer vanlige oral gavage metode. Vi viser at preklinisk, muntlig stoff levering hjelp av ODS-metoden representerer en trygg, praktisk og humane alternativ til oral sonde.

Abstract

Før testing nye behandlingsformer hos mennesker, kort og lang sikt preklinisk (dvs. dyr), repetitive farmakologisk og toksikologisk testing er nødvendig. I de fleste tilfeller er den foretrukne rute for administrering via oral levering. På det nåværende tidspunkt, blir oral levering for det meste utført ved å bruke et oralt inntak prosedyre, delvis fordi den kan oppnå konsekvent og nøyaktig dosering i dyremodellen. Selv om denne metoden er vel etablert den har komplikasjoner som kan resultere i en høy forekomst av dyr nedsliting. For dette formål ble prosedyren innførte her beskriver et alternativ til oral føring fremgangsmåte hvor den ønskede medikamentet er innlemmet i et tastant, oralt oppløsning av bånd (ODS) som bare kan bli presentert til forsøksdyret hvor det da hurtig tatt opp i minimal manipulering av testpersonen. Heri, viser vi at preklinisk, muntlig stoff levering hjelp av ODS-metoden representerer en trygg, praktisk og human alternative til oral sonde.

Introduction

For en vellykket translasjon av et medikament fra preklinisk (dyreforsøk) til klinisk utvikling, en rekke veldefinerte, akutte og kroniske farmakologiske og toksikologiske studier må utføres i dyremodeller ved bruk av den tiltenkte kliniske administrasjonsvei (som er normalt oralt). For å oppnå dette målet, de prekliniske studier for tiden benytter et oralt inntak prosedyre gitt at denne metode fører til en konsekvent og nøyaktig levering av testforbindelsen til dyret. Men i mange tilfeller, oral gavage ikke er godt tolerert av dyret og akkumulerende bevis tyder på at metoden er forbundet med en betydelig mengde stress induksjons ^1.

Dette gjelder spesielt i utviklingen av behandlinger for kroniske livslang forhold som krever langsiktige prekliniske studier, som er tilfellet med, men ikke begrenset til, nesten alle nevropsykiatrisk lidelse. for insheten, i en transgen musemodell av Alzheimers sykdom, er det nylig foreslått at gavage metoden selv kunne forvirre eksperimentelle resultater på grunn av dosering indusert stress ^2. Tilsvarende, i en musemodell av alkoholforbruk, er upubliserte resultater fra vårt eget laboratorium funnet at den repeterende innsetting av tvangsforing tube - i og av seg selv - kan redusere nivået av alkoholinntak til punkt risikere integriteten av den eksperimentelle paradigmet (se figur 1).

Gitt de nevnte begrensningene forbundet med oral sonde prosedyren, har betydelig innsats blitt satt mot å utvikle nye metoder for preklinisk muntlig stoff levering. Nåværende alternative tilnærminger inkluderer å innlemme testforbindelsen i peanøttsmør blandinger ^3, gelatinøse muggsopp ^4-5, sjokolade pellets ^6, drikkevann ^7, og wafer kjeks ^8, som alle er associrerte med varierende grad av problemer, inkludert manglende evne til å bli brukt på en pålitelig måte i dyremodellen, manglende innføring av testforbindelsen opptak i testpersonen eller individuell preferanse for smak som gjør stoffet mindre lett forbrukes ^9.

Prosedyren innført heri, beskrives en fremgangsmåte hvor den ønskede medikamentet er innlemmet i en smakstilsatt, oralt oppløsning strimmel (ODS) som kan være enkelt og lett kan brukes til å oralt administrere testforbindelsen til forsøksdyret. Artikkelen omhandler demonstrere effektiviteten av ODS-metoden ved bruk av mus. Det er imidlertid ingen grunn til å forvente at den samme fremgangsmåte ikke vil også være nyttig i andre gnagere, så vel som større pattedyr. Klinisk, er bruken av ODS begynner å bli vedtatt i pediatriske og geriatriske pasienter, som en måte å overvinne svelge ^10. Vi foreslår at ODS kan også brukes med hell i prekliniske drug discovery programmer som en trygg, praktiskOg humane alternativ til oral sonde.

Protocol

All prosedyren som er beskrevet er godkjent av Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) ved University of Southern California.

1. Animal Håndtering og Tilvenning

1. Introduksjon
   1. Tillat mus å akklimatisere bruksforholdene og håndtering teknikk av forsøket for å redusere stress under de påfølgende Drug Administration prosedyrer. I løpet av denne tid, registrerer kroppsvekt og matinntak hos hver mus; hvis det er ønskelig, kan de senere anvendes som en ikke-invasiv punkt til sammenligning for å vurdere medikamenttoksisitet (valgfritt). Førstnevnte kan også brukes til å bestemme vektbasert medikamentdosering.
      Merk: Anecdotally, bør lengden på tilvenning periode fastsettes basert på antall forskere i samspill med dyret. I vår erfaring, har mus av C57BL / 6J belastningen blitt observert å ha problemer habituating til håndtering av mer enn ~ 5 mennesker innenfor vår typiske ukelange tilvenning periode. Hvis mulig,eksperimentator (e) er også oppfordret til å avstå fra å bruke duftende kremer, såper og parfymer før du håndterer dyrene som tidligere rapporter tyder på nye stimuli, for eksempel lukt, kan hindre tilvenning perioden ^11.
2. Steps
   1. Begynnelsen på minst 5 dager før igangsetting av undersøkelsen Dyrene overføres til rommet hvor de etterfølgende eksperimenter vil oppstå.
   2. Ta opp vekten av musen ved å ta godt tak i midten av halen og forsiktig løfte dyret ut av buret og inn i vekt båten.
      1. Plassere musen på skalaen så snart den er løftet ut av cagekeeping i tankene for å gripe ordentlig mediale / proksimale aspekt av halen, som for å unngå degloving skader, som kan oppstå når fatte den distale del av halen ^12.
      2. Ta opp vekten verdien etter at mus er blitt trygt plassert i veie båten.
   3. Spill vekten av mat for en anbebøtes 2 dager, for å etablere basislinje mat forbruksnivå som vil bidra til å fange potensielle toksisitet under eksperimentet ^13.

2. Utarbeidelse av Feeding Needle, Sukrose Solution, og Individual ODS

1. Bruk en autoklav å sterilisere rustfritt stål sonde nåler i forberedelsene til forsøket. Forbered to nåler / gruppe og en ekstra nål som skal brukes som en back-up hvis behovet være.
   Merk: Denne studien anvendes et 1,5 inches, buede, 18 G, rustfritt stål mater nål med en 2,25 mm pasning i enden av nålen.
2. Tilsett 20 ml vann til 0,85 g sukrose for å lage en 4,25% (vekt / volum) sukrose-løsning.
   Merk: Avhengig av parametere under vurderings andre lave doser av sukrose kan potensielt også brukes ^14.
3. Klargjør oral oppløsning stripe (ODS) for hvert dyr ved å kutte standard rektangulær teststrimmelen inn i et stykke som er 0,5 cm inches i diameter ossing en kommersielt tilgjengelig ett kvartal tommers hull-puncher. Den rektangulære strimmel som brukes i denne demonstrasjonen ble formulert for å inneholde 6 mg av ivermektin (IVM), og når kuttet til denne størrelse, tildeler en 0,21 mg dose for hver enkelt sirkulær brikke som er tilnærmet en kg dose 10 mg / for hvert dyr (vår ønsket dose / dyr). Denne dosen kan justeres ved å konsentrere / fortynning av den totale formuleringen på den rektangulære strimmel og / eller kutting av båndet inn forskjellig størrelse.

3. Drug - Levering

1. Registrere vektverdiene som tidligere beskrevet i trinn 1,1-1,2.
2. Etter registrering av vekt, beveger musen til metallrist buret toppen. Når du er der, ved hjelp av den dominerende tommelen, pekefingeren, og ^3. finger, trekk forsiktig tilbake på halen. Dette vil føre musen til utilsiktet grep ledningen buret toppen og strekke ut ryggen, strekker sin kropp vekk fra eksperimentator.
3. Ta tak i nakkeskinnet med den ikke-dominant tommelen, pekefingeren, og ^3. finger for å komfortabelt holde dyret med et grep som er sikker.
   Merk: En eksperimentator med en mindre hånd kan også bruke den ^4. finger, av samme hånd, å trekke tilbake Scruff av ryggen og få et sikrere grep på musen. I tillegg, avhengig av individuell preferanse, ringfinger, og / eller lillefinger kan også anvendes til å feste halen men dette er ikke nødvendig ^12.
4. Hold musen i en oppreist posisjon.
5. Forsiktig: Følg fargen på slimhinner av musen. En lilla / blå utseende er en indikasjon på at eksperimentator er cinching Scruff for hardt og musen kan ikke puste.
   1. Hvis dette skjer, må du umiddelbart sette musen ned igjen på metallburet toppen og la den hvile i ~ 2-3 min før gjøre en nytt forsøk for å holde dyret.
6. Senk pære spissen av nålen tvangsforing i 4.25% sukrose-oppløsning for å tjene som en tastantlim på ODS.
7. Trykk ned på en pre-cut ODS med pære tuppen av sonde nål til å feste muntlig oppløsning stripe.
8. Presenter ODS til musen ved å plassere den i nærheten av neseborene og / eller munn, og la dyret å konsumere filmen. Alternativt ODS kan leveres topisk til munnhulen ved å plassere den tynne strimmel direkte på tungen for musene for å svelge.
9. Bytt nål mid-gruppe under stoffet dosering økt for å hindre spredning av smitte.

Representative Results

I de følgende representative undersøkelser, ble sosial drikking modellert ved hjelp av en 24-timers to-flaske valg (TBC) paradigme som tidligere beskrevet ^15. I korthet mus hadde tilgang til to flasker oppløsning, hvorav den ene inneholdt vann, og den andre en 10% (v / v) etanol-løsning. Forsøkspersonene ble deretter tildelt behandlingsgruppene slik at gjennomsnittlig 10E (10% etanol / 90% vann v / v) inntak var lik på tvers av gruppene.

Figur 1 illustrerer effektene av ivermectin (IVM) på preferanse drikke når administrert oralt ved hjelp av en magesonde kjøretøy. Denne pilotstudien hadde 3 grupper: N / A, placebo, og IVM representerer ingen sonde, maisolje (kjøretøy) sonde, og IVM (10 mg / kg, fortynnet i maisolje) gavage hhv. Musene ble behandlet i 10 dager, 5 sammenhengende dager per uke for 2 uker. Som man kan se nedenfor, IVM var i stand til å redusere 10E intake tvers studien sammenlignet med placebogruppen. Sammenlignet med N / A, etanolinntak verdier for placebogruppen (~ 5 g / kg), er mye for lavt (48% lavere enn den ikke-gavaged N / A-gruppe), og således kan ikke være en nøyaktig representasjon eller "modellen", av sosial drikking atferd (~ 10-15 g / kg). Dette betyr at en ukjent faktor i forbindelse med gavage prosedyre klart å sette integriteten av drikke paradigme.

Figur 2 viser det samme eksperiment senere under anvendelse av den ODS leveringssystem ^15. Studien hadde 3 grupper: 1) ingen muntlig film, 2) key lime flavored oral film uten IVM og 3) key lime flavored oral film med IVM (0,21 mg, som tilsvarer 10 mg / kg gitt i den nevnte studien ) betegnet som kontroll, placebo og IVM, respektivt. Musene ble behandlet i 20 dager, 5 sammenhengende dager per uke i 4 uker. Det var ingen signifikant diffeRence på etanolinntak mellom N / A og placebo-behandlede mus, noe som indikerer at ODS placebogruppen representert et gyldig kontroll med hvilket en sammenligning med den IVM gruppen kan deretter bli gjort. Etter avtale med tidligere arbeid ^13,15, IVM betydelig og konsekvent redusert 10E inntak.

Et billedlig fremstilling av den teknikk som er vist i figur 3.

Figur 1. Gavaged Kontroll Mus kan ikke opprettholde Etanol inntak Representant for 24 timers TBC Paradigm. Mann C57BL / 6J mus ble behandlet i 10 dager (5 sammenhengende dager per uke for 2 uker). Kjøretøy gavage behandling av placebogruppen betydelig endret etanolinntak-verdier med 48% sammenlignet med den ikke-gavage N / A gruppe. Selv om IVM betydelig redusert 10E inntak i forhold tilplacebo, de lave 10E inntaksverdiene i placebogruppen lagt til en andre forvirre studien, noe som kan ha effekt av å svekke nytten av gruppen som en tilstrekkelig drikkevann kontroll for studien. Innfelte grafer viser gjennomsnittlig 10E inntak over 10 dagers behandling. Verdier representerer gjennomsnitt ± SEM for n = 6-8 mus / gruppe. +++ P <0,001 sammenlignet med placebo, og *** p <0,001 versus N / A, Tyrkia Post-Hoc test. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2. ODS Behandling av IVM. Female C57BL / 6J mus ble behandlet i 20 dager (5 sammenhengende dager per uke i 4 uker). Placebo ODS behandling hadde ingen signifikant effekt på 10E inntak, i forhold til den ikke-behandlede N / A gruppe, under opprettholdelse av Validity av placebo ODS som en tilstrekkelig sosial drikking kontroll. IVM betydelig redusert 10E inntak, sammenlignet med placebo kontroll. Innfelte grafer viser gjennomsnittlig 10E inntak over 20 dagers behandling. Verdier representerer gjennomsnitt ± SEM for n = 6-8 mus / gruppe. *** P <0,001 sammenlignet med placebo, Tyrkia Post-Hoc test .. Dette tallet har blitt forandret fra Yardley et al. ¹⁵ Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3. billedlig fremstilling av ODS Levering. Fotografisk skildring av prosedyren. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Oralt inntak er forbundet med en rekke komplikasjoner som resulterer i potensielt utsatt for datainnsamling og høy forekomst av dyr utmattelses ^en. Her er innført en enkel metode for muntlig stoff levering gjennom hvilke mus (og potensielt andre dyr) enkelt og pålitelig kan konsumere stoffet valgfrihet gjennom en muntlig oppløsning stripe (ODS). Spesielt, ved bruk av denne fremgangsmåte representerer en sikker, enkel, og humane alternativ til oral gavage.

Andre aktuelle alternativer til oralt inntak, men noe lovende, er forbundet med ulike begrensninger som utelukker dem fra å dekke hele spekteret av behov i forbindelse med narkotika dosering studier som en manglende evne til å bli brukt i mus, eller individuelle preferanser for smak som gjør stoffet mindre lett konsumert ^ni. I kontrast, kan ODS formuleres i et bredt spekter av smaker som er viktig som individuelle preferanser for smaken kan endre seg over tid og smakpreferanser kan variere på tvers av ulike stammer og arter.

Riktig dyr håndtering er en viktig del av denne teknikken. Fremhever betydningen av tilvenning periode, bør det bemerkes at en gitt mus kan være vanskeligere å holde hvis det er spesielt unge eller uvant å håndtere. Eventuelle problemer å ta tak i musen skal avta over tid som dyret er kjent for håndtering og blir mindre engstelig av eksperimentator (e). Den C57 musestamme eksemplifisert i de representative resultater har blitt observert å tilvenne til prosedyrene relativt raskt (innen ca 1-3 håndtering økter). Selv om dette varighet kan utsette på tvers av ulike arter og stammer, er det ingen grunn til å anta at akklimatisering tidsramme ville eskalere betydelig. Uerfarne teknikere som arbeider med gnagere bør være oppmerksom på at når de er suspendert og dingler i luft i mer enn noen få sekunder, mus er utsatt for utvikling av en deglovingskade på halen ^12. Sjansene for at dette skjer øker med vekten av mus så vel som med plassering av hånden, med et grep nærmere halespissen større sannsynlighet for å forårsake skade. Spesifikt for omfanget av denne protokollen, er det viktig at musen er plassert på metallgitterburet topp, eller i en alternativ anordning, når den overføres fra buret i målestokk, og i forberedelse for medikamentlevering. Restraint under medikamentleveringsprosessen er et annet kritisk punkt i protokollen. ODS forbruk kan skje ved å plassere den tynne filmen i nærheten av neseborene og / eller munn til mus, i hvilket tilfelle emnet vil lene seg fremover for å konsumere filmen. Alternativt ODS kan leveres topisk til munnhulen ved manuelt å plassere filmen direkte på tungen for musen til å svelge.

Undersøkelser som innebærer vurdering av stressfølsomme parametrene kan bli til skamme ved bruk av standard mannUAL holdeteknikker avbildet i denne protokollen og enkle justeringer til metodikken kan enkelt gjøres for å imøtekomme studier der tvang er forbudt. I denne modifiserte metode, kunne ODS plasseres direkte i buret for dyret å konsumere. Observasjoner sanket fra pilotstudier i vårt eget laboratorium tyder på at dette vil best kan utføres ved å plassere dyrene i et bur uten noen sengetøy / nesting materiale, bare for varigheten av medikamentleveringsprosedyren, for å øke den letthet med hvilken ODS forbruk kan visuelt overvåket av eksperimentator (e). Videre kan det være hensiktsmessig å sette i gang en treningsperiode i løpet av hvilken tid dyrene blir introdusert til ODS slik at de kan overvinne den innledende medfødt unngåelse av ny mat ^4. Selvfølgelig videre studier vil være nødvendig for å optimalisere en beherskelse frie protokoll for ODS levering, men det er ingen grunn til å tro at en slik prosedyre ikke kunne gjøres med letthet.

Spesielt i forhold til de data reproduserbarhet, ODS kan formuleres til å følge tungen eller kinnet av dyret og designet for rask oral oppløsning til raskt å frigjøre stoffet, og dermed sikre riktig dosering er oppnådd. Og med ODS administrasjon, er behovet for tvangsforing og andre ubehagelige invasive opplevelser for dyret elimineres. Ikke bare er dette mer human, men det også reduserer effekten av stress som en variabel i forsøket. Det bør bemerkes thved ODS metoden kan bli ytterligere optimalisert, som i mange nye produksjonsprosesser, noe som ytterligere kan forbedre de farmakokinetiske egenskapene til testforbindelsen som ODS blir ekspandert for ytterligere behandlinger. En begrensning som bør påpekes det gjelder det faktum at utviklingen av ODS er i de tidlige stadier av utviklingen. Spørsmål om lasting av forskjellige fysio karakteristiske narkotika over tastant / ODS-plattformen er fortsatt en utfordring for allsidighet og generalisering av denne teknikken. Dette er et område med pågående etterforskning.

Den foreslåtte teknikken er en enkel og ny teknikk som kan bli vedtatt til bruk i kort og lang sikt prekliniske dyrestudier og for levering av legemidler til dyr (for eksempel hunder). Drug levering gjennom ODS representerer en ny, rask, enkel og human tilnærming i forhold til de eksisterende tradisjonelle tilnærminger som tabletter, kapsler, væsker, pulver, og geleer og, oral sonde.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Orally Dissolving Strip	Cure Pharmaceutical		Available upon special request. Alternatively, ODS may also be prepared in-house.
Gavage Feeding Needle	VWR	7912	Our rodent studies utilized a 18 gauge feeding needle. This size may need to be adjusted for use in other mammilian species.
Sucrose	Sigma Aldrich	S0389-500G