Utilizando um Dissolver Faixa por via oral para estudos farmacológicos e toxicológicos: uma alternativa simples e Humane a sonda oral for Animals

Summary

O protocolo seguinte descreve um novo método para a administração de medicamentos por via oral crónica usando uma tira de dissolução por via oral (ODS), em vez do método de administração por sonda mais comumente usado por via oral. Nós demonstramos que a entrega de drogas pré-clínicos, oral utilizando o método ODS representa uma alternativa segura, conveniente e humana para sonda oral.

Abstract

É necessária antes de testar novas terapias em humanos, a curto e longo pré-clínico prazo (ou seja, animal), farmacológica repetitivo e testes toxicológicos. Na maioria dos casos, a via preferida de administração é através de distribuição oral. No presente momento, a administração oral é geralmente realizada usando um procedimento de gavagem oral, em parte, porque pode obter uma dosagem consistente e precisa no modelo animal. Embora este método está bem estabelecido que tem complicações que podem resultar em uma alta taxa de atrito dos animais. Para este fim, o procedimento apresentado aqui descreve uma alternativa ao método de sonda oral em que o medicamento desejado é incorporado um saborizante, por via oral dissolvendo tira (ODS) que pode ser simplesmente apresentado ao animal de teste, onde é, em seguida, rapidamente absorvido com manipulação mínima do sujeito de teste. Aqui, nós demonstramos que a entrega de drogas pré-clínicos, oral utilizando o método ODS representa uma alte segura, conveniente e humanizadornative para gavagem oral.

Introduction

A fim de que a tradução com êxito de uma droga a partir de (teste animal) pré-clínico para o desenvolvimento clínico, uma série de bem definida, os estudos farmacológicos e toxicológicos agudas e crónicas precisam ser realizadas em modelos animais utilizando o percurso clínico de administração pretendida (que é normalmente, a via oral). Para alcançar este objectivo, a maioria dos estudos pré-clínicos em curso utilizam um procedimento de gavagem oral dado que os resultados deste método de uma entrega consistente e precisa do composto de teste para o animal. No entanto, em muitos casos, gavagem oral não é bem tolerada pelos animais e evidências acumuladas sugerem que o método está associado a uma quantidade significativa de indução de stress ^1.

Isto é especialmente verdadeiro para o desenvolvimento de tratamentos para condições crónicas longo da vida que requerem estudos pré-clínicos de longo prazo, como é o caso de, mas não limitado a, quase todos os desordem neuropsiquiátrica. para instância, em um modelo de ratinho transgénico da doença de Alzheimer, foi recentemente sugerido que o método de administração por sonda em si pode confundir os resultados experimentais, devido à dosagem estresse induzido ^2. De modo semelhante, num modelo de ratinho de consumo de álcool, resultados não publicados do nosso próprio laboratório descobriram que a inserção repetitiva do tubo de gavagem - em si e por si - pode reduzir significativamente o nível de ingestão de álcool ao ponto de comprometer a integridade do experimental paradigma (ver Figura 1).

Dadas as limitações acima mencionadas associadas com o procedimento sonda oral, esforço considerável foi colocado para o desenvolvimento de novos métodos de entrega de droga oral pré-clínica. Abordagens alternativas correntes incluem incorporação do composto de teste em misturas de manteiga de amendoim, ^{3 4-5} moldes gelatinosas, grânulos de chocolate ^{6, 7} água, e bolachas bolacha ⁸ beber, todos os quais são assoated com diferentes graus de questões, incluindo a incapacidade de ser utilizado de forma confiável no modelo animal, a falta de adoção de captação composto de teste pelo sujeito de teste ou preferência individual para o sabor que faz com que a droga menos prontamente consumido ^9.

O procedimento aqui apresentado descreve um método em que o fármaco desejado é incorporado num sabor, por via oral dissolvendo tira (ODS) que pode ser facilmente e prontamente ser utilizado para administrar por via oral o composto de teste para o animal de teste. Este artigo centra-se na demonstração da eficácia do método ODS utilizando camundongos. No entanto, não existe razão para esperar que o mesmo método não seria também útil no outro roedor, bem como indivíduos mamíferos maiores. Clinicamente, a utilização de ODS está começando a ser adotado em pacientes pediátricos e geriátricos, como uma maneira de superar dificuldades de deglutição ^10. Propomos que ODS pode também ser utilizado com sucesso em programas de descoberta de drogas pré-clínicos como um seguro, convenienteE alternativa humana para sonda oral.

Protocol

Todos procedimento descrito foram aprovados pelo Comitê Institucional de Animal Care and Use (IACUC) da Universidade do Sul da Califórnia.

1. Manuseamento de animais e Habituação

1. Introdução
   1. Permitir que os ratos para se aclimatar às condições de criação e manipulação técnica do experimento para diminuir o estresse durante os procedimentos de administração de drogas que se seguiram. Durante este tempo, registrar o peso corporal e ingestão alimentar de cada rato; Se desejado, eles podem ser mais tarde utilizado como um ponto de comparação para determinar a toxicidade da droga (opcional) não-invasiva. O primeiro pode também ser usado para determinar a dosagem do medicamento baseada no peso.
      Nota: Curiosamente, a duração do período de habituação deve ser determinado com base no número de experimentadores que interagem com o animal. Em nossa experiência, os ratos da estirpe / 6J C57BL foram observados a ter problemas para habituar à manipulação por mais de ~ 5 pessoas dentro do nosso período típico de habituação de uma semana. Se for viável,experimentador (s) também são incentivados a se abster de utilizar loções perfumadas, sabonetes e perfumes antes de manusear os animais como os relatórios anteriores indicam novos estímulos, tais como cheiros, pode dificultar o período de habituação ^11.
2. Passos
   1. Começando pelo menos 5 dias antes do início do estudo, os animais transferir para a sala na qual ocorrerá as experiências subsequentes.
   2. Registar o peso do rato, segurando firmemente o meio da cauda e suavemente levantar o animal fora da gaiola e no barco peso.
      1. Colocar o rato sobre a escala, logo que ele é levantado para fora do cagekeeping em mente a agarrar correctamente o aspecto medial / proximal da cauda, ​​de modo a evitar lesões Degloving, que podem ocorrer quando se agarrar o aspecto distal da cauda ^12.
      2. Grave o valor do peso uma vez que o rato foi colocado com segurança no barco pesar.
   3. Registar o peso da comida para um recoremendado 2 dias consecutivos, a fim de estabelecer níveis de consumo de alimentos de base que irá ajudar a capturar potenciais toxicidades durante o experimento ^13.

2. Preparação de agulha de alimentação, sacarose Solution, e Individual ODS

1. Use uma autoclave para esterilizar as agulhas de administração forçada de aço inoxidável, em preparação para a experiência. Prepare 2 agulhas / grupo e 1 agulha adicional a ser usado como um back-up em caso de necessidade.
   Nota: Este estudo utilizou um 1,5 polegadas, curvado, 18 g, aço inoxidável agulha de alimentação com uma bola de 2,25 milímetros no final da agulha.
2. Adicionar 20 ml de água a 0,85 g de sacarose para criar um 4,25% (w / v) de solução de sacarose.
   Nota: Dependendo dos parâmetros em avaliação outras baixas doses de sacarose poderia também ser utilizado ^14.
3. Prepare a tira de dissolução oral (ODS) para cada animal, cortando a tira de teste padrão retangular em uma peça que é de 0,5 cm polegadas de diâmetro nosing um único quarto de polegada buraco-perfurador disponível no mercado. A tira de teste rectangular utilizado nesta demonstração foi formulada para conter 6 mg de ivermectina (IVM), e quando cortado com este tamanho, aloca uma dosagem de 0,21 mg a cada peça circular indivíduo aproximar uma dose de 10 mg / kg para cada animal (o nosso desejado dose / animal). Esta dose pode ser ajustada através da concentração / diluição da formulação total na faixa rectangular e / ou cortar a tira em tamanho diferente.

3. Drogas - Entrega

1. Registam-se os valores de peso como anteriormente descrito nos passos 1.1-1.2.
2. Depois de gravar o peso, mova o mouse para a parte superior do metal grade gaiola. Uma vez lá, usando o polegar dominante, dedo indicador e dedo ^3º, puxe de volta na cauda. Isso fará com que o mouse para agarrar inadvertidamente topo gaiola de arame e estende a sua parte de trás, esticando o corpo para longe do experimentador.
3. Segure a nuca com a não-dopolegar minant, dedo indicador e dedo ^3º para conter confortavelmente o animal com um aperto que é seguro.
   Nota: Um experimentador com uma mão menor também pode usar o ^4º dedo, do mesmo lado, para puxar para trás a nuca das costas e obter um porão mais seguro do mouse. Além disso, dependendo da preferência individual, dedo anelar, e / ou o dedo mindinho também pode ser utilizado para fixar a cauda no entanto, isto não é necessário ^12.
4. Segure o mouse em uma posição vertical.
5. Atenção: Observe a cor das membranas mucosas do mouse. A aparência roxo / azul é uma indicação de que o experimentador está apertando o pescoço com muita força e o mouse não pode respirar.
   1. Se isso ocorrer, imediatamente colocar o mouse de volta para baixo no topo gaiola de metal e deixe-a descansar por ~ 2-3 minutos antes de tentar novamente para conter o animal.
6. Mergulhar a extremidade de bolbo da agulha de gavagem em solução de sacarose a 4,25%, para servir como um saborizanteadesivo ao ODS.
7. Pressione para baixo em um ODS pré-cortados com a ponta do bulbo da agulha gavage para anexar a tira via oral dissolvendo.
8. Apresentar os ODS para o mouse, colocando-o perto das narinas e / ou boca, e permitir que o animal a consumir o filme. Em alternativa, os ODS podem ser entregues topicamente à cavidade oral, colocando a tira fina directamente sobre a língua para os ratinhos de engolir.
9. Substituir a agulha meados de grupo durante a sessão-dosagem droga para prevenir a propagação da infecção.

Representative Results

Nos seguintes investigações representativas, beber social foi modelado usando um 24 hr de dois garrafa escolha paradigma (TBC), como descrito anteriormente ^15. Resumidamente, os ratinhos tinham acesso a duas garrafas de solução, uma das quais continha água, e a outra solução de etanol a 10% (v / v). Os indivíduos foram subsequentemente designados para grupos de tratamento de drogas de modo a que o (etanol / 90% de água v / v a 10%) o consumo médio 10E foi semelhante em todos os grupos.

A Figura 1 ilustra os efeitos da ivermectina (IVM) em preferência beber quando administrados oralmente usando uma gavagem do veículo. Este estudo piloto teve 3 grupos: N / A, o placebo, e representando IVM não gavagem gavagem, óleo de milho (veículo), e IVM (10 mg / kg, diluída em óleo de milho) gavagem respectivamente. Os ratinhos foram tratados durante 10 dias, 5 dias consecutivos por semana, durante 2 semanas. Como se pode ver a seguir, IVM foi capaz de reduzir significativamente 10E iNtake todo o estudo, quando comparados com o grupo placebo. Em comparação com N / A, os valores de consumo de etanol do grupo placebo (~ 5 g / kg), são muito baixo (48% menor do que o N não-tratadas por gavage / grupo A) e, portanto, não pode ser uma representação precisa ou "modelo", do comportamento social potável (~ 10-15 g / kg). O que significa que um factor desconhecido associada com o processo de gavagem gestão de pôr em perigo a integridade do paradigma de beber.

A Figura 2 ilustra a mesma experiência realizada subsequentemente, utilizando o sistema de entrega de ODS ^15. O estudo teve 3 grupos: 1) nenhum filme oral, 2) key lime filme oral de sabor sem IVM e 3) key lime filme oral de sabor com IVM (0,21 mg, o que equivale a 10 mg / kg administrados no referido estudo ) referido como controle, placebo e IVM, respectivamente. Os ratinhos foram tratados durante 20 dias, 5 dias consecutivos por semana, durante 4 semanas. Não houve dife significativarência na ingestão de etanol entre o N / A e ratinhos tratados com placebo, indicando que o grupo do placebo ODS representado um controlo válido com o qual uma comparação com o grupo de IVM pode então ser feito. De acordo com trabalhos anteriores ^13,15, IVM significativamente e de forma consistente redução da ingestão 10E.

Uma representação pictórica da técnica é mostrado na Figura 3.

Ratos Figura 1. tratadas por gavage de controle são impossível manter os níveis de ingestão de etanol Representante da TBC Paradigm 24 hr. Masculinas C57BL / 6J foram tratados durante 10 dias (5 dias consecutivos por semana, durante 2 semanas). Veículo tratamento gavagem do grupo placebo alterou significativamente os valores de ingestão de etanol em 48% quando comparado com o não-gavagem N / grupo. Embora IVM reduzida significativamente em comparação com a ingestão 10Eplacebo, os valores de baixa ingestão 10E do grupo placebo adicionado um segundo confundem com o estudo, o que poderia ter o efeito de comprometer a utilidade do grupo de controlo como uma bebida adequada para o estudo. gráficos inserir ilustrar a ingestão média 10E sobre o tratamento de 10 dias. Os valores representam a média ± D.P. para n = 6-8 ratinhos / grupo. +++ P <0,001 versus placebo, e *** P <0,001 versus N / A, Turquia teste post-hoc. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2. Tratamento de ODS IVM. Ratinhos C57BL / 6J foram tratados durante 20 dias (5 dias consecutivos por semana durante 4 semanas). O tratamento com placebo ODS não teve efeito significativo na ingestão de 10E, em relação ao N não-tratados / um grupo, mantendo a validity de placebo ODS como um controle de beber social adequada. IVM reduziu significativamente a ingestão 10E relação ao controle placebo. gráficos inserir ilustrar a ingestão média 10E sobre o tratamento de 20 dias. Os valores representam a média ± D.P. para n = 6-8 ratinhos / grupo. *** P <0,001 versus Placebo, Turquia teste post-hoc .. Este valor foi modificado a partir Yardley et al. ¹⁵ Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3. representação pictórica de Entrega ODS. Representação fotográfica do procedimento. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

Sonda oral está associada a inúmeras complicações que resultam em coleta de dados potencialmente comprometida e altas taxas de desgaste dos animais ^1. Aqui um método simples de administração de fármaco oral é introduzido através da qual os ratinhos (e potencialmente outros animais) pode facilmente e de forma fiável consumir a droga de escolha por meio de uma tira de dissolução por via oral (ODS). Notavelmente, a utilização deste método representa uma alternativa segura, conveniente, e humana para administração por sonda oral.

Outras alternativas actuais para gavagem oral, embora um pouco promissor, estão associadas com várias limitações que os impedem de cobrir toda a gama de necessidades associadas com estudos de dosagem de drogas, tais como a incapacidade de ser usado em ratinhos, ou preferências individuais para o sabor que fazem o drogas menos prontamente consumido ^9. Em contraste, ODS podem ser formulados numa ampla variedade de sabores, que é importante como as preferências individuais de sabor pode mudar ao longo do tempo e saborpreferências podem diferir entre várias estirpes e espécies.

manuseio adequado dos animais é um componente essencial desta técnica. Destacando a importância do período de habituação, deve notar-se que um dado rato pode ser mais difícil de conter, se for particularmente jovem ou acostumados a manipulação. Qualquer dificuldade em entender o mouse deve diminuir ao longo do tempo como o animal está familiarizado ao manuseio e torna-se menos medo do experimentador (s). A estirpe de ratinhos C57 exemplificado nos resultados representativos tem sido observado para se habituar a lidar com procedimentos de forma relativamente rápida (dentro de cerca de 1-3 sessões de manipulação). Embora esta duração pode diferir em várias espécies e estirpes, não há nenhuma razão para supor o prazo de aclimatação aumentaria significativamente. inexperientes técnicos que trabalham com roedores deve estar cientes de que, quando suspensas e que oscila no ar por mais de alguns segundos, os ratinhos são susceptíveis ao desenvolvimento de um desenluvamentoprejuízo para a cauda ^12. A probabilidade de este aumento ocorra com o peso do rato, bem como com o posicionamento da mão, com um aperto mais próximo da ponta da cauda mais provável de causar uma lesão. Específico para o âmbito deste protocolo, é imperativo que o rato é colocado na parte superior da gaiola de grade de metal, ou em alternativa um aparelho, quando está a ser transferido da gaiola de escala, bem como, em preparação para administração de fármacos. Contenção durante o processo de entrega de droga é mais um passo crítico no âmbito do protocolo. consumo de ODS pode ocorrer através da colocação da película fina perto das narinas e / ou boca do mouse, caso em que o assunto irá inclinar para a frente para consumir o filme. Em alternativa, os ODS podem ser entregues topicamente à cavidade oral, colocando manualmente do filme directamente sobre a língua para o rato de engolir.

As investigações que envolvem a avaliação de parâmetros sensíveis ao estresse pode ser confundido com o uso do homem padrãotécnicas ual de retenção descritos neste protocolo e ajustes simples a metodologia pode ser facilmente feito para acomodar estudos nos quais é proibido restrição. Nesta abordagem modificada, o ODS pode ser colocado directamente na gaiola para o animal a consumir. Observações recolhidos a partir de estudos-piloto em nosso próprio laboratório indicam que esta iria ser melhor realizado colocando os animais em uma gaiola, sem qualquer material de cama / assentamento, apenas para a duração do procedimento de entrega da droga, a fim de aumentar a facilidade com que o consumo de ODS pode ser monitorizada visualmente pelo experimentador (s). Além disso, ele pode ser apropriado para iniciar um período de treinamento durante o qual os animais são introduzidos para as ODS, para que possam superar a evasão inata inicial de novos alimentos ^4. É claro que seriam necessários mais estudos para otimizar um protocolo livre de contenção para entrega ODS, no entanto, não há razão para acreditar que tal procedimento não poderia ser feito com facilidade.

Notavelmente, em termos de reprodutibilidade dos dados, ODS podem ser formulados para aderir à língua ou bochecha do animal, e concebida para a desintegração rápida oral, para libertar rapidamente a droga, assegurando, assim, a dosagem adequada é obtida. E, com a administração ODS, a necessidade de administração por sonda e de outras experiências invasivas desagradáveis ​​para o animal é eliminado. Não só isto é mais humano, mas também minimiza os efeitos do estresse como uma variável no experimento. Deve notar-se thno método ODS pode ser ainda mais optimizado, como em muitos processos de fabrico novo, que pode melhorar ainda mais a farmacocinética do composto de teste como ODS é expandido para terapias adicionais. Uma limitação de que deve ser salientado que respeita ao facto de que o desenvolvimento de ODS está nas fases iniciais de desenvolvimento. Questões relativas ao carregamento de drogas diferentes características físico-químicas sobre a plataforma saborizante / ODS continua a ser um desafio para a versatilidade e generalização desta técnica. Esta é uma área de investigação em curso.

A técnica proposta é uma técnica simples e novas que podem ser adoptadas para utilização em estudos animais pré-clínicos a curto e longo prazo e para a entrega de medicamentos a animais (por exemplo, cães). entrega da droga através de ODS representa uma abordagem nova, rápido, conveniente e humana em comparação com as abordagens tradicionais existentes, tais como comprimidos, cápsulas, líquidos, pós e geles, e gavagem oral.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Orally Dissolving Strip	Cure Pharmaceutical		Available upon special request. Alternatively, ODS may also be prepared in-house.
Gavage Feeding Needle	VWR	7912	Our rodent studies utilized a 18 gauge feeding needle. This size may need to be adjusted for use in other mammilian species.
Sucrose	Sigma Aldrich	S0389-500G