이 작품은 신경 능선을 통해 인간 만능 줄기 세포에서 색소, 성숙한 멜라닌 세포를 생산하고 공급이없는 25 일간의 프로토콜을 사용하여 중간 단계 멜라닌하는 체외 분화 프로토콜을 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
인간 만능 줄기 세포(hPSC)는 정상 및 질병 조건 모두에서 인간 발달을 in vitro에서 연구할 수 있는 플랫폼을 나타냅니다. 연구자들은 배양 조건을 조작하여 개발 중에 나타난 신호를 요약함으로써 hPSC를 관심 세포 유형으로 분화시킬 수 있습니다. 이러한 세포 유형 중 하나는 멜라닌 세포(melanocyte)로, 자외선 조사로부터 피부를 보호하는 신경능선(NC) 기원의 색소 생성 세포입니다. 이 프로토콜은 NC를 완전히 색소화된 멜라닌 세포로 더욱 분화하기 위해 hPSC에서 현재 사용 가능한 체외 신경 능선 분화 프로토콜의 확장을 제시합니다. 멜라닌 세포 전구체는 이중 SMAD 억제 조건에서 WNT, BMP 및 EDN3 신호의 활성제에 대한 시간 노출을 통해 Neural Crest 프로토콜에서 농축될 수 있습니다. 그 결과 생성된 멜라닌 세포 전구체는 정제되고 선택적 배지에서 배양에 의해 완전히 착색된 멜라닌 세포로 성숙됩니다. 그 결과 생성된 멜라닌 세포는 완전히 착색되고 성숙한 멜라닌 세포의 특징인 단백질에 적절하게 염색됩니다.
서론
인간 다 능성 줄기 세포 (hPSCs)은 질병 모델링, 약물 스크리닝, 세포 대체 요법 1-6 대한 확장 형태로 정상적인 분화를 모방하는 플랫폼을 제공한다. 특히 관심, hPSCs은 분리하기 어렵거나 환자 샘플이 부족하다 희귀 / 과도 세포 유형 공부 길을 엽니 다. 또한, 유도 만능 줄기 세포 (iPSCs)는 고유의 메커니즘 1,2,7-11을 해명하기 위해 환자 특정 방식으로 개발 및 질병 모델링을 연구하는 연구자 수 있습니다. hPSCs에서 멜라닌 세포의 분화 이전에 발행 된 프로토콜은 차별화 6 주 정도가 필요하며 L-Wnt3a 세포 (12)로부터의 조건화 된 배지로 배양 세포를 포함한다. 이 프로토콜은 처음 운모 등 제시.과 설명 여기에 3 주 색소 세포를 생산하고 모호함과 컨디셔닝 매체와 관련된 불일치를 제거합니다.
멜라닌 세포 아칸소신경 크레스트, 척추 동물에 고유 한 세포의 이주 인구에서 파생 된 전자. 신경 크레스트 낭배 동안 정의 신경 및 비 신경 외배엽 간의 접경 신경 판의 가장자리 세포 집단을 나타내고있다. neurulation 동안, 신경 조직은 신경 튜브 13, 14의 결과 지느러미 중간 선에서 수렴 신경 주름을 형성 신경....
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프로토콜
참고 : 여기에 설명 된 멜라닌 세포 프로토콜은 처음 운모 등의 알에 의해 입증되었다.
1. 문화 매체의 제조, 코팅 요리와 hPSCs의 유지 보수
- 중간 준비
주 : 저장소를 최대 2 주 동안 어둠 속에서 4 ° C에서 모든 매체. 살균에 대한 모든 매체를 필터링합니다.- DMEM / 10 % FBS를 준비합니다. 885 ml의 DMEM, 100 ㎖의 FBS, 10 ml의 펜 / 연쇄상 구균, 5 ml의 L-글루타민을 섞는다. 살균 필터.
- hESC의 매체를 준비합니다. 800 ㎖의 DMEM / F12, 200㎖의 KSR, 5 ㎖ L 글루타민, 10 ㎖ MEM 최소 필수 아미노산 용액, β 머 캅토 에탄올 1 ㎖, 5 ㎖의 펜 / 스트렙토 섞는다. 10 NG / ㎖의 FGF-2 추가 필터링 후.
- KSR-차별화 매체를 준비 : 820 ml의 마네 DMEM, 150 ml의 KSR, 10 ml의 L 글루타민, 10 ml의 펜 / 연쇄상 구균, 10 ml의 MEM 최소 필수 아미노산 용액 1 ml의 β-머 캅토 에탄올을 혼합. 살균 필터.
- N2-차별화 매체를 준비합니다. 12g DMEM / F12 분말 난을 녹여n은 980 ml의 DH 2<....
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결과
이 프로토콜은 체외 피더없이, 비용 효율적이고 재현 방식 hPSCs에서 완전히 착색 된, 성숙한 멜라닌 세포를 유도하는 방법을 제공한다. hPSC 유래 멜라닌 세포에 대해 이전에 확립 팡 등. 프로토콜 달리 명시된 프로토콜 조정 배지를 필요 시간 요건을 감소하지 않는다. 팡 등. 프로토콜은 WNT3A 생산 쥐의 세포 라인에서 조절 된 매체를 사용하고 색소 침착 6,12를 시각화 6 주까지했다. 바이어스 멜라닌 세포의 운명을 향해 신경 능선 줄기 세포 (melanoblasts)에, 우리는 회보 서 (Criminal) 초기 펄스 후 BMP와 TGFβ 억제제 (각각 LDN 및 SB)를 제거하고 이후의 Wnt 활성화를 유지하면서 하루 6시에 신호 외생 BMP4 및 EDN3를 소개합니다 6. 그 결과 melanoblasts은 물론 SOX10의 EXPR의 유지 보수로, KIT와 MITF의 발현.......
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토론
hPSCs에서 멜라닌의 성공적인 분화 다음 방법이 고려되어야한다. 무엇보다도, 항상 무균 배양 조건에서 동작하는 것이 필수적이다. 또한,이 다 능성 완전히 분화 hPSCs 시작하는 것이 중요하다; 시작 인구가 분화 세포를 포함하는 경우 수익률은 변함없이 오염 물질이 멜라닌 세포 지향 할 수 없으며 더욱 제대로 분화 세포를 방해 할 수 있으므로 삭제합니다.
세포가 만능 줄기 세포의 유지 보수를 위해 잘 확립 된 규칙을 따라야하는데주의를 기울여야 남아 보장하기 위해; 먹이 통로 정기적으로 계대 전에 분화 세포를 제거하는 문화를 신랑. 분화 젤라틴 단백질에 계대 때 접시 적절히 분화 동안 리프트 오프에서 셀을 방지하기 위해 도포하는 것이 중요하다.
멜라닌은 다르다entiation 80 %의 세포 밀도 주위 개시한다; 너무 낮은 밀도 부정적인 분화에 영향을주는 반면 너무 높은 밀도는 증가 된 세포의 죽음으로 이어질 것입니다. 계대 .......
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공개 사항
저자는 공개 충돌하는 이익을 더이 없습니다.
감사의 글
이 작품은 조안나 M. NICOLAY 재단 흑색 종 연구를위한 친교에 의해 루스 L. Kirschstein 국가 연구 서비스 상 F31에서 국립 보건원 (National Institutes of Health)에 의해 지원되었다. 이 작품은 더 NYSTEM 및 트라이 기관 줄기 세포 이니셔티브 (스타 재단)에서 보조금을 통해 지원되었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
| apo human transferrin | Sigma | T1147 | |
| Ascorbic Acid (L-AA) | Sigma | A4034 | 100 mM |
| B27 (B27 Supplement) | Invitrogen | 17504044 | |
| β-Mercaptoethanol | Gibco-Life Technologies | 21985-023 | 10 mg/ml |
| BMP4 | R& D 시스템 | 314-bp | |
| CHIR99021 | Tocris-R& D Systems | 4423 | 6 mM |
| 콜레라 독소 | Sigma | C8052 | 50 mg/ml |
| cAMP (cyclicAMP) | Sigma | D0627 | 100 mM |
| 덱사메타손 | Sigma | D2915-100MG | 50 μ M |
| DMEM - Dulbecco의 변형 독수리 매체 | Gibco-Life Technologies | 11985-092 | |
| DMEM/F12 - Dulbecco의 변형 독수리 매체: 영양 혼합물 F-12 | Gibco-Life Technologies | 1133--032 | |
| DMEM/F12 분말 | Invitrogen | 12500-096 | |
| EDN3 (Endothelin-3, human) | American Peptide Company | 88-5-10B | 100 μ M |
| 피브로넥틴 | BD 생명과학 | 356008 | 200 μ g/ml |
| 젤라틴 (Mg/Ca가 없는 PBS) | 은 | ||
| Human insulin | Sigma | I2643 | |
| ITS+ Universal Culture Supplement Premix에서 | BD Biosciences | 354352 | |
| KSR (녹아웃 세럼 대체물) | Gibco-Life Technologies | 10828-028 | |
| Knockout DMEM | Gibco-Life Technologies | 10829-018 | |
| L-글루타민 | Gibco-Life Technologies | 25030-081 | |
| LDN193189 | Stemgent | 04-0074 | 100 mM |
| 저혈당 DMEM | Invitrogen | 11885-084 | |
| Matrigel matrix | BD Biosciences | 354234 | DMEM/F12 MCDB201 |
| Medium | Sigma | M6770 | |
| MEM 최소 필수 아미노산 용액에 | Gibco-Life Technologies | 11140-080 | |
| 마우스 배아 섬유아세포(700만 세포/바이알) | GlobalStem | GSC-8105M | |
| 마우스 라미닌-I | R& D Systems | 3400-010-01 | 1 mg/ml |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103049 | |
| Penicilin/Streptomycin | Gibco-Life Technologies | 15140-122 | 10,000 U/ml |
| Poly-L Omithin hydrobromide | Sigma | P3655 | 15 mg/ml |
| 프로게스테론 | 시그마 | P8783 | 100ml 100% 에탄올 중 0.032g |
| Putrescine dihydrochloride | Sigma | P5780 | |
| FGF2(재조합 인간 FGF 기본) | R& D 시스템 | 233-FB-001MG/CF | 10mg/ml |
| SB431542 | Tocris-R& D 시스템 | 1814 | 10 mM |
| 셀레나이트 | 시그마 | S5261 | |
| 소듐 바이카보네이 | 시그마 | S5761 | |
| SCF (줄기세포 인자, 재조합 인간) | (주)페프로텍 | 300-07 | 50 &뮤; g/ml |
| TYRP1 (G-17) 항체 | Santa Cruz | 10443 | 1:200 |
| TYRP2 항체 | Abcam | 74073 | 1:200 |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco-Life Technologies | 25300-054 | |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris-R& D 시스템 | 1254 | 10 mM |
참고문헌
- Ebert, A. D., et al. Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient. Nature. 457, 277-280 (2009).
- Lee, G., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature.
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