Summary
Эта работа описывает протокол дифференцировки в пробирке для производства пигментных, зрелые меланоциты из человеческих плюрипотентных стволовых клеток с помощью нервного гребня и меланобластов промежуточную стадию с использованием фидерных бесплатно, 25 день протокола.
Introduction
Человеческие плюрипотентные стволовые клетки (hPSCs) обеспечивают платформу для имитации нормальной дифференцировки в масштабируемой моды для моделирования болезней, скрининга лекарственных средств и клеточной заместительной терапии 1-6. Особый интерес, hPSCs открывают возможности для изучения трудно выделить или редкие / переходные типы клеток, где образцы пациентов скудны. Кроме того, индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (иПСК) позволяют исследователям изучать развитие и моделирования заболевания у пациента специфическим образом , чтобы раскрыть уникальные механизмы 1,2,7-11. Ранее опубликована протокол для дифференциации меланоцитов от hPSCs требуется до 6 недель дифференцировок и включает в себя культивирование клеток с кондиционированной средой из L-WNT3a клеток 12. Протокол первый представленный слюды и др. И описано здесь производит пигментные клетки в течение трех недель и устраняет неоднозначность и несоответствий , связанных с кондиционированной средой.
меланоциты сотоке происходит от нервного гребня, миграционным популяции клеток, уникальных для позвоночных. Нервный гребень определяется во время гаструляции и представляет собой популяцию клеток у края нервной пластинки, на границе между нервной и не-нейральной эктодермы. Во время нейруляции, нервная ткань развивается из нервной пластинки с образованием нервных складок, которые сходятся на средней линии спины приводит к 13,14 нервной трубки.
В клетки нервного гребня возникают из потолочной панели нервной трубки, напротив хорды, и пройти эпителиальные к мезенхимальных перехода перед миграцией в сторону, чтобы дать начало различных слоев населения дифференцированных клеток. Судьбы клеток гребня определяются частично анатомическим расположением крыши пластины вдоль оси тела зародыша. Нервные производные гребень клеток включают родословные, характерные как мезодермы (гладкие мышечные клетки, остеобласты, адипоциты, хондроциты) и эктодермы клетки (меланоциты, Шванн сгезов, нейроны) 14. Нервный гребень стволовые клетки апрегулируются фактор транскрипции Sox10 и может быть выделен с помощью флуоресцентной активированные клетки сортировочного с антителами к р75 и HNK1.
В клетки нервного гребня суждено стать меланоциты пройти через стадию меланобластов и апрегулируются KIT и MITF (микрофтальмия-ассоциированный фактор транскрипции) 6,21 MITF является главный регулятор развития меланоцитов и является фактором транскрипции отвечает за контроль большую часть развития меланоцитов 22- 24. Человеческие меланобластов мигрируют в базальный слой эпидермиса, где они проживают либо в выпуклость волос или окружены кератиноцитов в эпидермисе (образуя пигментные единиц), чтобы служить в качестве предшественников зрелых, пигментных меланоцитов. Дифференцировку и созревание меланобластов в пигментированных меланоцитов происходит одновременно с колонизацией волосяной луковицы и экспрессии продуцирование меланина пути (TYRP1, Tyr, oca2 иПМЕЛ) 25,26.
Разделительный меланоцитов человека и меланобластов от больных является дорогостоящим, трудным и ограничение в количестве. Этот протокол позволяет исследователям дифференцировать hPSCs (беременными или эмбриональные) в меланоцитов или меланоцитов предшественников в четко определенной, быстрой, воспроизводимой, масштабируемой и недорогим способом без сортировки клеток. Протокол был использован ранее для выявления конкретных заболеваний дефектов при дифференцировании иПСК от пациентов с нарушениями пигментации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Примечание: Протокол меланоцитов описано здесь была впервые продемонстрирована слюды и др.
1. Приготовление культуральной среды, с покрытием Посуда и поддержание hPSCs
- Средний Приготовление
Примечание: Храните все среды при 4 ° С в темноте в течение до 2-х недель. Фильтр всю среду для стерилизации.- Подготовка DMEM / 10% FBS. Смешайте 885 мл DMEM, 100 мл FBS, 10 мл пен / стреп и 5 мл L-глютамин. Фильтр для стерилизации.
- Подготовка чЭСК-среду. Смешайте 800 мл DMEM / F12, 200 мл KSR, 5 мл L-глутамина, 10 мл MEM минимально необходимого раствора аминокислоты, 1 мл -меркаптоэтанола и 5 мл Pen / Strep. После фильтрации добавляют 10 нг / мл FGF-2.
- Подготовка KSR-дифференциации среды: Смешайте 820 мл Нокаут DMEM, 150 мл KSR, 10 мл L-глутамина, 10 мл Pen / Strep, 10 мл MEM минимального основного раствора аминокислоты и 1 мл β-меркаптоэтанола. Фильтр для стерилизации.
- Подготовка N2-дифференциации среды. Растворить 12 г DMEM / F12 порошок IN 980 мл дН 2 O. Добавить 1,55 г глюкозы, 2 г бикарбоната натрия и 100 мг APO человеческого трансферрина. Смешайте 2 мл дН 2 O с 25 мг человеческого инсулина и 40 мкл 1 N NaOH; После растворения, добавьте смесь в среду. Добавьте 100 мкл путресцина дигидрохлорид, 60 мкл селенит 100 мкл прогестерон. Принесите конечный объем до 1 л с дН 2 O до фильтрации.
- Подготовка Полный меланоцитов среды. Комбинат 50% Neurobasal среды, 30% Низкая DMEM глюкозы, а 20% MCDB201. К этому добавить: 0,8% ITS +, 250 нМ L-глутамина, 100 мкМ аскорбиновой кислоты (L-АА), 50 нг / мл холерного токсина, 50 нг / мл SCF, 0,05 мкМ дексаметазон, 100 нМ EDN3, 4 нг / мл FGF2 , Стерильный фильтр, а затем добавить остальные реагенты: 2% B27 Supplement, 25 нг / мл Bmp4, 3 мкМ CHIR99021, 500 мкМ цАМФ.
- Покрытие посуды культуры
- Осуществить покрытие с использованием гелеобразную белок, такой как Матригель. После открытия аликвоты и замораживания Матригель в 1 мл частей, чтобы избежать повторных замораживания таяния снегаycles. Оттепель и повторно приостановить 1 мл аликвоты заморожен с 19 мл DMEM / F12. Пластина 5 мл на 10 см блюдо. Инкубируйте блюда в течение 1 часа при комнатной температуре. Аспирируйте гелеобразную белка непосредственно перед металлизированный клетки и промывают DMEM / F12.
- Осуществить покрытие с использованием поли-L ornithin гидробромид / мышь Laminin-I / фибронектин (PO / LAM / FN). Смазать блюдо с PBS, содержащей 15 мкг / мл поли-L ornithin гидробромид. Выдержите O / N при 37 ° С в увлажненном инкубаторе. Аспирируйте раствор и промыть пластины с PBS три раза перед нанесением покрытия с PBS, содержащим 1 мкг / мл мыши ламинина-I и 2 мкг / мл фибронектина. Инкубируйте блюда O / N при 37 ° С в увлажненном инкубаторе.
- Перед металлизированный клетки, аспирация раствор и дайте пластины полностью высохнуть без крышки в капюшоне культуры ткани. Разрешить пластины высохнуть в течение примерно 10-15 мин.
Примечание: Блюда сухие и готовы к клеточной обшивки, когда появляются кристаллические структуры на поверхности со стороны глаза. PlatES могут быть сохранены с ФБР, содержащим LAM / FN в инкубаторе в течение двух недель, до тех пор пока жидкость не испаряется. Пластины могут быть высушен при комнатной температуре в течение нескольких часов.
- Перед металлизированный клетки, аспирация раствор и дайте пластины полностью высохнуть без крышки в капюшоне культуры ткани. Разрешить пластины высохнуть в течение примерно 10-15 мин.
- Поддержание hPSCs
Примечание: hPSCs поддерживаются на 0,1% желатина и митотически инактивированной мышиных эмбриональных фибробластов (МЭФ) в чЭСК-среде. Клетки должны быть разделены каждые 6-8 дней.- Покройте 10 см чашку с 0,1% желатина в PBS при комнатной температуре в течение 5 мин.
- Размораживайте MEFs быстро в водяной бане при 37 ° C.
- Аспирируйте желатин и пластинчатые клетки. Пластинчатые MEFs при плотности ~ 50000 клеток / см 2 в среде DMEM / 10% FBS. Выдержите MEFs при 37 ° CO / N перед добавлением hPSCs.
- Аспирируйте DMEM / 10% FBS из подготовленной MEF пластины, мыть пластины с PBS и добавляют 10 мл чЭСК-среду с hPSCs. Прохождение hPSCs в соотношении 1: 5/10 в зависимости от плотности до пассажей.
Примечание: Если hPSCs в настоящее время размораживают или пассировать в виде отдельных клеток, вир10 дополняют мкМ Y-27632 дигидрохлорида (Rocki) до первого прохода. - Поток клетки ежедневно свежей 10 мл чЭСК-среды.
- Перед началом дифференцировки плюрипотентных удалить любые колонии , которые , как представляется, содержат дифференцированные клетки, неровные границы, или прозрачные центры 28. Механически выбить и аспирацию нерегулярные колонии с пипеткой под капотом ламинарного потока с рассекает микроскопом.
2. Покрытие из hPSCs для дифференциацию
Примечание: условия Дифференциация описаны на 10 см чашки.
- Подготовка 10 см Матригель блюда перед началом дифференциации, как это описано в шаге 1.3.1.
- Когда гальванических hPSCs для дифференцировки начинаются с пластины hPSCs при плотности готового для прохода (~ 80% сливающийся) аспирация чЭСК-среды, промывают PBS и добавляют 3 мл 0,05% трипсин-ЭДТА к клеткам.
- Энергично встряхните блюдо горизонтально расту в течение 2 мин при визуализации под микроскопом, пока не MEFs отрываться в виде отдельных клеток. Колонии HPSC должны оставаться присоединенным в качестве колоний.
- Аспирируйте трипсин после того, как MEFs подняли, но до того, как hPSCs колонии разделиться.
- Добавить 10 мл чЭСК-среде, содержащей 10 мкМ Y-27632 дигидрохлорид к пластине и открепления клеток с помощью пипетки вверх и вниз над колониями.
- Аспирируйте решение Matrigel от 10 см блюдо, полученного на стадии 2.1 и промывают DMEM / F12, чтобы удалить сгустки. Пластина hPSCs в соотношении 1: 2 на пластину Матригель. Добавить чЭСК-среду, содержащую 10 мкМ Y-27632 дигидрохлорид до 10 мл. Инкубируют при 37 ° CO / N.
Примечание: Это покрытие должно привести к приблизительно 100000 клеток / см 2.
3. Индукция Neural дифференциацию
Примечание: дифференциация должна быть начата (день 0), когда hPSCs являются 80% сплошности. Клетки можно подавать ежедневно с чЭСК-средойне содержащий 10 мкМ Y-27632 дигидрохлорид до начала дифференцировки.
- В день 0 и день 1, питания клеток с 10 мл KSR-дифференцировке среде, содержащей 100 нМ LDN193189 и 10 мкМ SB431542.
- На 2-й день, питания клеток с 10 мл KSR-дифференцировке среде, содержащей 100 нМ LDN193189, 10 мкМ SB431542 и 3 мкМ CHIR99021.
- На 3-й день, питания клеток с 10 мл KSR-дифференцировки среде, содержащей 10 мкМ SB431542 и 3 мкМ CHIR99021.
- На 4 и 5 питания клеток с 15 мл 75% KSR-дифференциации среды и 25% N2-дифференциации среды, содержащей 3 мкМ CHIR99021.
Примечание: Не беспокойтесь, чтобы увидеть большое количество клеточной смерти в терминах плавающих клеток. Это нормально и следовало ожидать. - В дни 6 и 7 питания клеток с 15 мл 50% -ного KSR-дифференциации среды и 50% N2-дифференциации среды и содержащей 3 мкМ CHIR99021, 25 нг / мл ВМР4 и 100 нМ EDN3.
- В дни 8и 9 питания клеток с 20 мл 25% KSR-дифференцировке среды и 75% N 2-дифференцировке среде, содержащей как 3 мкМ CHIR99021, 25 нг / мл ВМР4 и 100 нМ EDN3.
- В дни 9 и 10 готовят PO / LAM / FN блюда, как указано в пункте 1.2.2 для повторного посева клеток на 11 день.
- На 10-й день кормовых клеток с 20 мл N2-дифференциации среды, содержащей 3 мкМ CHIR99021, 25 нг / мл ВМР4 и 100 нМ EDN3.
4. Replating в каплях для спецификации NC
- На 11-й день аспирата Lam / FN из подготовленных PO / LAM / FN пластин и полностью высохнуть.
- Удалить среду из 11-й день клетки, промывают PBS и добавляют 4 мл раствора открепления клеток, таких как Accutase на 10 см чашку. Инкубировать в течение 25 мин при 37 ° С.
- Добавляют 5 мл полной среды меланоцитов к блюду и ресуспендирования клеток вручную пипетированием вверх и вниз с 10 мл пипетки, пока все клетки не отрывается от пластины. Передача суспензии в 15 мл пробирку.
- КрутитьКлетки в течение 5 мин при 200g и клетки вновь суспендируют в 2 - х 10 6 клеток на мл в полной среде меланоцитов. Граф клеток с использованием трипанового синего на гемоцитометра или эквивалентной методикой.
- Пластина 10 мкл капли близко друг к другу (без их прикосновения) на высушенный PO / LAM / ФН 10 см чашки. Если пластинка достаточно высушенного, капли должны иметь четко определенные края и не выполняются.
Примечание: Это создает локальную среду высокой плотности для клеток, что важно, когда replating клетки, сохраняя при этом комнату в блюдо для расширения. - Разрешить капли постоять при комнатной температуре в течение 10-20 мин, чтобы клетки придерживаться, а затем медленно (чтобы не нарушить прикрепленные клетки) добавляют 10 мл полной среды меланоцитов. Переместить блюдо в инкубатор.
5. Расширение меланоцитов прародителей
- Продолжить кормление с полной меланоцитов среды каждые 2 до 3 дней.
Примечание: Пигментация следует начинать, чтобы быть видимыми шithin кластеры клеток к концу первой недели и становится совершенно ясно, на второй неделе. Просмотр планшет на белом фоне, такой как лист бумаги, чтобы различить эти ранние маленькие, темные кластеры. Клетки будут постепенно становятся все более пигментированный с течением времени, пока вся пластинка не равномерно пигментированные (см Фигура 2В). - Прохождение клетки не один раз в неделю в соотношении ~ 1: 6 (металлизации в виде капель больше нет необходимости на данном этапе). Используйте Accutase диссоциировать клетки и дважды промывают обычной средой Neurobasal перед повторным покрытием в полном меланоцитов среде. Поддерживать клетки на PO / LAM / FN пластин.
Примечание: Мы обнаружили, что среда Full меланоцитов лучше всего подходит для поддержания и расширения чЭСК и IPSC полученных из меланоцитов. Тем не менее, клетки могут быть кратко культивируют в коммерчески доступной среде M254, но упрощенная медиа увеличивает риск клеток умирающих и подъемными от пластины.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Этот протокол обеспечивает метод получения полностью пигментированные, зрелые меланоциты из hPSCs в в пробирке фидера свободной, экономически эффективным и воспроизводимым способом. В отличие от ранее установленной и др. Протоколом Fang для HPSC полученных из меланоцитов, наметившееся протокол не требует кондиционированной среды и уменьшает требование о времени. Протокол Fang и др. Использовали кондиционированную среду из WNT3a-продуцирующих клеток мышиной линии и уходило до 6 недель , чтобы визуализировать пигментацию 6,12. Для смещения нервного гребня стволовых клеток по отношению к меланоцит судьбы (меланобластов), убираем ингибиторы BMP и TGF-beta (Ldn и SB соответственно) после раннего импульса, а затем ввести экзогенный ВМР4 и EDN3 сигнализации в шесть дней, сохраняя при этом активация Wnt (Чир) 6. Полученные меланобластов можно охарактеризовать выражением KIT и MITF, а также поддержание Sox10 выражession 6. Выражение Sox10 можно визуализировать в тех областях , в культуре блюдо , которые образуют гребни от 11 -й день культуры (рис 1B - C).
После меланобластов индукции клетки пассируют на PO / LAM / FN пластин и подается с полной меланоцитов средой. Это чрезвычайно богатая среда , которая имеет дополнительное преимущество , заключающееся в селективным для населения меланоцитов, устраняя необходимость в какой - либо флуоресцентно сортировка клеток 6. Во время меланоцитов созревания, клетка активирует гены синтеза меланина Тир и TYRP1 сохраняя при этом многие из генов меланобластов, в том числе TYRP2. Day25 стволовых клеток меланоцитов происходит пятно соответствующим образом для производства белков меланина TYRP1 и TYRP2 (рисунок 2). Этот протокол является надежной и была использована с h9 чЭСК линии и через несколько линий IPSC. Совсем недавно, этот протокол был использован для точного воспроизведения ул trastructural особенности пигментации заболеваний с использованием конкретного пациента IPSC линий 6.
Рисунок 1. Основные этапы в чЭСК полученных протоколом меланоцитов дифференцировки. (A) Схема протокола дифференциации. KSR: KSR-дифференцировка среда, N2: N2-дифференцировка среда, LDN: LDN193189, SB: SB431542, Чир: CHIR99021, BMP4: Кость морфогенетического белка 4, EDN3: эндотелин-3, Rocki: Y-27632 дигидрохлорид B - C. Показывает светлого поля (В) и флуоресценции GFP (С) образ дифференциации на 11 день до начала replating с использованием трансгенного pSOX10: GFP чЭСК линии. Темные гряды видны в Светлое изображений обогащенные для Sox10 + клеток , которые дают начало меланобластов и в конечном счете меланоцитов. загрузить / 53806 / 53806fig1large.jpg "мишень =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. меланоцитов и промежуточные стадии. (А) пигментированная день 25 клеток (справа) могут быть легко визуализированы и отличающиеся от 11 -й день клетки (слева) , когда осаждали. (B) К 20 -й день протокола культура будет содержать как непигментированный, созревание меланоцитов и полностью зрелыми, пигментированные меланоциты. (C - D) Меланоциты могут быть визуализированы при ярком поле и как созревание и полностью пигментированные меланоциты пятно для меланоцит / меланоцитов маркера TYRP2. (E - F) Только пигментированные меланоциты пятно на поздней стадии меланоцитов маркера TYRP1.получить = "_blank"> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Для успешной дифференциации меланоцитов из hPSCs следующие предложения должны быть приняты во внимание. В первую очередь, необходимо работать в стерильных условиях культивирования во все времена. Кроме того, важно, чтобы начать с плюрипотентных полностью недифференцированных hPSCs; если исходная популяция содержит дифференцированные клетки выход неизменно будет падать, как загрязняющие вещества не могут быть направлены на меланоциты и может еще больше нарушить правильно дифференцирующие клетки.
Для того, чтобы обеспечить клетки остаются плюрипотентные заботиться, чтобы придерживаться хорошо установленных правил для поддержания стволовых клеток; кормить и проход регулярно и жениха культуры, чтобы удалить дифференцированные клетки до пассажей. Когда пересева на желатиновой белка для дифференциации, важно, что антенна должным образом с покрытием, чтобы предотвратить клетки от стартуя во время дифференцировки.
Меланобластов отличаютсяentiation должно быть начато около 80% плотности клеток; Слишком высокая плотность приведет к увеличению гибели клеток в то время как слишком низкая плотность отрицательно скажется на дифференциацию. Когда пассажей, клетки должны быть промыты дважды, чтобы удалить любую открепления клеток разрешение перед металлизированный. Для того, чтобы максимально увеличить выживаемость на 11 день, важно прохождения клетки в высокой плотности, хорошо разнесенными капли, нетронутым в течение 20 минут, таким образом, что клетки группироваться и прилипать.
Этот протокол является эффективным при генерации большого количества меланоцитов, и будет полезен при изучении образцов человека пациентка ограниченном количестве. Кроме того, как PSC происхождения меланоцитов населения является селективным и расширяемая население меланоцитов может быть умножено на очень большое количество клеток, даже если дифференциация выходов низкие числа или проценты меланоцитов. Инициирование протокол с ИПСК открывает возможность для изучения заболеваний и развития пациента конкретных образцов. Одна литийmitation этого протокола является тот факт , что меланоциты получены в качестве монокультуры без всех других типов клеток , присутствующих , которые формируют их нормальную нишу в естественных условиях. Кроме того, протокол требует специальных знаний в области культуры и дифференциации методов HPSC. Однако в связи с последними событиями в IPSC производстве полевых hPSCs становится все более управляемым и методы культивирования hPSCs стали обычным делом. На сегодняшний день протокол был использован в нашей лаборатории для производства меланоцитов из линии Н9 HES, а также от 14 плюрипотентных линий, генерируемых из 5 различных доноров.
Слюды и др. Использовали этот протокол успешно для вывода меланоцитов из человеческого ЭСК и ИПСК 6. В статье показано, что иПСК, полученные от пациентов с пигментацией дефектами могут быть дифференцированы в меланоцитах и протокол точно произвел меланосомы из размера фенотипической и количества связанного с этим заболеванием.
шорк иллюстрируется один из многих возможных применений протокола с использованием IPSC , полученных из меланоцитов для изучения механизмов болезни и ввел возможность расширения масштабов производства для скрининга лекарственных средств 6,29. Важно отметить, что бумага продемонстрировала надежность и воспроизводимость протокола для получения меланоцитов из большого множества генетически различных hiPSC линий.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют никаких противоречивых интересов раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана стипендии для меланомы исследователей из Joanna M. Nicolay Foundation и Национальным институтом здоровья под Рут Л. Kirschstein Национальный исследовательский премии Сервис F31. Эта работа была дополнительно поддерживается за счет субсидий из NYSTEM и инициативы Tri-институциональном стволовых клеток (Starr Foundation).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
| apo human transferrin | Sigma | T1147 | |
| Ascorbic Acid (L-AA) | Sigma | A4034 | 100 mM |
| B27 (B27 Supplement) | Invitrogen | 17504044 | |
| β-Mercaptoethanol | Gibco-Life Technologies | 21985-023 | 10 mg/ml |
| BMP4 | R&D Systems | 314-bp | |
| CHIR99021 | Tocris-R&D Systems | 4423 | 6 mM |
| Cholera toxin | Sigma | C8052 | 50 mg/ml |
| cAMP (cyclicAMP) | Sigma | D0627 | 100 mM |
| Dexamethasone | Sigma | D2915-100MG | 50 μM |
| DMEM - Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco-Life Technologies | 11985-092 | |
| DMEM/F12 - Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 | Gibco-Life Technologies | 1133--032 | |
| DMEM/F12 powder | Invitrogen | 12500-096 | |
| EDN3 (Endothelin-3, human) | American Peptide Company | 88-5-10B | 100 μM |
| Fibronectin | BD Biosciences | 356008 | 200 μg/ml |
| gelatin (PBS without Mg/Ca) | in house | 0.1% in PBS | |
| Glucose | Sigma | G7021 | |
| Human insulin | Sigma | I2643 | |
| ITS+ Universal Culture Supplement Premix | BD Biosciences | 354352 | |
| KSR (Knockout Serum Replacement) | Gibco-Life Technologies | 10828-028 | |
| Knockout DMEM | Gibco-Life Technologies | 10829-018 | |
| L-Glutamine | Gibco-Life Technologies | 25030-081 | |
| LDN193189 | Stemgent | 04-0074 | 100 mM |
| Low glucose DMEM | Invitrogen | 11885-084 | |
| Matrigel matrix | BD Biosciences | 354234 | Dissolve 1:20 in DMEM/F12 |
| MCDB201 Medium | Sigma | M6770 | |
| MEM minimum essential amino acids solution | Gibco-Life Technologies | 11140-080 | |
| Mouse embryonic fibroblasts (7 million cells/vial) | GlobalStem | GSC-8105M | |
| Mouse Laminin-I | R&D Systems | 3400-010-01 | 1 mg/ml |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103049 | |
| Penicilin/Streptomycin | Gibco-Life Technologies | 15140-122 | 10,000 U/ml |
| Poly-L Omithin hydrobromide | Sigma | P3655 | 15 mg/ml |
| Progesterone | Sigma | P8783 | 0.032 g in 100 ml 100% ethanol |
| Putrescine dihydrochloride | Sigma | P5780 | |
| FGF2 (Recombinant human FGF basic) | R&D Systems | 233-FB-001MG/CF | 10 mg/ml |
| SB431542 | Tocris-R&D Systems | 1814 | 10 mM |
| Selenite | Sigma | S5261 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| SCF (Stem Cell Factor, recombinant Human) | Peprotech Inc. | 300-07 | 50 μg/ml |
| TYRP1 (G-17) Antibody | Santa Cruz | 10443 | 1:200 |
| TYRP2 Antibody | Abcam | 74073 | 1:200 |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco-Life Technologies | 25300-054 | |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris-R&D Systems | 1254 | 10 mM |
References
- Ebert, A. D., et al. Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient. Nature. 457, 277-280 (2009).
- Lee, G., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature. 461, 402-406 (2009).
- Lee, G., et al. Large-scale screening using familial dysautonomia induced pluripotent stem cells identifies compounds that rescue IKBKAP expression. Nat biotechnol. 30, 1244-1248 (2012).
- Lee, G., Studer, L. Induced pluripotent stem cell technology for the study of human disease. Nat methods. 7, 25-27 (2010).
- Zimmer, B., et al. Evaluation of developmental toxicants and signaling pathways in a functional test based on the migration of human neural crest cells. Environ health persp. 120, 1116-1122 (2012).
- Mica, Y., Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. Modeling neural crest induction, melanocyte specification, and disease-related pigmentation defects in hESCs and patient-specific iPSCs. Cell rep. 3, 1140-1152 (2013).
- Mariani, J., et al. FOXG1-Dependent Dysregulation of GABA/Glutamate Neuron Differentiation in Autism Spectrum Disorders. Cell. 162, 375-390 (2015).
- Doulatov, S., et al. Modeling Diamond Blackfan Anemia in Vivo Using Human Induced Pluripotent Stem Cells. Blood. 124, (2014).
- Cherry, A. B. C., Daley, G. Q. Reprogrammed Cells for Disease Modeling and Regenerative Medicine. Annu Rev Med. 64, 277-290 (2013).
- Inoue, H., Nagata, N., Kurokawa, H., Yamanaka, S. iPS cells: a game changer for future medicine. Embo J. 33, 409-417 (2014).
- Kim, C., et al. Studying arrhythmogenic right ventricular dysplasia with patient-specific iPSCs. Nature. 494, 105-110 (2013).
- Fang, D., et al. Defining the conditions for the generation of melanocytes from human embryonic stem cells. Stem cells. 24, 1668-1677 (2006).
- Huang, X., Saint-Jeannet, J. P. Induction of the neural crest and the opportunities of life on the edge. Dev biol. 275, 1-11 (2004).
- White, R. M., Zon, L. I. Melanocytes in development, regeneration, and cancer. Cell stem cell. 3, 242-252 (2008).
- Morrison, S. J., White, P. M., Zock, C., Anderson, D. J. Prospective identification, isolation by flow cytometry, and in vivo self-renewal of multipotent mammalian neural crest stem cells. Cell. 96, 737-749 (1999).
- Elworthy, S., Pinto, J. P., Pettifer, A., Cancela, M. L., Kelsh, R. N. Phox2b function in the enteric nervous system is conserved in zebrafish and is sox10-dependent. Mech develop. 122, 659-669 (2005).
- Harris, M. L., Baxter, L. L., Loftus, S. K., Pavan, W. J. Sox proteins in melanocyte development and melanoma. Pigm cell melanoma r. 23, 496-513 (2010).
- Herbarth, B., et al. Mutation of the Sry-related Sox10 gene in Dominant megacolon, a mouse model for human Hirschsprung disease. PNAS. 95, 5161-5165 (1998).
- Southard-Smith, E. M., Kos, L., Pavan, W. J. Sox10 mutation disrupts neural crest development in Dom Hirschsprung mouse model. Nat genetics. 18, 60-64 (1998).
- Dupin, E., Glavieux, C., Vaigot, P., Le Douarin, N. M. Endothelin 3 induces the reversion of melanocytes to glia through a neural crest-derived glial-melanocytic progenitor. PNAS. 97, 7882-7887 (2000).
- Lister, J. A., Robertson, C. P., Lepage, T., Johnson, S. L., Raible, D. W. nacre encodes a zebrafish microphthalmia-related protein that regulates neural-crest-derived pigment cell fate. Development. 126, 3757-3767 (1999).
- Hou, L., Panthier, J. J., Arnheiter, H. Signaling and transcriptional regulation in the neural crest-derived melanocyte lineage: interactions between KIT and MITF. Development. 127, 5379-5389 (2000).
- Levy, C., Khaled, M., Fisher, D. E. MITF: master regulator of melanocyte development and melanoma oncogene. Trends mol med. 12, 406-414 (2006).
- Phung, B., Sun, J., Schepsky, A., Steingrimsson, E., Ronnstrand, L. C-KIT signaling depends on microphthalmia-associated transcription factor for effects on cell proliferation. PloS one. 6, e24064 (2011).
- Grichnik, J. M., et al. KIT expression reveals a population of precursor melanocytes in human skin. J invest dermatol. 106, 967-971 (1996).
- Li, L., et al. Human dermal stem cells differentiate into functional epidermal melanocytes. J cell sci. 123, 853-860 (2010).
- Nishimura, E. K., et al. Dominant role of the niche in melanocyte stem-cell fate determination. Nature. 416, 854-860 (2002).
- Zur Nieden, N. I. Embryonic stem cell therapy for osteo-degenerative diseases : methods and protocols. , Humana Press. (2011).
- Lee, J. H., et al. high-content screening for novel pigmentation regulators using a keratinocyte/melanocyte co-culture system. Exp dermatol. 23, 125-129 (2014).
