Summary
Dette arbeidet beskriver en in vitro differensiering protokollen til å produsere pigmenterte, modne melanocytter fra menneskelige pluripotente stamceller via en neural crest og melanoblast mellomstadium ved hjelp av en mater-fri, 25 dagers protokollen.
Introduction
Menneskelige pluripotente stamceller (hPSCs) gi en plattform for å etterligne normal differensiering i en skalerbar mote for sykdom modellering, narkotika screening, og celle erstatning terapi 1-6. Av spesiell interesse, hPSCs åpne opp muligheter for å studere vanskelig å isolere eller sjeldne / forbigående celletyper hvor pasientprøver er knappe. Videre induserte pluripotente stamceller (iPSCs) gjør forskerne å studere utvikling og sykdom modellering i en pasient bestemt måte å løse unike mekanismer 1,2,7-11. Den tidligere utgitt protokoll for differensiering av melanocytter fra hPSCs krever opp til 6 uker med differensiering og innebærer dyrking celler med kondisjonert medium fra L-Wnt3a celler 12. Protokollen først presentert av Mica et al. Og beskrevet her produserer pigmenterte celler i tre uker, og fjerner tvetydighet og uoverensstemmelser i forbindelse med kondisjonert medium.
melanocytter are avledet fra neural crest, en vandrende populasjon av celler som er unike for virveldyr. Neural crest er definert under gastrulation og representerer en populasjon av celler ved kanten av det nevrale plate, som grenser mellom det neurale og ikke-nevrale ektoderm. Under neurulation, utvikler den nervevev fra et neural-plate for å danne nevrale folder, som konvergerer ved dorsal midtlinjen som resulterer i det nevrale rør 13,14.
Neural crest cellene skilles ut fra taket plate av nevralrøret, på motsatt side av ryggstreng, og gjennomgår en epitelial til mesenchymale overgang før den vandrer bort for å gi opphav til en mangfoldig befolkning av differensierte celler. Skjebnen av toppen celler er definert delvis av den anatomiske plassering av taket platen langs kroppens akse for embryoet. Neural crest celle derivater omfatter linjer karakteristisk for både mesoderm (glatte muskelceller, osteoblaster, adipocytter, chondrocytes) og ektoderm celler (melanocytter, Schwann calen, nevroner) 14. Nevrale kløft stamceller oppregulere transkripsjonsfaktor SOX10 og kan isoleres ved fluorescens-aktivert cellesortering med antistoffer mot p75 og HNK1.
Neural crest cellene skjebnebestemt til å bli melanocytter passere gjennom en melanoblast scenen og oppregulere KIT og MITF (mikroftalmi-assosiert transkripsjonsfaktor) 6,21 MITF er en mester regulator av melanocyte utvikling og er en transkripsjonsfaktor ansvarlig for å kontrollere mye av melanocytter utvikling 22- 24. Menneske melanoblasts migrere til basal laget av epidermis hvor de bor enten i håret kul eller omgitt av keratinocytter i epidermis (forming pigmentering enheter) å tjene som forløpere for de modne, pigmenterte melanocytter. Differensiering og modning av melanoblasts inn i pigmenterte melanocytter opptrer samtidig med kolonisering av hår pære og ekspresjon av melaninproduksjonen pathway (TYRP1, TYR, og OCA2PMEL) 25,26.
Isolere menneskelige melanocytter og melanoblasts fra pasienter er dyrt, vanskelig og begrensende i kvantitet. Denne protokollen gjør det mulig for forskere å skille hPSCs (indusert eller embryonale) i melanocytter eller melanocyte forløpere i en veldefinert, rask, reproduserbar, skalerbar og billig metode uten cellesortering. Protokollen ble brukt tidligere for å identifisere sykdomsspesifikke feil når differensiere iPSCs fra pasienter med pigmentforstyrrelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: melanocyte protokollen skissert her ble først demonstrert av Mica et al.
1. Utarbeidelse av dyrkingsmedium, Belagt Retter og vedlikehold av hPSCs
- medium Forberedelse
Merk: Oppbevar alle medium ved 4 ° C i mørke i opptil to uker. Filter alle medium for sterilisering.- Forbered DMEM / 10% FBS. Bland 885 ml DMEM, 100 ml FBS, 10 ml Pen / Strep og 5 ml L-Glutamine. Filter for sterilisering.
- Forbered hESC-medium. Bland 800 ml DMEM / F12, 200 ml KSR, 5 ml L-glutamin, 10 ml MEM minimum essensielle aminosyrer oppløsning, 1 ml p-merkaptoetanol, og 5 ml Pen / Strep. Etter filtrering tilsettes 10 ng / ml FGF-2.
- Fremstille KSR-differensiering medium: Bland 820 ml DMEM Knockout, 150 ml KSR, 10 ml L-glutamin, 10 ml Pen / Strep, 10 ml MEM minimum essensielle aminosyrer løsning og 1 ml β-mercaptoethanol. Filter for sterilisering.
- Forbered N2-differensiering medium. Løs opp 12 g DMEM / F12 pulver in 980 ml dH 2 O. Legg 1,55 g glukose, 2 g natriumbikarbonat og 100 mg apo human transferrin. Bland 2 ml dH 2 O med 25 mg humant insulin og 40 pl 1 N NaOH; en gang oppløst, tilsett blandingen til mediet. Tilsett 100 ul putrescin-dihydroklorid, 60 ul selenitt, 100 ul progesteron. Ta det endelige volum til 1 liter med dH 2 O før filtrering.
- Forbered Full melanocyte medium. Kombiner 50% Neurobasal medium, 30% lav glukose DMEM, og 20% MCDB201. Til dette tillegget: 0,8% ITS +, 250 nM L-glutamin, 100 mM askorbinsyre (L-AA), 50 ng / ml koleratoksin, 50 ng / ml SCF, 0,05 uM deksametason, 100 nM EDN3, 4 ng / ml FGF2 . Steril filter deretter legge de resterende reagenser: 2% B27 supplement, 25 ng / ml BMP4, tre mikrometer CHIR99021, 500 mikrometer cAMP.
- Belegg Kultur- Retter
- Gjennomføre belegg ved hjelp gelé protein som Matrigel. Ved åpning, delmengde og fryse Matrigel i 1 ml deler for å unngå repeterende fryse tine cycles. Tine og re-suspendere en 1 ml frosset delmengde med 19 ml DMEM / F12. Plate 5 ml på en 10 cm tallerken. Inkuber rettene i 1 time ved RT. Aspirer geléaktige protein rett før plating cellene og vask med DMEM / F12.
- Gjennomføre belegg ved hjelp av Poly-L ornithin hydrobromide / mus Laminin-I / fibronektin (PO / Lam / FN). Coat tallerken med PBS som inneholder 15 mikrogram / ml Poly-L ornithin hydrobromide. Inkuber O / N ved 37 ° C i en fuktet inkubator. Aspirer løsningen og vask platene med PBS tre ganger før belegning med PBS inneholdende 1 pg / ml mus Laminin-I og 2 pg / ml fibronektin. Inkuber retter O / N ved 37 ° C i en fuktet inkubator.
- Før plating celler, Aspirer løsningen og la platene tørke grundig uten lokk i vevskultur hette. La platene tørke i ca 10-15 min.
Merk: Rettene er tørr og klar for celle plating når krystallstrukturer vises på overflaten av øyet. plattformeres kan holdes med PBS inneholdende LAM / FN i inkubatoren i to uker, så lenge væsken ikke fordamper. Platene kan holdes tørkes ved romtemperatur i noen få timer.
- Før plating celler, Aspirer løsningen og la platene tørke grundig uten lokk i vevskultur hette. La platene tørke i ca 10-15 min.
- Vedlikehold av hPSCs
Note: hPSCs opprettholdes på 0,1% gelatin og mitotisk inaktivert mus embryonale fibroblaster (MEFs) i hESC-medium. Cellene skal deles hver 6-8 dager.- Belegge en 10 cm skål med 0,1% gelatin i PBS ved romtemperatur i 5 min.
- Tine frosne MEFs raskt i et 37 ° C vannbad.
- Aspirer gelatin og plate cellene. Plate MEFs ved en tetthet på ~ 50.000 celler / cm2 i DMEM / 10% FBS. Inkuber MEFs ved 37 ° CO / N før du legger hPSCs.
- Aspirer DMEM / 10% FBS fra forberedt MEF plate, vaske plate med PBS og tilsett 10 ml hESC-medium med hPSCs. Passasje av hPSCs ved et forhold på 1: 5/10 avhengig av tettheten før aging.
Merk: Hvis hPSCs blir tint eller passeres som enkeltceller, supplement med 10 mm Y-27632 dihydroklorid (Rocki) til første passering. - Mate celler daglig med frisk 10 ml hESC-medium.
- Før du starter en differensiering fjerne eventuelle pluripotente kolonier som synes å inneholde differensierte celler, uregelmessige kanter eller transparente sentre 28. Mekanisk løsne og aspirer de uregelmessige kolonier med en pipette under en laminær hette med en dissekere mikroskop.
2. Plating av hPSCs for Differensiering
Merk: Differensieringsbetingelser er beskrevet i 10 cm retter.
- Fremstille 10 cm Matrigel retter før differensieringen som beskrevet i trinn 1.3.1.
- Når Plating hPSCs for en differensiering starte med en plate av hPSCs ved en tetthet klar for passasje (~ 80% sammenflytende) suge hESC-medium, vaskes med PBS og tilsett 3 ml av 0,05% trypsin-EDTA til cellene.
- Rist fatet Horisontaley i 2 min mens du visualiserer under mikroskopet før MEFs løft av som enkeltceller. De hPSC kolonier bør være festet som kolonier.
- Aspirer trypsin etter MEFs har løftet, men før hPSCs kolonier løsne.
- Tilsett 10 ml hESC-medium inneholdende 10 uM Y-27632 dihydroklorid til platen og løsne cellene ved å pipettere opp og ned over koloniene.
- Aspirer Matrigel oppløsningen fra 10 cm parabolen utarbeidet i trinn 2.1 og vask med DMEM / F12 for å fjerne klumper. Plate hPSCs på et 1: 2 forhold på Matrigel plate. Legg hESC-medium som inneholdt 10 mm Y-27632 dihydroklorid opp til 10 ml. Inkuber ved 37 ° CO / N.
Merk: Denne plating bør resultere i omtrent 100.000 celler / cm 2.
3. Induksjon av Neural Differensiering
Merk: Differensieringen skal initieres (dag 0) når hPSCs er 80% konfluent. Cellene kan tilføres daglig med hESC-mediuminneholder 10 mm Y-27632 dihydroklorid før du begynner differensiering.
- På dag 0 og dag 1, mate cellene med 10 ml KSR-differensiering medium inneholdende 100 nM LDN193189 og 10 uM SB431542.
- På dag 2, mate cellene med 10 ml KSR-differensiering medium inneholdende 100 nM LDN193189, 10 uM SB431542 og 3 uM CHIR99021.
- På dag 3, mate cellene med 10 ml KSR-differensiering medium inneholdende 10 uM SB431542 og 3 uM CHIR99021.
- På dag 4 og 5 mate cellene med 15 ml 75% KSR-differensiering medium og 25% N2-differensiering medium inneholdende 3 mM CHIR99021.
Merk: Ikke bli skremt til å se en stor mengde av celledød i form av flytende celler. Dette er normalt og må forventes. - På dag 6 og 7 mate cellene med 15 ml 50% KSR-differensiering medium og 50% N2-differensiering medium begge inneholdende 3 pM CHIR99021, 25 ng / ml BMP4, og 100 nM EDN3.
- På dager 8og 9 mate cellene med 20 ml 25% KSR-differensiering medium og 75% N2-differensiering medium begge inneholdende 3 pM CHIR99021, 25 ng / ml BMP4, og 100 nM EDN3.
- På dager 9 og 10 forberede PO / Lam / FN retter som angitt i 1.2.2 for re-plating av cellene på dag 11.
- På dag 10 mate celler med 20 ml N2-differensiering medium inneholdende 3 pM CHIR99021, 25 ng / ml BMP4, og 100 nM EDN3.
4. replating i Dråper for NC Spesifikasjon
- På dag 11 aspirer Lam / FN fra de preparerte PO / LAM / FN plater og tørke helt.
- Fjern medium fra dag 11 celler, vask med PBS og tilsett 4 ml celle avløsning løsning som Accutase per 10 cm parabolen. Inkuber i 25 minutter ved 37 ° C.
- Tilsett 5 ml Fullstendig Melanocyte medium til skålen, og resuspender cellene ved manuelt å pipettere opp og ned med en 10 ml pipette inntil alle cellene løftet seg opp fra platen. Overføre suspensjonen til et 15 ml rør.
- Spinnceller ned i 5 minutter ved 200 x g og resuspender cellene ved 2 x 10 6 celler pr ml i full Melanocyte medium. Tell cellene ved hjelp av trypanblått-utelukkelse på et hemocytometer eller tilsvarende teknikk.
- Plate 10 mL dråper nær hverandre (uten dem berøre) på de tørkede PO / Lam / FN 10 cm retter. Hvis platen er blitt tilstrekkelig tørket, bør dråpene ha veldefinerte kanter og ikke løpe.
Merk: Dette oppretter en høy tetthet lokalt miljø for cellene, noe som er viktig når replating cellene, samtidig som rom innen fatet for ekspansjon. - Tillate dråpene å stå ved romtemperatur i 10-20 min for å la cellene få feste seg, deretter langsomt (for ikke å forstyrre de festede celler) tilsett 10 ml Fullstendig Melanocyte medium. Flytt rett til inkubatoren.
5. Utvide Melanocyte stamfedre
- Fortsett å fôre med Full Melanocyte medium hver 2 til 3 dager.
Merk: Pigmentering bør begynne å være synlig wTVen på klynger av celler ved slutten av den første uken og blir meget tydelig av den andre uken. Se platen over en hvit bakgrunn, slik som et papirark for å skjelne disse tidlige små, mørke klynger. Celler blir progressivt mer pigmentert over tid, inntil hele platen er jevnt pigmentert (se figur 2B). - Passasje cellene en gang i uken ved et forhold på ca. 1: 6 (plating som små dråper er ikke lenger nødvendig på dette trinn). Bruk Accutase å distansere celler og vask to ganger med rent Neurobasal medium før re-plating i Full Melanocyte medium. Opprettholde celler på PO / LAM / FN plater.
Merk: Vi har funnet ut at Full Melanocyte medium er best egnet for å opprettholde og utvide hESC og IPSC-avledet melanocytter. Imidlertid kan cellene være kort dyrket i kommersielt tilgjengelige M254 medium men forenklet medier øker risikoen for at celler dør og løfte av platen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokollen tilveiebringer en fremgangsmåte for å utlede fullt pigmenterte, modne melanocytter fra hPSCs i en in vitro-mater-fri, kostnadseffektive, og reproduserbar måte. I motsetning til det som tidligere er etablert Fang et al., Protokoll for hPSC-avledede melanocytter, ikke beskrevet protokollen ikke krever kondisjonert medium og reduserer tidskrav. Fang et al. Protokollen benyttes kondisjonert medium fra en WNT3A produserende murine cellelinje og tok opp til 6 uker for å visualisere pigmentering 6,12. Slik skjevhet neural crest stamceller mot en melanocyte skjebne (melanoblasts), fjerner vi BMP og TGFB hemmere (henholdsvis LDN og SB) etter en tidlig puls og deretter innføre eksogene BMP4 og EDN3 signale på dag seks og samtidig opprettholde Wnt aktivering (tsjir) 6. De resulterende melanoblasts kan være preget av uttrykk for KIT og MITF, samt vedlikehold av SOX10 expression 6. Uttrykk for SOX10 kan visualiseres i områder i kulturen fatet som danner rygger etter dag 11 kultur (Figur 1B - C).
Etter melanoblast induksjon, blir cellene passeres på PO / LAM / FN plater og mates med full Melanocyte medium. Dette er et svært rikt medium som har den ytterligere fordelen av å være selektiv for den melanocytt-populasjonen, eliminerer behovet for en hvilken som helst Fluorescent-Activated Cell Sorting 6. Under melanocytter modning, oppregulerer cellen melanin syntese genene TYR og TYRP1 samtidig opprettholde mange av de melanoblast gener, inkludert TYRP2. Day25 stamcelle avledet melanocytter flekken hensiktsmessig for produksjonen av melanin proteiner TYRP1 og TYRP2 (figur 2). Denne protokollen er robust og har vært brukt med H9 hESC linje og på tvers av flere IPSC linjer. Nå nylig, ble denne protokollen brukes til å gjengi ul trastructural funksjoner i pigmentering sykdommer ved hjelp av pasientspesifikke IPSC linjer 6.
Figur 1. Kritiske trinn i hESC-avledet melanocyte differensiering protokollen. (A) Differensieringen protokollen ordningen. KSR: KSR-differensiering medium, N2: N2-differensiering medium, LDN: LDN193189, SB: SB431542, tsjir: CHIR99021, BMP4: benmorfogenetisk protein 4, EDN3: endotelin-3, Rocki: Y-27632 dihydrochloride B - C. Viser lysfelt (B) og GFP fluorescens (C) bilde av differensiering på dag 11 før replating bruker en transgen pSOX10: GFP hESC linje. De mørke rygger synlig i lysfelt bildene er anriket for SOX10 + celler som vil gi opphav til melanoblasts og til slutt melanocytter. laste opp / 53806 / 53806fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Melanocyte og mellomtrinn. (A) pigmentert Day 25 celler (til høyre) kan enkelt visualiseres og skilles fra Day 11 celler (til venstre) når pelletert. (B) Dag 20 av protokollen kulturen vil inneholde både upigmenterte, modning melanocytter og fullt modne, pigmenterte melanocytter. (C - D) melanocyttene kan visualiseres i sterkt felt og både modning og fullt pigmenterte melanocytter flekken for melanoblast / melanocyte markør TYRP2. (E - F) Bare pigmentert melanocytter flekken for sent stadium melanocyte markør TYRP1.få = "_ blank"> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
For vellykket differensiering av melanocytter fra hPSCs bør tas i betraktning følgende forslag. Først og fremst er det viktig å arbeide under sterile dyrkningsbetingelser til enhver tid. I tillegg er det viktig å starte med pluripotent, fullt udifferensiert hPSCs; hvis utgangspopulasjon inneholder differensierte celler utbyttet vil alltid falle som forurensningene ikke kan rettes mot melanocytter, og kan til og med ytterligere forstyrre skikkelig differensierende celler.
For å sikre cellene forblir pluripotent passe på å overholde de veletablerte regler for stamcelle vedlikehold; mate og passasje regelmessig og stelle kulturer å fjerne differensierte celler før aging. Ved passering på gelatinøs protein for differensiering er det viktig at fatet er riktig belagt for å forhindre celler fra å løfte av under differensiering.
Den Melanoblast avvikeentiation skal startes rundt 80% celletetthet; altfor høye tettheter vil føre til økt celledød mens for lave tettheter vil negativt påvirke differensiering. Ved passering, må cellene vaskes to ganger for å fjerne en hvilken som helst celle løsgjøring løsning før utplating. For å maksimere overlevelse på dag 11, er det viktig å passasje cellene til høy tetthet, godt adskilte dråper som er urørt i 20 minutter, slik at cellene klynge og holder seg.
Denne protokollen er effektive i å generere et stort antall melanocytter, og vil være verdifull når man studerer menneskepasientprøver av begrenset mengde. Videre, som det PSC-avledede melanocyttstimulerende befolkning er selektiv og utvid den melanocytt-populasjonen kan multipliseres til et meget stort antall celler, selv om de differensierings utbyttene lave tall eller prosenter av melanocytter. Starte protokollen med iPSCs åpner opp muligheten for å studere utviklings sykdommer og pasientspesifikke prøver. en libegrensning, av denne protokollen er det faktum melanocyttene er utledet som en monokultur uten alle andre celletyper som finnes som danner deres normale nisje in vivo. Videre protokollen krever kompetanse i hPSC kultur og differensierings teknikker. Men med den siste utviklingen i IPSC felt produsere hPSCs har blitt stadig mer håndterlig og metoder for dyrking hPSCs blitt rutine. Til dags dato har den protokoll blitt benyttet i vårt laboratorium for å produsere melanocytter fra H9 HES linje, samt fra 14 IPS linjer generert fra 5 forskjellige givere.
Mica et al. Brukt denne protokollen hell for avledning av melanocytter fra menneskelig hESC og iPSCs 6. Papiret viste at iPSCs avledet fra pasienter med pigmenteringsfeil kan bli differensiert i melanocytter og protokollen trofast produserte Melanosomer av den fenotypiske størrelse og mengde assosiert med sykdommen.
work illustrert en av mange mulige bruksområder for protokollen med bruk av IPSC-avledet melanocytter for å studere sykdomsmekanismer og introduserte muligheten for å skalere opp produksjonen for narkotika screening 6,29. Viktigere, papiret viste robustheten og reproduserbarheten av protokollen for å frembringe melanocytter fra et stort sett av genetisk distinkte hiPSC linjer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av et fellesskap for melanom forskere fra Joanna M. Nicolay Foundation og av National Institutes of Health i henhold til Ruth L. Kirschstein National Research Service Award F31. Dette arbeidet ble også støttet gjennom tilskudd fra NYSTEM og Tri-institusjonelle stamcelle initiativ (Starr Foundation).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
| apo human transferrin | Sigma | T1147 | |
| Ascorbic Acid (L-AA) | Sigma | A4034 | 100 mM |
| B27 (B27 Supplement) | Invitrogen | 17504044 | |
| β-Mercaptoethanol | Gibco-Life Technologies | 21985-023 | 10 mg/ml |
| BMP4 | R&D Systems | 314-bp | |
| CHIR99021 | Tocris-R&D Systems | 4423 | 6 mM |
| Cholera toxin | Sigma | C8052 | 50 mg/ml |
| cAMP (cyclicAMP) | Sigma | D0627 | 100 mM |
| Dexamethasone | Sigma | D2915-100MG | 50 μM |
| DMEM - Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco-Life Technologies | 11985-092 | |
| DMEM/F12 - Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 | Gibco-Life Technologies | 1133--032 | |
| DMEM/F12 powder | Invitrogen | 12500-096 | |
| EDN3 (Endothelin-3, human) | American Peptide Company | 88-5-10B | 100 μM |
| Fibronectin | BD Biosciences | 356008 | 200 μg/ml |
| gelatin (PBS without Mg/Ca) | in house | 0.1% in PBS | |
| Glucose | Sigma | G7021 | |
| Human insulin | Sigma | I2643 | |
| ITS+ Universal Culture Supplement Premix | BD Biosciences | 354352 | |
| KSR (Knockout Serum Replacement) | Gibco-Life Technologies | 10828-028 | |
| Knockout DMEM | Gibco-Life Technologies | 10829-018 | |
| L-Glutamine | Gibco-Life Technologies | 25030-081 | |
| LDN193189 | Stemgent | 04-0074 | 100 mM |
| Low glucose DMEM | Invitrogen | 11885-084 | |
| Matrigel matrix | BD Biosciences | 354234 | Dissolve 1:20 in DMEM/F12 |
| MCDB201 Medium | Sigma | M6770 | |
| MEM minimum essential amino acids solution | Gibco-Life Technologies | 11140-080 | |
| Mouse embryonic fibroblasts (7 million cells/vial) | GlobalStem | GSC-8105M | |
| Mouse Laminin-I | R&D Systems | 3400-010-01 | 1 mg/ml |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103049 | |
| Penicilin/Streptomycin | Gibco-Life Technologies | 15140-122 | 10,000 U/ml |
| Poly-L Omithin hydrobromide | Sigma | P3655 | 15 mg/ml |
| Progesterone | Sigma | P8783 | 0.032 g in 100 ml 100% ethanol |
| Putrescine dihydrochloride | Sigma | P5780 | |
| FGF2 (Recombinant human FGF basic) | R&D Systems | 233-FB-001MG/CF | 10 mg/ml |
| SB431542 | Tocris-R&D Systems | 1814 | 10 mM |
| Selenite | Sigma | S5261 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| SCF (Stem Cell Factor, recombinant Human) | Peprotech Inc. | 300-07 | 50 μg/ml |
| TYRP1 (G-17) Antibody | Santa Cruz | 10443 | 1:200 |
| TYRP2 Antibody | Abcam | 74073 | 1:200 |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco-Life Technologies | 25300-054 | |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris-R&D Systems | 1254 | 10 mM |
References
- Ebert, A. D., et al. Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient. Nature. 457, 277-280 (2009).
- Lee, G., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature. 461, 402-406 (2009).
- Lee, G., et al. Large-scale screening using familial dysautonomia induced pluripotent stem cells identifies compounds that rescue IKBKAP expression. Nat biotechnol. 30, 1244-1248 (2012).
- Lee, G., Studer, L. Induced pluripotent stem cell technology for the study of human disease. Nat methods. 7, 25-27 (2010).
- Zimmer, B., et al. Evaluation of developmental toxicants and signaling pathways in a functional test based on the migration of human neural crest cells. Environ health persp. 120, 1116-1122 (2012).
- Mica, Y., Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. Modeling neural crest induction, melanocyte specification, and disease-related pigmentation defects in hESCs and patient-specific iPSCs. Cell rep. 3, 1140-1152 (2013).
- Mariani, J., et al. FOXG1-Dependent Dysregulation of GABA/Glutamate Neuron Differentiation in Autism Spectrum Disorders. Cell. 162, 375-390 (2015).
- Doulatov, S., et al. Modeling Diamond Blackfan Anemia in Vivo Using Human Induced Pluripotent Stem Cells. Blood. 124, (2014).
- Cherry, A. B. C., Daley, G. Q. Reprogrammed Cells for Disease Modeling and Regenerative Medicine. Annu Rev Med. 64, 277-290 (2013).
- Inoue, H., Nagata, N., Kurokawa, H., Yamanaka, S. iPS cells: a game changer for future medicine. Embo J. 33, 409-417 (2014).
- Kim, C., et al. Studying arrhythmogenic right ventricular dysplasia with patient-specific iPSCs. Nature. 494, 105-110 (2013).
- Fang, D., et al. Defining the conditions for the generation of melanocytes from human embryonic stem cells. Stem cells. 24, 1668-1677 (2006).
- Huang, X., Saint-Jeannet, J. P. Induction of the neural crest and the opportunities of life on the edge. Dev biol. 275, 1-11 (2004).
- White, R. M., Zon, L. I. Melanocytes in development, regeneration, and cancer. Cell stem cell. 3, 242-252 (2008).
- Morrison, S. J., White, P. M., Zock, C., Anderson, D. J. Prospective identification, isolation by flow cytometry, and in vivo self-renewal of multipotent mammalian neural crest stem cells. Cell. 96, 737-749 (1999).
- Elworthy, S., Pinto, J. P., Pettifer, A., Cancela, M. L., Kelsh, R. N. Phox2b function in the enteric nervous system is conserved in zebrafish and is sox10-dependent. Mech develop. 122, 659-669 (2005).
- Harris, M. L., Baxter, L. L., Loftus, S. K., Pavan, W. J. Sox proteins in melanocyte development and melanoma. Pigm cell melanoma r. 23, 496-513 (2010).
- Herbarth, B., et al. Mutation of the Sry-related Sox10 gene in Dominant megacolon, a mouse model for human Hirschsprung disease. PNAS. 95, 5161-5165 (1998).
- Southard-Smith, E. M., Kos, L., Pavan, W. J. Sox10 mutation disrupts neural crest development in Dom Hirschsprung mouse model. Nat genetics. 18, 60-64 (1998).
- Dupin, E., Glavieux, C., Vaigot, P., Le Douarin, N. M. Endothelin 3 induces the reversion of melanocytes to glia through a neural crest-derived glial-melanocytic progenitor. PNAS. 97, 7882-7887 (2000).
- Lister, J. A., Robertson, C. P., Lepage, T., Johnson, S. L., Raible, D. W. nacre encodes a zebrafish microphthalmia-related protein that regulates neural-crest-derived pigment cell fate. Development. 126, 3757-3767 (1999).
- Hou, L., Panthier, J. J., Arnheiter, H. Signaling and transcriptional regulation in the neural crest-derived melanocyte lineage: interactions between KIT and MITF. Development. 127, 5379-5389 (2000).
- Levy, C., Khaled, M., Fisher, D. E. MITF: master regulator of melanocyte development and melanoma oncogene. Trends mol med. 12, 406-414 (2006).
- Phung, B., Sun, J., Schepsky, A., Steingrimsson, E., Ronnstrand, L. C-KIT signaling depends on microphthalmia-associated transcription factor for effects on cell proliferation. PloS one. 6, e24064 (2011).
- Grichnik, J. M., et al. KIT expression reveals a population of precursor melanocytes in human skin. J invest dermatol. 106, 967-971 (1996).
- Li, L., et al. Human dermal stem cells differentiate into functional epidermal melanocytes. J cell sci. 123, 853-860 (2010).
- Nishimura, E. K., et al. Dominant role of the niche in melanocyte stem-cell fate determination. Nature. 416, 854-860 (2002).
- Zur Nieden, N. I. Embryonic stem cell therapy for osteo-degenerative diseases : methods and protocols. , Humana Press. (2011).
- Lee, J. H., et al. high-content screening for novel pigmentation regulators using a keratinocyte/melanocyte co-culture system. Exp dermatol. 23, 125-129 (2014).
