Summary
यह काम एक तंत्रिका शिखा के माध्यम से मानव स्टेम कोशिकाओं से pigmented, परिपक्व melanocytes उत्पादन और एक फीडर से मुक्त, 25 दिन प्रोटोकॉल का उपयोग करने के लिए एक मध्यवर्ती चरण melanoblast इन विट्रो भेदभाव प्रोटोकॉल का वर्णन है।
Introduction
मानव स्टेम कोशिकाओं (hPSCs) रोग मॉडलिंग, दवा स्क्रीनिंग, और सेल प्रतिस्थापन उपचार 1-6 के लिए एक स्केलेबल फैशन में सामान्य भेदभाव नकल करने के लिए एक मंच प्रदान करते हैं। खास रुचि, hPSCs को अलग-थलग करने के लिए मुश्किल या दुर्लभ / क्षणिक प्रकार की कोशिकाओं जहां मरीज के नमूनों के अध्ययन के लिए दुर्लभ हैं अवसर खोलने होंगे। इसके अलावा, प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (IPSCs) एक रोगी विशिष्ट ढंग से विकास और रोग मॉडलिंग का अध्ययन करने के लिए अद्वितीय तंत्र 1,2,7-11 को जानने के लिए सक्षम शोधकर्ताओं। HPSCs से melanocytes के भेदभाव के लिए पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल differentiations के 6 सप्ताह का समय की आवश्यकता है और एल Wnt3a कोशिकाओं 12 से वातानुकूलित माध्यम से संवर्धन कोशिकाओं शामिल है। प्रोटोकॉल पहले मीका एट अल द्वारा प्रस्तुत किया। और यहाँ वर्णित तीन सप्ताह में pigmented कोशिकाओं का उत्पादन और अस्पष्टता और वातानुकूलित माध्यम से जुड़े विसंगतियों को हटा।
melanocytes की गिरफ्तारीई तंत्रिका शिखा, रीढ़ के लिए अद्वितीय कोशिकाओं का एक प्रवासी आबादी से निकाली गई। तंत्रिका शिखा gastrulation के दौरान परिभाषित और तंत्रिका प्लेट के किनारे पर कोशिकाओं की आबादी का प्रतिनिधित्व करता है, तंत्रिका और गैर तंत्रिका बाहरी झिल्ली के बीच की सीमा है। Neurulation के दौरान, तंत्रिका ऊतक तंत्रिका सिलवटों, जो पृष्ठीय midline न्यूरल ट्यूब 13,14, जिसके परिणामस्वरूप पर एकाग्र फार्म के लिए एक तंत्रिका थाली से विकसित।
तंत्रिका शिखा कोशिकाओं, न्यूरल ट्यूब की छत की थाली से उभरने पृष्ठदंड विपरीत, और दूर पलायन विभेदित कोशिकाओं की एक विविध आबादी को जन्म देने से पहले mesenchymal संक्रमण के लिए एक उपकला से गुजरना। शिखा कोशिकाओं के भाग्य भाग में भ्रूण के शरीर के अक्ष के साथ छत प्लेट की शारीरिक स्थान के आधार पर परिभाषित कर रहे हैं। तंत्रिका शिखा सेल डेरिवेटिव दोनों mesoderm की विशेषता प्रजातियों (चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं, अस्थिकोरक, adipocytes, chondrocytes) और बाह्य त्वक स्तर कोशिकाओं में शामिल हैं (melanocytes, श्वान गएल, न्यूरॉन्स) 14। तंत्रिका शिखा स्टेम कोशिकाओं प्रतिलेखन कारक SOX10 upregulate और प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल p75 और HNK1 करने के लिए एंटीबॉडी के साथ छँटाई द्वारा अलग किया जा सकता है।
तंत्रिका शिखा कोशिकाओं melanocytes एक melanoblast मंच के माध्यम से गुजरती हैं और upregulate किट और MITF (microphthalmia जुड़े प्रतिलेखन कारक) 6,21 MITF मेलानोसाईट विकास के एक मास्टर नियामक है और एक प्रतिलेखन कारक मेलानोसाईट विकास के बहुत नियंत्रित करने के लिए जिम्मेदार है बनने के लिए 22 नसीब 24। मानव melanoblasts एपिडर्मिस जहां वे या तो बालों के उभार में या (रंजकता इकाइयों के गठन) एपिडर्मिस में केरेटिनकोशिकाओं से घिरा हुआ परिपक्व, रंजित melanocytes के लिए व्यापारियों के रूप में काम करने के लिए आने से बेसल परत की ओर पलायन। भेदभाव और pigmented melanocytes में melanoblasts की परिपक्वता मेलेनिन उत्पादन मार्ग (TYRP1, Tyr, OCA2 के बाल बल्ब के उपनिवेशवाद और अभिव्यक्ति और साथ सहवर्ती होती हैPMEL) 25,26।
रोगियों से मानव melanocytes और melanoblasts अलग, महंगा मुश्किल और मात्रा में सीमित है। इस प्रोटोकॉल शोधकर्ताओं ने एक अच्छी तरह से परिभाषित, तेजी, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य स्केलेबल, और सस्ती सेल छँटाई के बिना विधि में hPSCs (प्रेरित या भ्रूण) melanocytes या मेलानोसाईट व्यापारियों में अंतर करने में सक्षम बनाता है। प्रोटोकॉल पहले से इस्तेमाल किया गया था जब रंजकता बीमारियों के साथ रोगियों से IPSCs फर्क रोग विशिष्ट दोष की पहचान करने के लिए।
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Protocol
नोट: मेलानोसाईट यहाँ उल्लिखित प्रोटोकॉल पहले मीका एट अल द्वारा प्रदर्शन किया गया।
1. मध्यम संस्कृति की तैयारी, लेपित व्यंजन और hPSCs का रखरखाव
- मध्यम तैयारी
नोट: स्टोर करने के लिए 2 सप्ताह के लिए अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर सभी मध्यम। नसबंदी के लिए सभी मध्यम फ़िल्टर।- DMEM / 10% FBS तैयार करें। 885 मिलीलीटर DMEM, 100 मिलीलीटर FBS, 10 मिलीलीटर पेन / Strep और 5 मिलीलीटर एल Glutamine मिक्स। नसबंदी के लिए फ़िल्टर।
- hESC मध्यम तैयार करें। मिक्स 800 मिलीलीटर DMEM / F12, 200 मिलीलीटर एस आर, 5 मिलीलीटर एल Glutamine, 10 मिलीलीटर सदस्य न्यूनतम आवश्यक अमीनो एसिड समाधान, β-Mercaptoethanol 1 मिलीलीटर, और 5 मिलीलीटर पेन / Strep। 10 एनजी / एमएल FGF -2 जोड़ने छानने के बाद।
- एस आर-भेदभाव मध्यम तैयार: मिक्स 820 मिलीलीटर नॉकआउट DMEM, 150 मिलीलीटर एस आर, 10 मिलीलीटर एल Glutamine, 10 मिलीलीटर पेन / Strep, 10 मिलीलीटर सदस्य न्यूनतम आवश्यक अमीनो एसिड समाधान और 1 मिलीलीटर β-Mercaptoethanol। नसबंदी के लिए फ़िल्टर।
- एन 2-भेदभाव माध्यम से तैयार करें। 12 ग्राम DMEM / F12 पाउडर मैं भंगn 980 मिलीलीटर DH 2 ओ 1.55 छ ग्लूकोज, 2 ग्राम सोडियम बाइकार्बोनेट और 100 मिलीग्राम एपीओ मानव transferrin जोड़ें। 2 मिलीलीटर DH 2 हे 25 मिलीग्राम मानव इंसुलिन के साथ और 40 μl 1 एन NaOH मिश्रण; एक बार भंग, मध्यम करने के लिए मिश्रण जोड़ें। 100 μl प्यूटर्साइन dihydrochloride, 60 μl Selenite, 100 μl प्रोजेस्टेरोन जोड़ें। छानने से पहले DH 2 हे के साथ 1 एल के लिए अंतिम मात्रा लाओ।
- पूर्ण मेलानोसाईट मध्यम तैयार। 50% Neurobasal मध्यम, 30% कम ग्लूकोज DMEM, और 20% MCDB201 जुडा है। इस जोड़ने के लिए: 0.8% अपनी +, 250 एनएम एल glutamine, 100 माइक्रोन के एस्कॉर्बिक एसिड (एल एए), 50 एनजी / एमएल हैजा विष, 50 एनजी / एमएल एससीएफ, 0.05 सुक्ष्ममापी Dexamethasone, 100 एनएम EDN3, 4 एनजी / एमएल FGF2 । 2% B27 पूरक, 25 एनजी / एमएल BMP4, 3 माइक्रोन के CHIR99021, 500 माइक्रोन शिविर: बाँझ फिल्टर तो शेष अभिकर्मकों जोड़ें।
- संस्कृति व्यंजन की कोटिंग
- इस तरह के रूप में Matrigel पतला प्रोटीन का उपयोग कोटिंग बाहर ले। उद्घाटन, विभाज्य और फ्रीज Matrigel 1 मिलीलीटर भागों में दोहराव पर फ्रीज पिघलना ग से बचने के लिएycles। पिघलना और 19 मिलीलीटर DMEM / F12 के साथ एक 1 मिलीलीटर जमे हुए विभाज्य फिर से निलंबित। प्लेट 5 मिलीलीटर एक 10 सेमी पकवान पर। आरटी पर 1 घंटे के लिए व्यंजन सेते हैं। तुरंत चढ़ाना कोशिकाओं से पहले पतला प्रोटीन Aspirate और DMEM / F12 से धो लें।
- पाली एल ornithin hydrobromide / माउस Laminin-मैं / फ़ाइब्रोनेक्टिन (पीओ / लैम / एफ एन) का उपयोग कर कोटिंग बाहर ले। पीबीएस युक्त साथ कोट पकवान 15 माइक्रोग्राम / एमएल पाली एल ornithin hydrobromide। 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हे / एन एक humidified इनक्यूबेटर में। समाधान Aspirate और पीबीएस 1 माइक्रोग्राम / एमएल माउस Laminin-मैं और 2 माइक्रोग्राम / एमएल fibronectin युक्त साथ कोटिंग से पहले तीन बार पीबीएस के साथ प्लेटें धोने। एक humidified इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर व्यंजन हे / एन सेते हैं।
- चढ़ाना कोशिकाओं से पहले, समाधान निकालना और प्लेटों टिशू कल्चर हुड में ढक्कन के बिना अच्छी तरह से सूखे। प्लेटों लगभग 10-15 मिनट के लिए शुष्क करने की अनुमति दें।
नोट: व्यंजन सूखी और सेल चढ़ाना के लिए तैयार कर रहे हैं जब क्रिस्टल संरचनाओं आंखों से सतह पर दिखाई देते हैं। बेनीतों पीबीएस दो सप्ताह के लिए इनक्यूबेटर में लैम / एफ एन युक्त, के रूप में लंबे समय के रूप में तरल लुप्त हो जाना नहीं है के साथ रखा जा सकता है। प्लेटों में कुछ घंटे के लिए आरटी पर सूखे रखा जा सकता है।
- चढ़ाना कोशिकाओं से पहले, समाधान निकालना और प्लेटों टिशू कल्चर हुड में ढक्कन के बिना अच्छी तरह से सूखे। प्लेटों लगभग 10-15 मिनट के लिए शुष्क करने की अनुमति दें।
- hPSCs का रखरखाव
नोट: hPSCs hESC-माध्यम में 0.1% जिलेटिन और mitotically निष्क्रिय माउस भ्रूणीय fibroblasts (MEFs) पर रखा जाता है। कोशिकाओं हर 6-8 दिनों विभाजित किया जाना चाहिए।- कोट 5 मिनट के लिए आरटी पर पीबीएस में 0.1% जिलेटिन के साथ एक 10 सेमी पकवान।
- एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में जल्दी से जमे हुए MEFs गला लें।
- जिलेटिन Aspirate और कोशिकाओं थाली। DMEM / 10% FBS में ~ 50,000 कोशिकाओं / 2 सेमी के घनत्व पर प्लेट MEFs। hPSCs जोड़ने से पहले 37 डिग्री सीओ / एन पर MEFs सेते हैं।
- तैयार MEF थाली से DMEM / 10% FBS Aspirate, पीबीएस के साथ प्लेट धोने और hPSCs के साथ 10 मिलीलीटर hESC मध्यम जोड़ें। पारित होने के 1 के अनुपात में hPSCs: 5/10 घनत्व के आधार पर passaging से पहले।
नोट: hPSCs thawed किया जा रहा है या एकल कक्षों के रूप में passaged, समर्थन10 माइक्रोन वाई 27,632 dihydrochloride (Rocki) पहले पारित होने तक साथ plement। - ताजा 10 मिलीलीटर hESC-माध्यम के साथ दैनिक कोशिकाओं फ़ीड।
- एक भेदभाव किसी भी pluripotent कालोनियों कि विभेदित कोशिकाओं, अनियमित सीमाओं, या पारदर्शी केन्द्रों 28 समाहित हटाने के शुरू करने से पहले। यंत्रवत् हटाना और एक विदारक माइक्रोस्कोप के साथ एक लामिना का प्रवाह हुड के तहत एक विंदुक के साथ अनियमित कालोनियों aspirate।
भेदभाव के लिए hPSCs 2. चढ़ाना
नोट: भेदभाव की स्थिति में 10 सेमी व्यंजनों के लिए वर्णित हैं।
- चरण 1.3.1 में वर्णित के रूप में भेदभाव शुरू करने से पहले 10 सेमी Matrigel व्यंजन तैयार करें।
- एक भेदभाव के लिए hPSCs चढ़ाना एक घनत्व पारित होने के लिए तैयार (~ 80% मिला हुआ) hESC मध्यम aspirate, पीबीएस के साथ धोने और कोशिकाओं को 0.05% trypsin EDTA के 3 मिलीलीटर जोड़ने पर hPSCs की थाली के साथ शुरू करते हैं।
- सख्ती पकवान horizontall हिला2 मिनट के लिए y खुर्दबीन के नीचे visualizing जबकि जब तक MEFs एकल कक्षों के रूप में लिफ्ट बंद। hPSC कालोनियों कालोनियों के रूप में संलग्न रहना चाहिए।
- trypsin Aspirate के बाद MEFs उठा लिया है लेकिन hPSCs कालोनियों को अलग करने से पहले।
- जोड़े hESC मध्यम थाली करने के लिए 10 माइक्रोन वाई 27,632 dihydrochloride युक्त के 10 मिलीग्राम और कालोनियों पर ऊपर और नीचे pipetting द्वारा कोशिकाओं को अलग।
- 2.1 चरण में तैयार 10 सेमी पकवान से Matrigel समाधान Aspirate और DMEM / F12 से धो लें झुरमुटों हटा दें। Matrigel थाली पर 2 अनुपात: एक 1 पर hPSCs प्लेट। hESC मध्यम 10ml अप करने के लिए 10 माइक्रोन वाई 27,632 dihydrochloride युक्त जोड़ें। 37 डिग्री सीओ / एन सेते हैं।
नोट: यह चढ़ाना लगभग 100,000 में कोशिकाओं / 2 सेमी परिणाम चाहिए।
3. तंत्रिका भेदभाव की प्रेरण
नोट: भेदभाव (0 दिन) शुरू किया जाना चाहिए जब hPSCs 80% मिला हुआ हैं। कोशिकाओं hESC-माध्यम के साथ दैनिक खिलाया जा सकता हैभेदभाव शुरुआत तक 10 माइक्रोन वाई 27,632 dihydrochloride हैं।
- दिन 0 और दिन 1 पर, एस आर-भेदभाव 100 एनएम LDN193189 और 10 माइक्रोन के SB431542 युक्त मध्यम के 10 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को खिलाओ।
- 2 दिन, एस आर-भेदभाव 100 एनएम LDN193189, 10 माइक्रोन के SB431542 और 3 सुक्ष्ममापी CHIR99021 युक्त मध्यम के 10 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को खिलाओ।
- 3 दिन, एस आर-भेदभाव 10 माइक्रोन SB431542 और 3 सुक्ष्ममापी CHIR99021 युक्त मध्यम के 10 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को खिलाओ।
- दिन 4 और 5 फ़ीड 75% एस आर-भेदभाव माध्यम के 15 मिलीग्राम और 25% एन 2-भेदभाव 3 सुक्ष्ममापी CHIR99021 युक्त मध्यम के साथ कोशिकाओं पर।
नोट: अस्थायी कोशिकाओं के मामले में सेल मौत की एक बड़ी राशि देखने के लिए चिंतित होना नहीं है। यह सामान्य है और उम्मीद की जा रही है। - 6 और 7 दिनों फ़ीड 50% एस आर-भेदभाव माध्यम के 15 मिलीग्राम और 50% एन 2-भेदभाव माध्यम दोनों युक्त 3 सुक्ष्ममापी CHIR99021, 25 एनजी / एमएल BMP4, और 100 एनएम EDN3 साथ कोशिकाओं पर।
- दिन 8 परऔर 9 फ़ीड 25% एस आर-भेदभाव माध्यम के 20 मिलीग्राम और 75% एन 2-भेदभाव माध्यम दोनों युक्त 3 सुक्ष्ममापी CHIR99021, 25 एनजी / एमएल BMP4, और 100 एनएम EDN3 के साथ कोशिकाओं।
- दिन 9 और 10 पर के रूप में 11 दिन पर कोशिकाओं की फिर से चढ़ाना के लिए 1.2.2 में संकेत पीओ / लाम / एफ एन व्यंजन तैयार करते हैं।
- एन 2-भेदभाव से युक्त 3 सुक्ष्ममापी CHIR99021, 25 एनजी / एमएल BMP4, और 100 एनएम EDN3 माध्यम के 20 मिलीलीटर के साथ दिन 10 फ़ीड कोशिकाओं पर।
नेकां विशिष्टता के लिए बूंदों में 4. replating
- दिन के 11 महाप्राण लाम पर / तैयार पीओ / लैम / एफ एन प्लेटें और सूखी पूरी तरह से एफ एन।
- 11 दिन कोशिकाओं से मध्यम निकालें, पीबीएस के साथ धोने और इस तरह के प्रति 10 सेमी पकवान Accutase के रूप में 4 मिलीलीटर सेल टुकड़ी समाधान जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 25 मिनट के लिए सेते हैं।
- डिश के लिए पूर्ण Melanocyte माध्यम के 5 मिलीलीटर जोड़ें और एक 10 मिलीलीटर विंदुक के साथ मैन्युअल रूप से और नीचे pipetting द्वारा कोशिकाओं resuspend जब तक सभी कोशिकाओं थाली से उठा लिया है। एक 15 मिलीलीटर ट्यूब को निलंबन स्थानांतरण।
- स्पिन200 XG पर 5 मिनट के लिए नीचे कोशिकाओं और पूर्ण Melanocyte माध्यम में मिलीलीटर प्रति 2 एक्स 10 6 कोशिकाओं में कोशिकाओं resuspend। एक hemocytometer या समकक्ष तकनीक पर trypan नीले बहिष्कार का उपयोग कोशिकाओं की गणना करें।
- सूखे पीओ / लाम / एफ एन 10 सेमी व्यंजन पर एक दूसरे के करीब (उन्हें छूने के बिना) प्लेट 10 μl बूंदों। प्लेट पर्याप्त सूख गया है, बूंदों में अच्छी तरह से किनारों को परिभाषित किया है चाहिए और नहीं चला।
नोट: यह कोशिकाओं है, जो महत्वपूर्ण है जब कोशिकाओं replating, जबकि विस्तार के लिए पकवान के भीतर कमरे बनाए रखने के लिए एक उच्च घनत्व स्थानीय वातावरण बनाता है। - बूंदों 10-20 मिनट के लिए आरटी पर खड़ा करने के लिए कोशिकाओं का पालन करने के लिए अनुमति देने के लिए अनुमति दें, तो धीरे-धीरे (संलग्न कोशिकाओं को परेशान करने के लिए नहीं) पूर्ण Melanocyte माध्यम के 10 मिलीलीटर जोड़ें। इनक्यूबेटर पकवान ले जाएँ।
5. Melanocyte प्रोजेनिटर्स विस्तार
- हर 2 से 3 दिन पूर्ण Melanocyte माध्यम के साथ खिला जारी रखें।
नोट: Pigmentation दिखाई डब्ल्यू होना शुरू कर देना चाहिएपहले सप्ताह के अंत तक कोशिकाओं के समूहों Ithin और दूसरे सप्ताह से बहुत ही स्पष्ट हो गया है। इस तरह के कागज के एक पत्रक इन प्रारंभिक छोटे, अंधेरे समूहों के रूप में विचार करने के लिए एक सफेद पृष्ठभूमि पर प्लेट देखें। कोशिकाओं समय पर उत्तरोत्तर अधिक pigmented बन जाएगा, जब तक पूरी थाली समान रूप से pigmented है (चित्रा 2 बी देखें)। - ~ 1 के अनुपात में पारित होने कोशिकाओं एक बार एक हफ्ते: 6 (बूंदों के रूप में चढ़ाना इस स्तर पर नहीं रह आवश्यक है)। कोशिकाओं को अलग कर देना और पहले पूरा Melanocyte माध्यम में फिर से चढ़ाना सादे Neurobasal माध्यम के साथ दो बार धोने के लिए Accutase का प्रयोग करें। पीओ / लैम / एफ एन प्लेटों पर कोशिकाओं को बनाए रखें।
नोट: हमने पाया है कि पूर्ण Melanocyte माध्यम बेस्ट बनाए रखने और hESC और IPSC व्युत्पन्न melanocytes के विस्तार के लिए अनुकूल है। हालांकि, कोशिकाओं व्यावसायिक रूप से उपलब्ध M254 माध्यम में संक्षेप में संवर्धित किया जा सकता है, लेकिन मीडिया को सरल बनाया मर रहा है और प्लेट से उठाने की कोशिकाओं का खतरा बढ़ जाता है।
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Representative Results
इस प्रोटोकॉल इन विट्रो फीडर से मुक्त, लागत, कुशल, और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य तरीके से hPSCs से पूरी तरह pigmented, परिपक्व melanocytes पाने के लिए एक तरीका प्रदान करता है। HPSC व्युत्पन्न melanocytes के लिए पहले से स्थापित फेंग एट अल। प्रोटोकॉल के विपरीत, उल्लिखित प्रोटोकॉल वातानुकूलित माध्यम की आवश्यकता होती है और समय की आवश्यकता कम हो जाती नहीं है। फेंग एट अल। प्रोटोकॉल एक WNT3A उत्पादक murine सेल लाइन से वातानुकूलित माध्यम का उपयोग किया और 6 सप्ताह का समय ले लिया रंजकता 6,12 कल्पना करने के लिए। पूर्वाग्रह एक मेलानोसाईट भाग्य की दिशा में तंत्रिका शिखा स्टेम सेल (melanoblasts) के लिए, हम (चीड़) एक प्रारंभिक नाड़ी के बाद बीएमपी और TGFβ अवरोधकों (LDN और एस.बी. क्रमशः) को हटाने और बाद में छह दिन से संकेत Wnt सक्रियण को बनाए रखते हुए बहिर्जात BMP4 और EDN3 परिचय 6। जिसके परिणामस्वरूप melanoblasts रूप में अच्छी तरह SOX10 expr के रखरखाव के रूप में, किट और MITF की अभिव्यक्ति के द्वारा होती जा सकताession 6। SOX10 की अभिव्यक्ति संस्कृति डिश में क्षेत्रों है कि दिन के 11 संस्कृति (- सी चित्रा 1 बी) द्वारा लकीरें फार्म में देखे जा सकते हैं।
melanoblast प्रेरण के बाद, कोशिकाओं पीओ / लैम / एफ एन प्लेटों पर passaged और पूर्ण Melanocyte माध्यम के साथ खिलाया जाता है। यह एक अत्यंत समृद्ध मध्यम मेलानोसाईट आबादी के लिए चयनात्मक जा रहा है, किसी भी फ्लोरोसेंट सक्रिय सेल 6 छंटनी के लिए आवश्यकता को नष्ट करने के अतिरिक्त लाभ है कि है। मेलानोसाईट परिपक्वता के दौरान, सेल, melanoblast जीनों के कई बनाए रखने TYRP2 सहित जबकि मेलेनिन संश्लेषण जीन TYR और TYRP1 upregulates। Day25 स्टेम सेल मेलेनिन उत्पादन प्रोटीन TYRP1 और TYRP2 (चित्रा 2) के लिए उचित रूप से ली गई melanocytes दाग। इस प्रोटोकॉल मजबूत है और H9 hESC लाइन के साथ और कई IPSC लाइनों के पार इस्तेमाल किया गया है। अभी हाल ही में इस प्रोटोकॉल ईमानदारी उल पुन: पेश करने के लिए इस्तेमाल किया गया था रोगी विशेष IPSC लाइनों 6 का उपयोग रंजकता रोगों के trastructural सुविधाओं।
चित्रा 1. hESC व्युत्पन्न मेलानोसाईट भेदभाव प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम। (ए) भेदभाव प्रोटोकॉल योजना। एस आर: एस आर-भेदभाव माध्यम, एन 2: एन 2-भेदभाव मध्यम, LDN: LDN193189, एस.बी.: SB431542, चीड़: CHIR99021, BMP4: अस्थि morphogenetic प्रोटीन 4, EDN3: endothelin -3, Rocki: वाई 27,632 dihydrochloride बी - सी। GFP hESC पंक्ति: brightfield (बी) और 11 दिन का उपयोग कर एक ट्रांसजेनिक pSOX10 replating करने से पहले पर GFP प्रतिदीप्ति (सी) भेदभाव की छवि को दर्शाता है। Brightfield छवियों में दिखाई अंधेरे लकीरें SOX10 + कोशिकाओं कि melanoblasts और अंततः melanocytes को जन्म देगा के लिए समृद्ध कर रहे हैं। अपलोड / 53,806 / 53806fig1large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2. Melanocyte और मध्यवर्ती चरणों। (ए) pigmented दिवस 25 कोशिकाओं (दाएं) आसानी से देखे जा सकते हैं और दिन से प्रतिष्ठित 11 कोशिकाओं (बाएं) जब pelleted। (बी), 20 दिन तक प्रोटोकॉल की संस्कृति दोनों unpigmented, परिपक्व melanocytes और पूरी तरह से परिपक्व, रंजित melanocytes में शामिल होंगे। (सी - डी) melanocytes उज्ज्वल क्षेत्र के तहत कल्पना की जा सकती है और melanoblast / मेलानोसाईट मार्कर TYRP2 के लिए दोनों परिपक्व और पूरी तरह से pigmented melanocytes दाग। (ई - एफ) देर से मंच मेलानोसाईट मार्कर TYRP1 के लिए केवल pigmented melanocytes दाग।मिल = "_blank"> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
hPSCs से melanocytes के सफल भेदभाव के लिए निम्नलिखित सुझाव को ध्यान में रखा जाना चाहिए। और सबसे पहले, यह सब समय पर बाँझ संस्कृति की शर्तों के तहत काम करने के लिए आवश्यक है। इसके अतिरिक्त, यह pluripotent, पूरी तरह से अविभाजित hPSCs के साथ शुरू करने के लिए महत्वपूर्ण है; यदि शुरू आबादी विभेदित कोशिकाओं शामिल उपज सदा ही छोड़ देंगे के रूप में contaminants melanocytes की दिशा में नहीं जा सकता है और आगे भी ठीक से फर्क कोशिकाओं को बाधित कर सकता है।
यह सुनिश्चित करने के लिए कोशिकाओं को स्टेम सेल के रखरखाव के लिए अच्छी तरह से स्थापित नियमों का पालन करने के लिए ध्यान रखना रहते हैं; खिलाने के लिए और पारित होने के लिए नियमित रूप से और संस्कृतियों दूल्हे passaging पहले विभेदित कोशिकाओं को हटाने के लिए। जब भेदभाव के लिए पतला प्रोटीन पर passaging यह महत्वपूर्ण है कि डिश ठीक से भेदभाव के दौरान से उठाने से कोशिकाओं को रोकने के लिए लेपित है।
Melanoblast अलगentiation लगभग 80% सेल घनत्व शुरू किया जाना चाहिए; बहुत अधिक घनत्व बढ़ सेल मौत का कारण है, जबकि बहुत कम घनत्व नकारात्मक भेदभाव को प्रभावित करेगा। जब passaging, चढ़ाना कोशिकाओं से पहले किसी भी सेल टुकड़ी समाधान निकालने के लिए दो बार धोया जाना चाहिए। 11 दिन पर अस्तित्व को अधिकतम करने के लिए, यह उच्च घनत्व, अच्छी तरह से स्थान बूंदों कि 20 मिनट के लिए अछूते हैं, ताकि कोशिकाओं क्लस्टर और पालन में कोशिकाओं पारित होने के लिए महत्वपूर्ण है।
इस प्रोटोकॉल melanocytes की एक बड़ी संख्या को पैदा करने में प्रभावी है, और जब तक ही सीमित मात्रा का मानव रोगी के नमूने का अध्ययन मूल्यवान होगा। इसके अलावा, के रूप में पीएससी व्युत्पन्न मेलानोसाईट आबादी चयनात्मक और विस्तार योग्य है मेलानोसाईट आबादी कोशिकाओं की बहुत बड़ी संख्या को गुणा किया जा सकता भी भेदभाव की पैदावार कम नंबर या melanocytes के प्रतिशत है। IPSCs के साथ प्रोटोकॉल की शुरुआत विकासात्मक रोगों और रोगी विशिष्ट नमूनों के अध्ययन के लिए संभावना को खोलता है। एक लीइस प्रोटोकॉल के mitation तथ्य यह है melanocytes उपस्थित अन्य सभी प्रकार की कोशिकाओं है कि vivo में अपने सामान्य आला फार्म के बिना एक मोनोकल्चर के रूप में प्राप्त कर रहे है। इसके अलावा प्रोटोकॉल hPSC संस्कृति और भेदभाव तकनीक में विशेषज्ञता की आवश्यकता है। हालांकि, IPSC क्षेत्र के उत्पादन के hPSCs में हाल के घटनाक्रम के साथ तेजी से प्रबंधनीय हो गया है और संवर्धन hPSCs के लिए तरीके दिनचर्या बन गए हैं। तिथि करने के लिए, प्रोटोकॉल हमारी प्रयोगशाला में उपयोग किया गया है H9 जब HES लाइन से melanocytes, साथ ही 14 आईपीएस लाइनों 5 विभिन्न दानदाताओं से उत्पन्न उत्पादन करने के लिए।
मीका एट अल। मानव hESC और IPSCs 6 से melanocytes की व्युत्पत्ति के लिए इस प्रोटोकॉल सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया। कागज दिखा दिया है कि रंजकता दोष के साथ रोगियों से ली गई IPSCs melanocytes में भेदभाव किया जा सकता है और प्रोटोकॉल ईमानदारी प्ररूपी आकार और मात्रा रोग के साथ जुड़े का melanosomes का उत्पादन किया।
wOrk रोग तंत्र के अध्ययन के लिए IPSC व्युत्पन्न melanocytes के उपयोग के साथ प्रोटोकॉल के लिए कई संभावित अनुप्रयोगों में से एक सचित्र और दवा स्क्रीनिंग के लिए 6,29 उत्पादन स्केलिंग की संभावना शुरू की। महत्वपूर्ण बात है, कागज मजबूती और प्रोटोकॉल के reproducibility आनुवंशिक रूप से अलग hiPSC लाइनों का एक बड़ा सेट से melanocytes उत्पादन करने के लिए प्रदर्शन किया।
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Disclosures
लेखकों परस्पर विरोधी हितों कोई खुलासा किया है।
Acknowledgments
इस काम जोआना एम Nicolay फाउंडेशन से मेलेनोमा शोधकर्ताओं के लिए एक फैलोशिप द्वारा और रूथ एल Kirschstein राष्ट्रीय अनुसंधान सेवा पुरस्कार F31 के तहत राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान द्वारा समर्थित किया गया। इस काम के लिए आगे NYSTEM और त्रि-संस्थागत स्टेम सेल पहल (स्टार फाउंडेशन) से अनुदान के माध्यम से समर्थन किया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
| apo human transferrin | Sigma | T1147 | |
| Ascorbic Acid (L-AA) | Sigma | A4034 | 100 mM |
| B27 (B27 Supplement) | Invitrogen | 17504044 | |
| β-Mercaptoethanol | Gibco-Life Technologies | 21985-023 | 10 mg/ml |
| BMP4 | R&D Systems | 314-bp | |
| CHIR99021 | Tocris-R&D Systems | 4423 | 6 mM |
| Cholera toxin | Sigma | C8052 | 50 mg/ml |
| cAMP (cyclicAMP) | Sigma | D0627 | 100 mM |
| Dexamethasone | Sigma | D2915-100MG | 50 μM |
| DMEM - Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco-Life Technologies | 11985-092 | |
| DMEM/F12 - Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 | Gibco-Life Technologies | 1133--032 | |
| DMEM/F12 powder | Invitrogen | 12500-096 | |
| EDN3 (Endothelin-3, human) | American Peptide Company | 88-5-10B | 100 μM |
| Fibronectin | BD Biosciences | 356008 | 200 μg/ml |
| gelatin (PBS without Mg/Ca) | in house | 0.1% in PBS | |
| Glucose | Sigma | G7021 | |
| Human insulin | Sigma | I2643 | |
| ITS+ Universal Culture Supplement Premix | BD Biosciences | 354352 | |
| KSR (Knockout Serum Replacement) | Gibco-Life Technologies | 10828-028 | |
| Knockout DMEM | Gibco-Life Technologies | 10829-018 | |
| L-Glutamine | Gibco-Life Technologies | 25030-081 | |
| LDN193189 | Stemgent | 04-0074 | 100 mM |
| Low glucose DMEM | Invitrogen | 11885-084 | |
| Matrigel matrix | BD Biosciences | 354234 | Dissolve 1:20 in DMEM/F12 |
| MCDB201 Medium | Sigma | M6770 | |
| MEM minimum essential amino acids solution | Gibco-Life Technologies | 11140-080 | |
| Mouse embryonic fibroblasts (7 million cells/vial) | GlobalStem | GSC-8105M | |
| Mouse Laminin-I | R&D Systems | 3400-010-01 | 1 mg/ml |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103049 | |
| Penicilin/Streptomycin | Gibco-Life Technologies | 15140-122 | 10,000 U/ml |
| Poly-L Omithin hydrobromide | Sigma | P3655 | 15 mg/ml |
| Progesterone | Sigma | P8783 | 0.032 g in 100 ml 100% ethanol |
| Putrescine dihydrochloride | Sigma | P5780 | |
| FGF2 (Recombinant human FGF basic) | R&D Systems | 233-FB-001MG/CF | 10 mg/ml |
| SB431542 | Tocris-R&D Systems | 1814 | 10 mM |
| Selenite | Sigma | S5261 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| SCF (Stem Cell Factor, recombinant Human) | Peprotech Inc. | 300-07 | 50 μg/ml |
| TYRP1 (G-17) Antibody | Santa Cruz | 10443 | 1:200 |
| TYRP2 Antibody | Abcam | 74073 | 1:200 |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco-Life Technologies | 25300-054 | |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris-R&D Systems | 1254 | 10 mM |
References
- Ebert, A. D., et al. Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient. Nature. 457, 277-280 (2009).
- Lee, G., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature. 461, 402-406 (2009).
- Lee, G., et al. Large-scale screening using familial dysautonomia induced pluripotent stem cells identifies compounds that rescue IKBKAP expression. Nat biotechnol. 30, 1244-1248 (2012).
- Lee, G., Studer, L. Induced pluripotent stem cell technology for the study of human disease. Nat methods. 7, 25-27 (2010).
- Zimmer, B., et al. Evaluation of developmental toxicants and signaling pathways in a functional test based on the migration of human neural crest cells. Environ health persp. 120, 1116-1122 (2012).
- Mica, Y., Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. Modeling neural crest induction, melanocyte specification, and disease-related pigmentation defects in hESCs and patient-specific iPSCs. Cell rep. 3, 1140-1152 (2013).
- Mariani, J., et al. FOXG1-Dependent Dysregulation of GABA/Glutamate Neuron Differentiation in Autism Spectrum Disorders. Cell. 162, 375-390 (2015).
- Doulatov, S., et al. Modeling Diamond Blackfan Anemia in Vivo Using Human Induced Pluripotent Stem Cells. Blood. 124, (2014).
- Cherry, A. B. C., Daley, G. Q. Reprogrammed Cells for Disease Modeling and Regenerative Medicine. Annu Rev Med. 64, 277-290 (2013).
- Inoue, H., Nagata, N., Kurokawa, H., Yamanaka, S. iPS cells: a game changer for future medicine. Embo J. 33, 409-417 (2014).
- Kim, C., et al. Studying arrhythmogenic right ventricular dysplasia with patient-specific iPSCs. Nature. 494, 105-110 (2013).
- Fang, D., et al. Defining the conditions for the generation of melanocytes from human embryonic stem cells. Stem cells. 24, 1668-1677 (2006).
- Huang, X., Saint-Jeannet, J. P. Induction of the neural crest and the opportunities of life on the edge. Dev biol. 275, 1-11 (2004).
- White, R. M., Zon, L. I. Melanocytes in development, regeneration, and cancer. Cell stem cell. 3, 242-252 (2008).
- Morrison, S. J., White, P. M., Zock, C., Anderson, D. J. Prospective identification, isolation by flow cytometry, and in vivo self-renewal of multipotent mammalian neural crest stem cells. Cell. 96, 737-749 (1999).
- Elworthy, S., Pinto, J. P., Pettifer, A., Cancela, M. L., Kelsh, R. N. Phox2b function in the enteric nervous system is conserved in zebrafish and is sox10-dependent. Mech develop. 122, 659-669 (2005).
- Harris, M. L., Baxter, L. L., Loftus, S. K., Pavan, W. J. Sox proteins in melanocyte development and melanoma. Pigm cell melanoma r. 23, 496-513 (2010).
- Herbarth, B., et al. Mutation of the Sry-related Sox10 gene in Dominant megacolon, a mouse model for human Hirschsprung disease. PNAS. 95, 5161-5165 (1998).
- Southard-Smith, E. M., Kos, L., Pavan, W. J. Sox10 mutation disrupts neural crest development in Dom Hirschsprung mouse model. Nat genetics. 18, 60-64 (1998).
- Dupin, E., Glavieux, C., Vaigot, P., Le Douarin, N. M. Endothelin 3 induces the reversion of melanocytes to glia through a neural crest-derived glial-melanocytic progenitor. PNAS. 97, 7882-7887 (2000).
- Lister, J. A., Robertson, C. P., Lepage, T., Johnson, S. L., Raible, D. W. nacre encodes a zebrafish microphthalmia-related protein that regulates neural-crest-derived pigment cell fate. Development. 126, 3757-3767 (1999).
- Hou, L., Panthier, J. J., Arnheiter, H. Signaling and transcriptional regulation in the neural crest-derived melanocyte lineage: interactions between KIT and MITF. Development. 127, 5379-5389 (2000).
- Levy, C., Khaled, M., Fisher, D. E. MITF: master regulator of melanocyte development and melanoma oncogene. Trends mol med. 12, 406-414 (2006).
- Phung, B., Sun, J., Schepsky, A., Steingrimsson, E., Ronnstrand, L. C-KIT signaling depends on microphthalmia-associated transcription factor for effects on cell proliferation. PloS one. 6, e24064 (2011).
- Grichnik, J. M., et al. KIT expression reveals a population of precursor melanocytes in human skin. J invest dermatol. 106, 967-971 (1996).
- Li, L., et al. Human dermal stem cells differentiate into functional epidermal melanocytes. J cell sci. 123, 853-860 (2010).
- Nishimura, E. K., et al. Dominant role of the niche in melanocyte stem-cell fate determination. Nature. 416, 854-860 (2002).
- Zur Nieden, N. I. Embryonic stem cell therapy for osteo-degenerative diseases : methods and protocols. , Humana Press. (2011).
- Lee, J. H., et al. high-content screening for novel pigmentation regulators using a keratinocyte/melanocyte co-culture system. Exp dermatol. 23, 125-129 (2014).
