Introduction
גרורות מהוות יותר מ -90% של מקרי מוות שנגרם על ידי גידולים מוצקים. עצם הוא האיבר הנפוץ ביותר מושפע גרורות של סוגי סרטן שונים, בעיקר סרטן השד וסרטן הערמונית. כאשר אובחן במרפאה, גרורות בעצמות בדרך כלל כבר נכנסו בשלבים מתקדמים גם עם שינויים osteolytic או osteoblastic בעצם, מלווה לעתים קרובות עם סימפטומים נוירולוגיים.
מחקרים קודמים התמקדו בעיקר על גרורות בעצמות osteolytic גלויה 1-3, אולם בשלב זה אנו מוגבלים הבנה של micrometastases בעצמות לפני תחילת תהליך osteolytic. זהו, לפחות באופן חלקי בשל העדר מודלים וגישות ניסיוני המתאימים. גנטי במודלים של עכברים מהונדסים של סרטן השד לעתים קרובות גרורים לריאות, אבל הרבה פחות יעיל לעצמות 4. כמו כן, גידולים המושתלים orthotopically לעתים רחוקות לפתח גרורות בעצמות ספונטניות, עם כמה טרופי עצם 4T1 חלב carcinomתת-שיבוטים MSP ביטוי יתר במודל עכבר מהונדס PyMT כחריגים 5-7. קידוח Intra-השוקה יכול לספק תאים סרטניים עד העצם 8-10, אבל זה גם נגרם לו נזק ודלקת לרקמות מקומיות. נכון לעכשיו הזרקה תוך לב של שורות תאי סרטן השד כבר הגישה הגדולה לחקור עצם קולוניזציה 11-13. עם זאת, לאחר תאים סרטניים מוכנסים חדר השמאלי רק חלק מוגבל ולבסוף יגיע עצם ומח עצם, ולכן קשה לעקוב אחר גרורות מיקרוסקופיות באופן לכימות.
במחקר זה, אנו קובעים טכניקה, כלומר עורק התוך הכסל (IIA) הזרקת 14, כדי לספק תאים סרטניים באופן סלקטיבי לרקמות הגפיים האחוריות, ובכך להעשיר תאים סרטניים עצם ומח העצם ללא גרימת נזק לרקמות מקומיות. בגלל סגוליות העצם, גישה זו גם מאפשרת מספיק זמן עבור תאים סרטניים עצלים בסופו של דבר ליישב לפניimals להיכנע גידולים או גרורות עיקריים באיברים חיוניים אחרים. בשילוב עם מגוון רחב של טכניקות אחרות, כגון הדמיה פליטת אור, מכתים immunofluorescence ועצמות histomorphometry, הזרקת IIA שימושית פוטנציאלי עבור טווח רחב של מטרות המחקר הקשורים גרורות בעצמות, במיוחד כדי לעקוב אחר התקדמות מתאי סרטן יחיד אל התא רב micrometastases. בפרט, הראינו כי הזרקת IIA מאפשר לנו לדמיין את יחסי הגומלין בין תאים סרטניים מסוגים שונים סביב התאים במיקרו-סביבה של העצם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל עבודת החיה נעשתה בהתאם להנחיות לטיפול בבעלי החיים של ביילור לרפואה.
1. תא הכנה
הערה: שורות תאי הסרטן שונות יכולות לשמש להזרקת IIA בהתאם למטרות מחקר. השתמשנו שורות תאי סרטן השד MCF7, 4T1, 4T07, מד"א- MB-361, מד"א- MB-231, מד"א- MB-436 ו שורת תאים סרטן הערמונית C4-2 במחקר שלנו. אנו משתמשים בדרך כלל הן GFP- ו גחלילית תאים סרטניים שכותרתו בלוציפראז למחקר שלנו ולהראות כמה נתונים כאן מקו תא GFP-בלוציפראז שכותרתו MCF7.
- לשמור על התאים DMEM המכיל 10% FBS ו 0.1 מ"ג / פניצילין, סטרפטומיצין מ"ל ב 37 ° C ב 5% CO 2.
- לפני הזרקת IIA, trypsinize תאים ב 80 - 90 מפגש% עם 0.25% הפתרון טריפסין / EDTA. השתמש קר PBS כדי לשטוף תאים פעמיים, מחדש להשעות התאים 10 מ"ל PBS עבור ספירת תאים. כדי להסיר PBS, תאי צנטריפוגות ב 800 XG במשך 5 דקות.
- מחדש להשעות תאיםבריכוז של 5 x 10 מ"ל 6 תאים / ב PBS קר כקרח.
- השתמש 100 μl GFP- ותאים סרטניים שכותרתו בלוציפראז גחלילית להזרקה IIA של עכבר אחד.
הערה:. לפיכך, מספר תאים שקיבלה כל חיה הוא 5 x 10 5 מספר זה ייתכן שיהיה צורך לשנות מבוסס על האגרסיביות של שורות תאים. - שמור השעיות תא על קרח.
הערה: Vibrations עשוי להיות נחוץ כדי למנוע צבירת תא מדי כמה דקות עד שהוא מוכן להזרקה. עבור שורות תאים מסוימים (כגון מד"א- MB-231), נהלים מחמירים יותר (למשל, עובר דרך 45 מיקרומטר מסננת התא) עשוי להיות נחוץ כדי למנוע צבירה. שימו לב כי לסתום כלי עלול לגרום נמק רקמות, ולכן בלבול הניסויים.
2. הכנת בעלי חיים
- לניהול כאב בעלי חיים, לתת 5 מ"ג / ק"ג / יום carprofen (או משכך כאבים אחר) עם תוסף תזונה כדי העכברים לא פחות מ -24 שעות לפני הניתוח. לְנַהֵלמנה של 0.1 מ"ג / מ"ל עצירות תת עורי 60 דקות לפני הניתוח. הערה: הליך פומבי הוא להשתיל מזרן אסטרדיול לחלק האחורי של חיות כדי לספק אסטרדיול נוסף. זה יאיץ את הגדילה של תאי ER + סרטן (למשל, תאי MCF-7) 9.
- להרדים 4 - עכבר בן 6 בשבוע (כ -20 גר ') עם קטמין (80 - 100 מ"ג / ק"ג) ו xylazine (10 -12.5 מ"ג / מ"ל) על ידי הזרקת intraperitoneal.
- אשר את הרמה המתאימה של הרגעה של עכבר 20 גרם על ידי צביטת בוהן לבין התצפית של ירידה של 50% ב קצב נשימה ורוד רירי (למשל, עור אוזן עכבר עור כפה). שמור עוקבים אחר הסימנים החיוניים הללו כל 15 דקות במהלך הניתוח. הערה: אין תנועה של החיה מציינת כי בעל החיים הוא הרדים מספיק ומוכן לניתוח.
- השתמש במשחת וטרינר על עיניים כדי למנוע יובש.
- לגלח את העכבר על הבטן התחתונה, במיוחד באזור המפשעה בדיוק במקום הניתוח ההזרקה תהיהלְהִתְרַחֵשׁ.
הערה: זה אינו הכרחי אם עכברים בעירום athymic משמשים. - שים את העכבר על גבה, להפיץ את הרגליים בעמדות הטבעיות שלהם לתקוע את בוהן לקרטון לנתיחה ניידת עם קלטת.
- נגב את אזור המפשעה תקין עם 70% אתנול איזופרופיל ספוג צמר גפן סטרילי, אחריו עם מספר פעמים לקרצף כירורגית בבטאדין.
3. וריד מיקום עורקי הכסל המשותף ופרדה
- לעשות חתך בעור של 1.0 - 1.2 ס"מ ארוך בין ה 4 ו -5 th הפטמות בבטן הימנית התחתונה באמצעות להבי אזמל סטרילי פלדה, # 10 פחמן שנערך ידית מס '3. לאחר מכן השתמש וילון ניתוח סטרילי כדי לכסות את הגוף החי למעט במקום החתך.
- הזז את החיה מיקרוסקופ לנתיחה גבי ספסל סטנדרטי. השתמש גדלה של 4X להזרקה.
- תחת גדלת 4X של מיקרוסקופ לנתיחה, הכנס מלקחי הפרדה בוטים בין רקמת השומן ואת peritoneuמ ', ולדחוף את הרקמות כלפי חוץ משני הצדדים כדי לחשוף את כלי כסל ועצבים (ראה איור 1).
הערה: העורק בין אבי העורקים מן קו האמצע ואת החלק התחתון של סניפים העורק נקרא עורק הכסל המשותף. זוהי הנקודה בה את ההזרקה מתרחשת. - השתמש זוג אחד של מלקחיים בסדר ישר לפרוץ את רקמת חיבור (כמו קרום) בין כלי ואת העצב, קרוב יותר אל הכלי.
- Switch מלקחיים ישר בסדר מצד שמאל. תפוס זוג מלקחיים בסדר זוויתי באמצעות יד ימין. הכנס את מלקחי יד ימין לתוך באותה תנוחה שבה רקמות חיבור נשברו. ואז לתקוע את מלקחי יד ימין דרך, מתחת הכלי.
- במקביל, הכנס את המלקחיים ביד שמאל לתוך רקמות החיבור בצד השמאל של הכלי להנחות את מלקחי יד ימין עוברים.
- לאחר מלקחי יד ימין מקבלים מתחת הכלי, לנסות להפריד את הכלי מן ti שמסביבssue קצת יותר, ולאחר מכן לשמור אותם על גבי המלקחיים ביד ימין.
- שימוש במלקחיים ביד שמאל כדי לספק קצה תפר משי 4-0 המלקחיים הימניים, ולאחר מכן משוך את התפר בעדינות ובאיטיות הדרך מתחת הכלי. הערה: עכשיו הן כלי הוורידים ועורקים נפוצים הם הרימו על ידי התפר (ראה איור 2).
4. הזרקת טיפול לאחר ההזרקה
- להכין את התאים להזרקת מזרק אינסולין 31 G. השתמש 100 μl של השעית תא PBS לכל זריקה. הקפד פיפטה מעלה ומטה מספר פעמים כדי להפריד את התאים ולהימנע צבירה כך התאים המוזרקים לא להעמיס ולחסום את זרימת הדם.
- עם מלקחי זווית ביד השמאל, לשים את המלקחיים מתחת הכלי לאורך הדרכתו של התפר, ולאחר מכן לפתוח שתי הזרועות של המלקחיים, בעל הכלי שנערך בעדינות על המלקחיים.
הערה: המרווח בין שתי הזרועות של המלקחיים יהיה iאתר njection. - החזק את המחט 31 G עם 100 השעיות תא μl ביד ימין, עם שיפוע של המחט כלפי מעלה, מוכן להזרקה.
- הכנס את המחט לתוך לומן העורק (דם ייכנס קצה המחט). ואז לדחוף השעית תא לאט להזריק את התאים. השעית התא ידחוף את הדם האדום בתוך הכלי. נסה לא לשבור את הכלים או להדליף את השעית התא החוצה.
- כאשר הזריקה נגמרה, בעדינות למשוך בחזרה את המחט ולשמור החזקת הכלי עד על המלקחיים ביד שמאל כדי לעצור את הדימום. ואז להתרחק התפר.
- משוך כלפי חוץ את המלקחיים ביד שמאל, ומהר השתמש במקלון צמר גפן כדי ללחוץ על אזור החתך העורק כדי לעצור את הדימום.
הערה: בדרך כלל 5 - 10 דק 'לחץ רצוף מספיק כדי לעצור את הדימום. - כאשר הדימום מפסיק, להשתמש בדבק העור כדי לסגור את הקצוות העור של אזור הניתוח. תן תג אוזן, ולבדוק פליטת אור איתות ההתפלגות של תאים מוזרקים. <br /> הערה: זריקה מוצלחת תביא תמונה דומה איור 3.
- בדוק פליטת אור איתות על ידי הזרקה של 100 μl 15 מ"ג / מ"ל luciferin PBS ב 75 מ"ג / ריכוז העכבר ק"ג באמצעות סינוס התוך-מסלולית.
- עבור הזרקה תוך-מסלולית, לשים את האצבעות על שני הצדדים של עין העכבר, להשתמש בלחץ כדי להפוך את כדור עין קופץ החוצה מעט ממסגרת העין, הכנס 28 מחטי G אינסולין במזרק בין כדור עין ואף, ואז לאט לאט לדחוף מזרק להזריק luciferin .
הערה: במיקום הנכון, את המחט אמורה להיות מסוגל להגיע לעומק של 2 - 3 מ"מ לפני שפגע רקמה קשה (עצם). - מניחים את העכבר לתוך מערכת הדמיה הדמיה כולה חיה vivo ב במשך 10 - 60 שניות בתוך 5 דקות (ראה איור 3).
הערה: הליך פומבי הוא להשתיל גלולת אסטרדיול לחלק האחורי של חיות כדי לספק אסטרדיול נוסף. זה יאיץ את הצמיחה של תאי ER + סרטן (למשל, MCF-7תאים) 15.
- עבור הזרקה תוך-מסלולית, לשים את האצבעות על שני הצדדים של עין העכבר, להשתמש בלחץ כדי להפוך את כדור עין קופץ החוצה מעט ממסגרת העין, הכנס 28 מחטי G אינסולין במזרק בין כדור עין ואף, ואז לאט לאט לדחוף מזרק להזריק luciferin .
- בדוק פליטת אור איתות על ידי הזרקה של 100 μl 15 מ"ג / מ"ל luciferin PBS ב 75 מ"ג / ריכוז העכבר ק"ג באמצעות סינוס התוך-מסלולית.
- השאירו את העכבר על כרית חימום חמים עד שהוא מתעורר. לפקח על דימום, נפיחות, סימני בקיעה וכאב בתקופה שאחרי הניתוח. שים העכברים בחזרה לכלוב עם כיסוי כאבים (תוסף תזונה carprofin הציע) נתון לניהול כאב עד שלא סימנים של כאב. שימו לב וטיפול קרוב החיות במהלך 7 ימים לאחר הניתוח.
5. מעקב גדילה גרורתי
- Histomorphometry:
- קציר גידול נושא רקמות עצם, לתקן את העצמות 4% paraformaldehyde למשך 24 שעות, ולאחר מכן decalcify אותם pH 7.0 14% פתרון EDTA במשך 3 - 5 ימים, לייחד להם מקום פרפין הטבעה כפי שתואר לעיל 14.
- סעיף רקמות עצם להטביע-פרפין על עובי של 3 מיקרומטר ולבצע שיטה היסטולוגית רמת מכתים Hematoxylin / Eosin כפי שתואר לעיל 14.
- Immunohistochemisלְנַסוֹת:
- פרפין מוטבע נושא נושאות סרטן עצמות שקופיות אימונוהיסטוכימיה מכתים למטרות שונות כפי שתואר לעיל 14. בקצרה, immunostain תאים סרטניים MCF7 ידי נוגדנים אנטי GFP, ותאי osteogenic immunostain (טרום אוסטאובלסטים ו אוסטאובלסטים) על ידי נוגדנים נגד Osterix ו phosphatase אנטי אלקליין (ALP) נוגדנים, בהתאמה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 1 מדגים את המיקום האנטומי ואת הקשר של עורק הכסל המשותף (אדום) ו וריד (כחול).
איור 2 מראה המיקום היחסי של כלי הכסל ועצבים תחת מיקרוסקופ לנתיחה. כמתואר בתרשים 2A, כלי ועצבים צודקים מתחת קיר הבטן והוא יכול להתגלות לאחר החתך בעור הוא עשה הצפק נדחף משם. וריד הכסל המשותף משמאל, והוא גדול יותר וכהה יותר לעומת העורק. העורק הוא באמצע, ונראה ורוד. זה רזה יותר הווריד אבל יש קיר שריר עבה. הווריד והעורק מקביל קשר הדוק אחד עם השני. בהמשך מימין העצב lumbosacral הלבן. איור 2B מראה כלי כסל משותפים מופרדים רקמת חיבור שמסביב, שרירים ועצבים, והרים על ידי 4-תפר משי 0. וריד, עורק הכסל המשותף, ואת העצבים lumbosacral מסומנים גם.
איור 3 מראה נציג in vivo לשעבר vivo תמונות פליטת אור של חיות לאחר הזרקת עורק תוך כסל. חמישה x 10 5 תאי MCF7 GFP-שכותרתו luciferin ב 100 μl היו מנוהלים על האיבר התקין האחורי של העכבר על ידי הזרקת עורק תוך כסל. D-luciferin היה מנוהל מכן על ידי הזרקת סינוס תוך במסלול, ואחריו הדמית vivo כולן פליטת אור חיה. תאי MCF7 המוזרקים הועשרו על האיבר התקין האחורי של העכבר כפי שצוין על ידי אותות פליטת האור (איור 3 א). תפקידיו של מוסד vivo אותות פליטת האור של החיה כולה אותרו כל 3 ימים או כל שבוע, ולאחר מכן רקמות עצם העכבר נבצרו ב 14 יום לאחר הזרקה כאשר אות פליטת אור חיה כולה הגיעה לסף מסוים (שטף פוטון> 10 4). לאחר מתן D-luciferin, רקמות העצם מהעכבר מוזרק עורק תוך כסל נבצרו במהירות שקועה PBS הדמית vivo לשעבר. אות פליטת האור החזקה מעורק תוך הכסל מוזרק עצם תקין אחורי אך לא מן עצם השליטה על ימין הראתה הלוקליזציה הספציפית של תאים מוזרקים (איור 3).
איור 4 מראה תמונות נציג מכתים היסטולוגית immunofluorescent. כאשר הגידול נושא עצמות נבצרו, הם היו נתוני קיבעון paraformaldehyde, decalcification EDTA, ולאחר מכן-הטבעת פרפין. שלוש מיקרומטר שקופיות עצם הוכנו ורמת צביעת H & E בוצעה. התאים הקומפקטיים דמוי המרוצפים עם גרעינים גדולים היו גרורות המיקרוסקופיות MCF7 ברקמת העצם 14 ימים לאחר הזרקת עורק תוך כסל, כפי שצוינו על ידי החצים האדומים. מח עצם (בע"מ ) ואת עצמות trabecular השטוחות הגדולות הוורודות (TB) עם גרעינים דלילים מסומנות כך (איור 4 א). איור 4B מראה תאי MCF7 שכותרתו GFP (ירוקה), אוסטאובלסטים שכותרתו ALP (אדום בתמונה מהשמאל), שכותרתו Osterix -אוסטאובלסטים מראש (אדומים בתמונה מימין) לאחר מכתים immunofluorescent. מכתים הכחול DAPI מציין את הגרעין.
איור 1:. אנטומיה של עורק כסל משותף (אדום) ו וריד (כחול) עכבר אב עורקים בבטן, עורק כסל משותף, עורק כסל חיצוני, ואת עורק ירך מוצג כפי שצוין. ההזרקה מתבצעת עורק כסל משותף מן האאורטה לעבר כיוון עורק ירך. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
n-page = "1"> 
איור 2:. כולים ועצבי כסל תחת מיקרוסקופ לנתיחה רגיל עם הגדלת 4X (א) תמונה של כולים ועצבים ללא פגע. (ב) תמונה של כלי הרים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: נציג in vivo לשעבר vivo תמונות פליטת אור של עכבר לאחר הזרקת עורק תוך כסל. (א) אות פליטת אור vivo של זכות כל החיה לאחר ההזרקה. (ב) אות פליטת אור vivo לשעברעצם שליטה על ימין ועל העצם התקין המוזרק מחיות מוזרקות שנמסקו כעבור 14 ימים. כל אותות פליטת האור נמדדו על ידי ביצוע ההליך והגדרות המומלצים על ידי היצרן. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4: נציג תמונות של מכתים היסטולוגית immunofluorescent. (א) הנציג H & E תמונה מכתימה של גידול MCF7 נושאות רקמת עצם לאחר הזרקת עורק תוך כסל. בר סולם = 25 מיקרומטר. הערה: HE מכתים אינה הדרך היעילה לגילוי גידולים. ב בהגדלה נמוכה, מכתים הוא אינו רגיש מספיק כדי להבחין בגידולים. בהגדלה גבוהה, זה לא יעיל כדי לסרוק את כל אreas. (ב) תמונות מכתימות Immunofluorescent של רקמת עצם נושאת גידול MCF7. גרין: תאים MCF7 GFP שכותרתו, אדום בתמונה משמאל: אוסטאובלסטים שכותרתו ALP, אדום בתמונה מימין: Osterix שכותרתו מראש אוסטאובלסטים. מכתים הכחול DAPI מציין את הגרעין. סרגל קנה מידה = 25 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
אמנם רק עורק הכסל הוא היעד של הזרקת תאים סרטניים, אנו ממליצים על הפרדת שני וריד הכסל עורק מן הרקמות הסובבות, וכדי להרים אותם יחד כמו חבילה. הסיבה לכך היא כי הוורידים והעורקים בהרחבת קשר אחד עם השני, ועל קיר כלי הוורידים הוא דקים קל לשבור. לכן, עבור זריקה מוצלחת, זה חוסך זמן ומאמץ כדי להחזיק את שתי ספינות יחד, אם כי תאים סרטניים מוזרקים רק אל העורק. תפר משי 4-0 משמש כדי לסייע בתהליך זה כפי שמוצג באיור 2. התפר עשוי גם לסייע דימום להפסיק צריך זה להתרחש.
רוב הצעדים של הזרקת IIA צריך להתבצע תחת מיקרוסקופ לנתיחה. כלי העכבר רכים וקטנים, מה שהופך את ההליכים מאתגרים. עם זאת, לאחר תרגול מספיק, שיעור ההצלחה יכול להגיע ל -90 - 100% מניסיוננו.
בעזרת טכניקה זו, החוקרים עשויים להיותble להקים מודלי קולוניזציה העצם של מודלי התא האהובים הסרטן שלהם, כוללים אלה חשבו באופן מסורתי "לא גרורתי". MCF-7 תאים מייצגים כגון דוגמה. ואכן, כאשר המגיעים במיקרו-סביבה של עצם, תאי MCF-7 לעבור תרדמת קצר לפני ההמראה כדי ליישב. מעטים גרורות בעצמות ספונטנית זוהו והחיות הנושאות xenografts MCF-7 orthotopic. עם זאת, כישלון עשוי היטב לנבוע כמות שיורית של תאים סרטניים להפיץ, הייזום האיטי של קולוניזציה, ואת הצמיחה אגרסיבית יותר של גידולי orthotopic (שהורג חיות לפני נגעי עצם יכולים להקים). לפיכך, חוסר זיהוי לא ניתן לקחת כראיות נגד היכולת של תאי MCF-7 לשלוח גרורות. למעשה, micrometastases העצם מבטל או אפילו רדום עשוי להיות נפוץ יותר אצל חולי סרטן השד אנושיים, כפי שהוצע על ידי שנים-אל-עשורי תרדמת נתפסת לעתים קרובות במרפאת.
הזרקת IIA ניתן ליישם לא רק luminal או תאי סרטן שד בסיס, אלא גם לסוגי סרטן אחרים כמו סרטן הערמונית. בשילוב עם אפשרויות שונות של מחלת עצם טכניקות ניטור, הזרקת עורק תוך כסל יכולה לתרום תרומה משמעותית למטרות מחקר רבות. אנחנו בדרך כלל לשימוש באיתות פליטת אור להתחקות התקדמות גרורה בעצמות לאחר הזרקת עורק תוך כסל, ולאחר מכן עצמות קציר נושאות גידול מכתים אימונוהיסטוכימיה ניאון להגדיר אינטראקציות בין תאים סרטניים נישות microenvironment עצם שמסביב. עצם histomorphometry 16-17 μCT 18-20 ניתן להשתמש כדי להעריך שינויים במבנה העצם ופרטים אנטומיים אחרים של העצם אשר נגרמים על ידי חיסון של תאים סרטניים. שיקולים ושילובי פרופר צריכים להיקבע על ידי כל קבוצה למטרת המחקר הספציפית שלהם.
בדומה-שוקת תוך 8-10 ו חיסון תוך-לב 11-13, הערת אזהרה של איל תוךהזרקת עורק IAC היא שזה לא לשחזר שלבים מוקדמים בתהליך גרורתי לפני התסחיף וכניסה של תאים סרטניים אל מחזור הדם. באופן אידיאלי, תהליך גרור ספונטני החל גידולי orthotopic יהיה צורך לשחזר את מפל גרורות מלא. עם זאת, תהליך זה הוא יעיל מאוד ברוב הדגמים, עם רק כמה יוצאים מן הכלל כגון כמה-טרופי העצם 4T1 תת-שיבוטים 5-6 ו MSP ביטוי יתר במודל עכבר מהונדס PyMT 7. אנו מקווים זריקת IIA תספק תובנות רומן לתוך תהליך הקולוניזציה העצם, אשר בתורו יכול להקל על העיצוב ופיתוח של מודלים גרורים בעצמות ספונטניים יעילים באמת ללימודים פרה-קליניים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| DMEM | HyClone | SH30022.01 | |
| FBS | Gibco | 16000 | |
| Pen/Strep Amphatericin B | Lonza Biowhittaker | 17-745E | |
| PBS | Lonza Biowhittaker | 17-516F | |
| Trypsin/EDTA solution | HyClone | SH30042.01 | |
| 45 μM cell strainer | VWR International Laboratory | 195-2545 | |
| MediGel CPF with carprofen | Controlled item from veterinary care in BCM | For pain management | |
| Buprenorphine | Controlled item from veterinary care in BCM | For pain management | |
| Estradiol pellet | Innovative Research of America | SE-121 | |
| Ketamine and xylazine | Controlled item from veterinary care in BCM | ||
| Vet ointment | Controlled item from veterinary care in BCM | Avoid eye dryness | |
| Shaver | Oster | 78005-050 | For furred mice |
| Isopropyl ethanol | ACROS | 67-63-0 | |
| Betadine surgical scrub | Controlled item from veterinary care in BCM | ||
| #10 scalpel blades | Ted Pella, Inc | 549-3CS-10 | Multiple |
| No. 3 handle | Ted Pella, Inc | 541-31 | Need to be autoclaved |
| Sterile surgical drape | Sai Infusion Technology | PSS-SD1 | |
| Straight forceps | Roboz Surgical Instrument | RS-5132 | Need to be autoclaved |
| Straight fine forceps | Fine Science Tools | 11253-20 | Need to be autoclaved |
| Edged fine forceps | Fine Science Tools | 11253-25 | Need to be autoclaved |
| 4-0 Vicryl silk suture | Johnson & Johnson Health Care | J214H | |
| 31 G insuline syringes | BD | 328418 | Multiple |
| Q-tips cotton swabs (Sterile) | VWR International Laboratory | 89031-272 | |
| Skin glue | Henry Schein Animal Health | 31477 | For surgery site skin closure |
| Ear Tag Applicator | Fine Science Tools | 24220-00 | |
| Ear tags | Fine Science Tools | 24220-50 | |
| D-luciferin | Gold Biotechnology | LUCK | Avoid light and put on ice |
| 28 G insulin syringes | BD | 329410 | For intra-orbital injection |
| Paraformadehyde | Alfa Aesar | 30525-89-4 | For tissue fixation |
| EDTA | OmniPur | 4050 | For bone tissue decalficication |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Dissection microscope | Leica | Leica S6E stereo | |
| IVIS Lumina II imaging system | Advanced Molecular Vision | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| Anti-GFP antibodies (JL-8) | Clontech | 632381 | |
| Anti-ALP antibodies | Abcam | ab108337 | |
| Anti-Osterix antibodies | Abcam | ab22552 |
References
- Kang, Y., et al. A multigenic program mediating breast cancer metastasis to bone. Cancer cell. 3 (6), 537-549 (2003).
- Lu, X., et al. VCAM-1 promotes osteolytic expansion of indolent bone micrometastasis of breast cancer by engaging alpha4beta1-positive osteoclast progenitors. Cancer cell. 20 (6), 701-714 (2011).
- Ell, B., Kang, Y.
- Kretschmann, K. L., Welm, A. L. Mouse models of breast cancer metastasis to bone. Cancer Metastasis Rev. 31 (3-4), 579-583 (2012).
- Lelekakis, M., et al. A novel orthotopic model of breast cancer metastasis to bone. Clin Exp Metastasis. 17 (2), 163-170 (1999).
- Rose, A. A., et al. Osteoactivin promotes breast cancer metastasis to bone. Mol Cancer Res. 5 (10), 1001-1014 (2007).
- Welm, A. L., et al. The macrophage-stimulating protein pathway promotes metastasis in a mouse model for breast cancer and predicts poor prognosis in humans. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (18), 7570-7575 (2007).
- Li, X., et al. Loss of TGF-beta Responsiveness in Prostate Stromal Cells Alters Chemokine Levels and Facilitates the Development of Mixed Osteoblastic/Osteolytic Bone Lessions. Mol. Cancer. Res. 10 (4), 494-503 (2012).
- Gregory, L. S., Choi, W., Burke, L., Clements, J. A. Breast Cancer Cells Induce Osteolytic Bone Lesions In vivo through a Reduction in Osteoblast Activity in Mice. PLoS ON. 8 (9), e68103 (2013).
- Waning, D. L., et al. Excess TGF-β mediates muscle weakness associated with bone metastases in mice. Nat Med. 21 (11), 1262-1271 (2015).
- Simmons, J. K., et al.
- Werbeck, J. L., et al. Tumor microenvironment regulates metastasis and metastasis genes of mouse MMTV-PymT mammary cancer cells in vivo. Vet Pathol. 51 (4), 868-881 (2014).
- Xiang, J., et al. CXCR4 Protein Epitope Mimetic Antagonist, POL5551, Disrupts Metastasis and Enhances Chemotherapy Effect in Triple Negative Breast Cancer. Mol Cancer Ther. 14 (11), 2473-2485 (2015).
- Wang, H., et al. The osteogenic niche promotes early-stage bone colonization of disseminated breast cancer cells. Cancer Cell. 27 (2), 193-210 (2015).
- Hoffmann, J., et al. Characterization of new estrogen receptor destabilizing compounds: effects on estrogen-sensitive and tamoxifen-resistant breast cancer. J Natl Cancer Inst. 96 (3), 210-218 (2004).
- Tannehill-Gregg, S. H., Levine, A. L., Nadella, M. V., Iguchi, H., Rosol, T. J. The effect of zoledronic acid and osteoprotegerin on growth of human lung cancer in the tibias of nude mice. Clin Exp Metastasis. 23 (1), 19-31 (2006).
- Slyfield, C. R., Tkachenko, E. V., Wilson, D. L., Hernandez, C. J.
- Koba, W., Jelicks, L. A., Fine, E. J. MicroPET/SPECT/CT imaging of small animal models of disease. Am J Pathol. 182 (2), 319-324 (2013).
- Simmons, J. K., et al. Canine prostate cancer cell line (Probasco) produces osteoblastic metastases in vivo. Prostate. 74 (13), 1251-1265 (2014).
- Amend, S. R., et al. Thrombospondin-1 regulates bone homeostasis through effects on bone matrix integrity and nitric oxide signaling in osteoclasts. J Bone Miner Res. 30 (1), 106-115 (2015).
