Abstract
Maximaliseren van het voordeel van humane pluripotente stamcellen (hPSCs) voor onderzoek, ziektemodel, farmaceutische en klinische toepassingen vereist robuuste werkwijzen voor de grootschalige productie van functionele celtypes, waaronder hartspiercellen. Hier laten we zien dat de temporele manipulatie van WNT, TGF-β en SHH signaalwegen leidt tot zeer efficiënte cardiomyocyt differentiatie van eencellige door passage HPSC lijnen in zowel statische suspensie en geroerde suspensie bioreactorsystemen. Gebruikmakend van deze strategie heeft geleid tot ~ 100% kloppend bolletjes, consistent met> 80% troponine T-positieve cellen na 15 dagen van de cultuur, gevalideerd in meerdere HPSC lijnen. Wij rapporteren ook een variatie van dit protocol voor gebruik met cellijnen nog niet aangepast aan eencellige passage, waarvan het succes is geverifieerd in 42 HPSC lijnen. Hartspiercellen gegenereerd met behulp van deze protocollen uit te drukken lineage-specifieke markers en tonen verwacht electrophysiological functionaliteiten. Ons protocol biedt een eenvoudige, efficiënte en robuuste platform voor de grootschalige productie van humane hartspiercellen.
Introduction
Menselijke pluripotente stamcellen (hPSCs), waaronder humane embryonale stamcellen (hESCs) en geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSCs), het vermogen van zelf-vernieuwing en het vermogen om te differentiëren in cellen van de drie embryonale kiemlagen 1,2. Vanwege deze kenmerken hPSCs een waardevolle en onbeperkte bron voor het genereren en schaalbare ziekte-relevante celtypen te modelleren menselijke ziekte 3-5, voor high-throughput screening van geneesmiddelen en toxiciteitstests 6,7 en potentieel voor klinische toepassingen 8 . Genereren van hartspiercellen uit hPSCs biedt de mogelijkheid om specifiek onderzoek naar de mechanismen van complexe menselijke hart- en vaatziekten en de mogelijke behandelingen eerder buiten het bestek van onze mogelijkheden vanwege het gebrek aan relevante diermodellen en / of de beschikbaarheid van primaire aangetaste weefsels.
Alle bovengenoemde toepassingen van hPSCs necessitate de productie van grote aantallen van hoogverrijkt en functionele hartspiercellen. Zo is de beschikbaarheid van een efficiënte, reproduceerbare en schaalbaar in vitro cardiale differentiatie protocol geschikt voor meerdere HPSC lijnen is van cruciaal belang. Conventionele cardiomyocyten differentiatie protocollen hebben verschillende strategieën toegepast, zoals embryoid lichaam formatie 9, co-kweektechnieken 10, inductie met cocktails van cytokinen 11 en eiwittransductiedomein methoden 12. Ondanks de vooruitgang in deze technieken, de meeste nog steeds last van slechte efficiency, vereisen dure groeifactoren, of aan te bieden beperkte universaliteit bij een poging om meerdere HPSC lijnen te gebruiken. Tot op heden zijn hieraan grenzen aan de productie van HPSC-afgeleide cardiomyocyten voor celtherapie studies in diermodellen en in de farmaceutische industrie voor geneesmiddelenonderzoek 13 ingesteld. Daarom is de ontwikkeling van robuuste en betaalbare technieken voor grote-schaal productie van functionele HPSC-afgeleide hartspiercellen in schaalbare kweeksystemen zou grotendeels hun commerciële en klinische toepassingen te vergemakkelijken.
In dit manuscript beschrijven we de ontwikkeling van een rendabele en geïntegreerde cardiale differentiatie systeem met hoge efficiëntie, reproduceerbaarheid en toepasbaarheid voor hESCs en hiPSCs gegenereerd uit een verscheidenheid aan bronnen en kweekwerkwijzen, zoals een werkwijze voor de grootschalige productie van zeer verrijkte populaties van HPSC-afgeleide cardiomyocyten onder toepassing van een bioreactor. Daarnaast hebben we dit protocol voor HPSC lijnen niet aangepast aan gratis en / of enkele celkweek voeder, zoals de nieuw opgerichte hiPSCs of grote cohorten van HPSC lijnen de analyse van de ziekte mechanisme relevant geoptimaliseerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Voorbereiding van Cultuur Media, Coating van Cultuur van de Cel Platen en onderhoud van ongedifferentieerde hPSCs
- Mediavoorbereiding
Let op: Steriliseer media met behulp van een 0,22 pm filtratie-inrichting en bewaar bij 4 ° C beschermd tegen licht tot 4 weken. Reagensnamen, leveranciers en catalogus nummers zijn opgenomen in Materials tabel.- Voor muis embryonale fibroblasten (MEF) Medium Combineer 445 ml DMEM, 50 ml foetaal runderserum (FBS) en 5 ml celkweekmedium (bijv Glutamax).
- Voor hESC Medium, combineer 390 ml Knockout-DMEM (KO-DMEM), 100 ml Knockout Serum vervanging (KO-SR), 5 ml media voor celkweek, 5 ml MEM minimum essentiële aminozuren oplossing en 0,5 ml 55 mm β-mercaptoethanol.
VOORZICHTIG: β-Mercaptoethanol toxisch. Vermijd inademing, inslikken en contact met de huid. - Voor RPMI-B27 (RB) Medium, combineer 475 ml RPMI 1640, 10 ml B27 minusinsuline, 5 ml celkweekmedium, 5 ml MEM minimale essentiële aminozuren oplossing, 5 ml penicilline / streptomycine en 0,5 ml 55 mM β-mercaptoethanol.
- Voor de dissociatie oplossing (DS), samen 10 ml 0,05% trypsine, 4 ml KO-SR, 1 ml collagenase type IV (1 mg / ml), 5 ml KO-DMEM en 20 ui CaCl2 (1 M).
- Voor Feeder-cel geconditioneerd medium, voeg 15 ml hESC medium (zonder bFGF) om een T75 fles met con fl uent feeder-cellen (MEF of menselijke voorhuid fibroblasten), die eerder door de behandeling geïnactiveerd met hetzij mitomycine C of door bestraling. Harvest geconditioneerd medium na 24 uur en te vervangen door verse hESC medium. Cellen kunnen worden gebruikt voor maximaal 2 weken.
- Coating van celkweekplaten
- ECM Gel Coating:
- Bij aankoop, dooi ECM gel extract bij 4 ° C totdat deze in een consistente gelijkmatige vloeibare toestand, volgens instructies van de fabrikant. Verdunnen in een verhoudingvan 1: 2 in koude KO-DMEM medium, hoeveelheid en bewaar bij -20 ° C.
Opmerking: Bij de bereiding van de ECM gel, houdt alle benodigde materialen voor toepassing in de aliquotting en bekledingswerkwijze koud. De concentratie van ECM gel varieert met chargenummer. Zorg ervoor dat de concentratie wordt vermeld op porties. Aliquots kunnen bij -20 ° C maximaal 6 maanden worden bewaard. - Ontdooi een ECM hoeveelheid gel bij 4 ° C. Wanneer ontdooid, voeg koud KO-DMEM medium voor een uiteindelijke concentratie van 0,34 mg / ml. Pipet goed en voeg 0,75 ml per één putje van een 6-wells plaat. Incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C.
- Bij aankoop, dooi ECM gel extract bij 4 ° C totdat deze in een consistente gelijkmatige vloeibare toestand, volgens instructies van de fabrikant. Verdunnen in een verhoudingvan 1: 2 in koude KO-DMEM medium, hoeveelheid en bewaar bij -20 ° C.
- Mitotisch geïnactiveerde muis embryonale fibroblast Feeder Cell (MEF) Coating
Noot:. Bereiding van MEF feeder cellen is eerder beschreven 14- Coat een 6-well celkweek plaat met Attachment Factor (AF) of 0,1% gelatine (zie stap 1.2.3) bij kamertemperatuur gedurende 5 min (0,75 ml per één putje van een 6-wells plaat).Verwijder en laat plaat in de bioveiligheid kast (BSC) om te drogen.
- MEF ontdooien van een bevroren flacon overbrengen naar een 37 ° C waterbad gedurende ongeveer 2-3 min.
- Voeg 7 ml MEF medium om een 15 ml buis. Wanneer de flacon met cellen ontdooid, langzaam breng de inhoud aan de 15 ml buis. Centrifugeren bij 300 g gedurende 4 min. Zuig het supernatant en resuspendeer de cellen in MEF medium.
- Tel de cellen en de plaat 1 x 10 6 cellen per plaat met 6 putjes (~ 1,7 x 10 5 cellen / putje). Verwijzing naar een 37 ° C / 5% CO2 incubator en laat cellen hechten O / N voor gebruik.
- Gelatine Coating:
- Los 1 g gelatine poeder in ultrazuiver water om een 0,1% te maken (w / v) oplossing. Incubeer gedurende 15 minuten bij 37 ° C vervolgens autoclaveren de oplossing bij 121 ° C gedurende 15 minuten. Na afkoeling aan de vereiste aantal putten (0,75 ml per putje van een 6-wells plaat) en incubeer gedurende 15 minuten bij 37 ° C.
- Los 1 g gelatine poeder in ultrazuiver water om een 0,1% te maken (w / v) oplossing. Incubeer gedurende 15 minuten bij 37 ° C vervolgens autoclaveren de oplossing bij 121 ° C gedurende 15 minuten. Na afkoeling aan de vereiste aantal putten (0,75 ml per putje van een 6-wells plaat) en incubeer gedurende 15 minuten bij 37 ° C.
- Laminine Coating:
- Ontdooien laminine (1 mg / ml) bij 4 ° C totdat ontdooid. Tot 5 pl laminine oplossing, voeg 1 ml koude PBS. Pipet en vervolgens aan het vereiste aantal putten (0,75 ml per putje van een 6-wells plaat) en incubeer 1 uur bij 37 ° C.
- Silicon Coating van centrifugekolf Internal Surface:
- Grondig wassen een 100 ml centrifugekolf (met 1 glas slinger) met gedestilleerd water, met behulp van een borstel om stof en / of de cultuur te verwijderen. Vul met 70% ethanol en na 30 minuten spoelen met gedestilleerd water. Voeg 5 M NaOH en laat O / N.
- Verwijder NaOH-oplossing en spoel de kolf onder stromend water gedurende 5 minuten. Vul de kolf met 1 M HCl en laat 15 min. Was kolf met stromend water gedurende 5 minuten, daarna tweemaal met dubbel gedestilleerd water volledigVerwijder elk spoor van HCl. Laat de kolf volledig opdrogen in de BSC.
- Voeg 1,5 ml siliconiseerproces oplossing aan de kolf en draait horizontaal op alle oppervlakken bedekken. Herhaal dezelfde procedure voor het glas slinger.
- Verwarm de beklede kolf in een droogoven bij 100 ° C gedurende 1 uur of laten drogen O / N bij kamertemperatuur. Bij verhitting in een oven, laat afkoelen tot kamertemperatuur gedurende 30 - 60 min.
- Spoel de kolf 3 keer met gedeïoniseerd water gedurende 15 minuten elk, vervolgens steriliseren autoclaaf bij 121 ° C gedurende 20 min.
- ECM Gel Coating:
- Onderhoud van ongedifferentieerde hPSCs
Noot: Voor elk van de beschreven protocollen tenzij specifiek vermeld worden cellen gekweekt en gekweekt in putjes van 6 putjes en volumes geschikt voor dit formaat worden.- hPSCs Gekweekte als Onzichtbare sferoïden in een statische Suspension System
Opmerking: gebruikt in deze stappen cellen moeten nu al worden aangepast aansingle-celkweek. 15- Begin experiment met hPSCs gekweekt op ECM-gel in een 6-well cultuur plaat bij ongeveer 70-80% samenvloeiing. Verwijder eventuele gedifferentieerde kolonies met behulp van de stereomicroscoop in de BSC. Voeg 10 pM ROCK inhibitor Y-27.632 en incubeer bij 37 ° C gedurende 1 uur.
Opmerking: Voor het verwijderen van de gedifferentieerde koloniën, gebruik dan een pipet tip om los te maken en voorzichtig al het gedifferentieerde onderdelen handmatig te verwijderen onder de stereomicroscoop. Wees voorzichtig ongedifferentieerde kolonies niet te verwijderen. - Verwijder cellen van incubator en zuig medium. Was de cellen met 1 ml PBS, verwijder en voeg 0,5 ml cel dissociatie enzym. Incubeer de cellen gedurende 4-5 minuten bij 37 ° C.
- Voeg 1 ml hESC medium en de oogst van de cellen met behulp van een cel schraper. Dissociëren de cellen in enkele cellen met behulp van een pipet p1,000. Tel de levensvatbare cellen met behulp van trypan blauw en een hemocytometer.
- Resuspendeer cellen 2 x 10 5 c levensvatbareells / ml in feeder-cellen geconditioneerd medium gesupplementeerd met 100 ng / ml bFGF en 10 pM ROCK remmer Y-27632. Transfer cellen ultralage platen bevestiging met behulp van een 5 ml pipet (3 ml per putje van 6-well plaat).
- Na 2 dagen, verwijder voorzichtig cellen uit incubator en zuig de helft van het medium (ongeveer 1,5 ml). Vervangen door vers geconditioneerd medium gesupplementeerd met 100 ng / ml bFGF.
- Verander de helft van het medium elke dag met geconditioneerd medium aangevuld met 100 ng / ml bFGF tot en met dag 5. Nu, ofwel verdere kweekcellen, doorgang voor voortgezet ongedifferentieerde cultuur (stap 1.3.1.2 - 5), of het gebruik voor cardiale differentiatie (Deel 2 ). Als voortzetting van cultuur, passage cellen elke 4-8 dagen.
- Begin experiment met hPSCs gekweekt op ECM-gel in een 6-well cultuur plaat bij ongeveer 70-80% samenvloeiing. Verwijder eventuele gedifferentieerde kolonies met behulp van de stereomicroscoop in de BSC. Voeg 10 pM ROCK inhibitor Y-27.632 en incubeer bij 37 ° C gedurende 1 uur.
- hPSCs gekweekt op voedingscellen en door passage gebruiken Collagenase type IV
- Voor het passeren van hPSCs, verwijder gedifferentieerde kolonies met behulp van de stereomicroscoop in de BSC. Zuig het medium en wassen cellen met 1 mlPBS per well. Verwijderen voeg 0,75 ml collagenase type IV (1 mg / ml) en incubeer bij 37 ° C gedurende 5 - 15 min, zoals vereist om de randen van de kolonies beginnen los te krijgen.
- Zuig collagenase en voeg 1 ml van hESC medium per well. Los kolonies kleine clusters met een cel schraper, breng de cellen met een p1,000 pipet in een 15 ml buis. Wees voorzichtig niet te breken van de clusters in kleine stukjes.
- Was het goed met 1 ml hESC medium om alle resterende cellen te verzamelen en toe te voegen aan 15 ml buis. Centrifugeer bij 100 xg gedurende 2 minuten. Zuig het supernatant en resuspendeer cellen in hESC medium gesupplementeerd met 100 ng / ml bFGF.
- Verwijderen van een MEF beklede plaat uit de incubator en zuig het MEF medium. Overdracht van de cellen in een verhouding tussen 1: 3 en 1:10, in voorkomend geval. medium dagelijks veranderen met verse hESC medium aangevuld met 100 ng / ml bFGF. Passage cellen elke 4-8 dagen.
- hPSCs Gekweekte als Onzichtbare sferoïden in een statische Suspension System
2. differentiatie van hPSCs als sferoïden in een Static Suspension System
- Begin experiment met behulp van dag 5 ongedifferentieerde sferoïden zoals bereid in paragraaf 1.3.1.
Opmerking: In dit stadium moet de gemiddelde grootte van sferoïden zijn 175 ± 25 urn. Een minimum van 50 bolvormige deeltjes moet worden gebruikt bij het starten van een differentiatie experiment. - Transfer sferoïden in een 15 ml buisje met een 5 ml pipet. Was de put met 1 ml medium RB om achtergebleven sferoïden verzamelen en voeg dezelfde 15 ml buis. Laat de cellen voor 5 min, totdat sferoïden zijn bezonken naar een losse pellet (NIET centrifuge) te vormen. Zuig het supernatant, zorg dat u geen bolletjes niet te nemen.
- Voeg 3 ml RB-medium aangevuld met 12 pM CHIR99021. Breng de cellen terug in een putje van een 6-well ultra-lage bevestigingsplaat. Na 24 uur, herhaalt u stap 2.2.
Let op: RB medium is lichtgevoelig. Bij het werken met RB medium, houdt de BSC licht uitgeschakeld. - EENdd 3 ml RB medium aan de cel pellet. Breng de cellen terug in een putje van een 6-well ultra-lage bevestigingsplaat. Na 24 uur, herhaalt u stap 2.2.
- Voeg 3 ml RB-medium aangevuld met IWP2, purmorphamine en SB431542 (5 uM elk). Breng de cellen terug in een putje van een 6-well ultra-lage bevestigingsplaat. Na 2 dagen herhaalt u stap 2.2.
- Resuspendeer de cellen in 3 ml RB medium overgebracht in een met gelatine beklede plaat om de cellen te hechten.
Opmerking: In dit stadium kunnen de cellen worden in suspensie gehouden. Om verder te gaan met statische suspensiekweek, de overdracht van de cellen terug naar een ultra-lage bevestigingsplaat. - Verander het medium met 3 ml RB medium na 2 dagen. De kweken zal beginnen om de volgende dag te verslaan. Verander het medium om de 3-4 dagen met RB medium.
3. Differentiatie van hPSCs als sferoïden in een geroerde suspensie Bioreactor
- Begin experiment met ongedifferentieerde bolletjes cultuurd in statische suspensie voor minstens 3 passages (zie paragraaf 1.3.1). Voeg 10 pM ROCK inhibitor Y-27.632 en incubeer bij 37 ° C gedurende 1 uur.
- Verwijderen cellen van incubator en overdracht van alle bolletjes in een 15 ml buisje met een 5 ml pipet. Was het goed met 1 ml hESC medium om alle resterende bolletjes te verzamelen en toe te voegen aan dezelfde 15 ml buis. Laat de cellen voor 5 min, totdat sferoïden zijn bezonken naar een losse pellet (NIET centrifuge) te vormen. Zuig het supernatant, zorg dat u geen bolletjes niet te nemen.
- Was de cellen door toevoeging van 1 ml PBS. Laat gedurende 5 minuten totdat sferoïden zijn bezonken naar een losse pellet (NIET centrifuge) te vormen. Verwijder supernatant en voeg 0,5 ml 0,05% trypsine plus 0,53 mM EDTA. Incubeer de cellen gedurende 4-5 minuten bij 37 ° C.
- Verwijder cellen van de incubator en voeg 1 ml hESC medium. Met behulp van een p1,000 pipet, dissociëren de cellen in enkele cellen, de telling van de cellen met behulp van trypan blauw en een hemocytometer. Resuspendeer tot 2 x 10 5 Viable cellen / ml in geconditioneerd medium gesupplementeerd met 100 ng / ml bFGF en 10 pM ROCK remmer Y-27632.
- Breng 100 ml van celsuspensie in de gesiliconiseerde bioreactor fles met 1 slinger (zie paragraaf 1.2.5). Begin met 35 rpm agitatie en na 24 uur te verhogen tot 40 toeren per minuut.
- Na 48 uur, stop roeren gedurende 5-10 min totdat alle sferoïden hebben zich op de bodem van de kolf. Vervang de helft van het medium met geconditioneerde medium gesupplementeerd met 100 ng / ml bFGF. Herhaal hetzelfde proces om de 24 uur tot en met dag 5.
Opmerking: In dit stadium moet ongedifferentieerde sferoïden met een gemiddelde grootte van 175 ± 25 pm worden gevormd. - Stop roeren gedurende 5-10 min totdat alle sferoïden hebben zich op de bodem van de kolf. Breng alle sferoïden een 50 ml buis in een minimale hoeveelheid medium (minder dan 50 ml). Gooi eventuele resterende medium in de bioreactor kolf zorgvuldig zodat er geen sferoïden zijn nog in het vat.
- leave voor 5-10 min totdat alle sferoïden onder in de 50 ml buis hebben gevestigd dan voorzichtig de supernatant verwijderd zonder verstoring van de losse cel pellet. Wassen met 25 ml PBS met calcium en magnesium of RB medium, dan laat opnieuw voor 5-10 min totdat alle sferoïden onder in de 50 ml buis hebben zich opnieuw vormen een losse pellet.
- Verwijder voorzichtig het supernatant en voeg 40 ml RB-medium aangevuld met 12 uM CHIR99021, 10 uM Rock-remmer en 0,1% poly vinyl alcohol (PVA). Resuspendeer de sferoïden en overdracht van alle cellen terug naar de bioreactor kolf. medium toe te voegen aan het totale volume 100 ml te maken. Herstart roeren bij 40 rpm gedurende 24 uur.
Let op: RB medium is lichtgevoelig. Bij het werken met RB medium houdt de BSC in het licht uitgeschakeld mode. - Herhaal stap 3,7-3,8.
- Verwijder voorzichtig het supernatant en voeg 40 ml RB medium aangevuld met 0,1% PVA. Resuspendeer de sferoïden en overdracht van alle cellen terug naar tHij bioreactor kolf. medium toe te voegen aan het totale volume 100 ml te maken. Herstart roeren bij 40 rpm gedurende 24 uur.
- Herhaal stap 3,7-3,8.
- Verwijder voorzichtig het supernatant en voeg 40 ml RB medium aangevuld met IWP2, purmorphamine en SB431542 (5 uM elk). Resuspendeer de sferoïden en overdracht van alle cellen terug naar de bioreactor kolf. medium toe te voegen aan het totale volume 100 ml te maken. Herstart roeren bij 40 rpm gedurende 2 dagen.
- Herhaal stap 3,7-3,8.
- Verwijder voorzichtig het supernatant en voeg 40 ml uitsluitend RB medium. Resuspendeer de sferoïden en overdracht van alle cellen terug naar de bioreactor kolf. medium toe te voegen aan het totale volume 100 ml te maken. Herstart roeren bij 40 rpm. 72 uur later - Beating sferoïden moet 48 in acht worden genomen.
- Verander de helft van het medium elke 3-4 dagen met RB medium alleen door afschaffing roeren gedurende 5-10 min totdat alle sferoïden hebben zich naar de bodem van het vat. Verwijder voorzichtig 50 ml van medium zonder de bolletjes en Caref verstorenully vervangen door 50 ml vers medium RB.
4. Differentiatie van hPSCs Met behulp van culturen niet aangepast aan Single Cell Passage
Opmerking: Deze benadering is bijzonder bruikbaar voor de snelle differentiatie van een groot aantal HPSC lijnen zonder aanpassing aan eencellige kweektechnieken, een enorm arbeidsintensief en tijdrovend proces. Deze techniek is toepasbaar op cellijnen die zeer gevoelig zijn voor enzymatische cel dissociatie zijn, zoals recent opgerichte HPSC lijnen.
- Begin experiment met hPSCs gekweekt op MEF (zoals in paragraaf 1.3.2) die ongeveer 70-80% confluent. Verwijder eventuele gedifferentieerde kolonies met behulp van de stereomicroscoop in de BSC.
- Verwijder medium en voeg 0,5 ml Dissociatie Solution (DS). Incubeer gedurende 0,5-1 min tot MEF cellen zich hebben afgerond en de randen van hPSCs kolonies duidelijk. Snel te verwijderen DS en voeg 0,75 ml collagenase type IV (1 mg / ml).
- Incuberende cellen gedurende 5-15 minuten bij 37 ° C. Controleer de cellen onder de microscoop tijdens de incubatieperiode, en wanneer hele kolonies beginnen vruchten af te tillen en los te maken, verwijderen collagenase en voeg 1,5 ml hESC medium.
Let op: Als na 15 minuten de meeste van de kolonies worden nog steeds verbonden, zet de cellen terug naar incubator. Controleer de cellen onder de microscoop elke 5 min. Wees voorzichtig niet om de cellen in collagenase vertrekken naar meer dan 30 min. Als er veel drijvende kolonies in de collagenase oplossing niet de collagenase te laten zitten voeg 1 ml hESC medium. - Met behulp van een pipet p1,000 voorzichtig pipet kolonies als geheel kolonies los. Laat de koloniën niet breken in kleine stukjes. Breng de cellen in een 15 ml buisje met een 5 ml pipet. Was het goed met 1 ml hESC medium om alle resterende cellen te verzamelen om toe te voegen aan dezelfde buis. Laat gedurende 5 minuten totdat alle kolonies hebben gesedimenteerd (NIET centrifuge).
- Verwijder de bovenstaande vloeistof voorzichtig en voeg 2 ml hESC medium gesupplementeerd met 100 ng / ml bFGF. Breng de cellen in een ultra-lage bevestigingsplaat via 5 ml pipet (1 ml in elk putje van een 24-wells plaat en 3 ml in elk putje van een 6-wells plaat). Incubeer bij 37 ° C / 5% CO2 gedurende ten minste 6 uur (maximaal 12 uur).
- Gedurende deze tijd, de voorbereiding van de benodigde aantal laminine-beklede putjes / platen voor stap 4,7. Aanbevolen cel overbrengingsverhoudingen zijn 1 samenvloeiing putje van een 6-wells plaat tot 2 putjes van een 24-well plaat (of een gelijkwaardig bedrag per oppervlakte).
- Na 6 uur voorzichtig overdracht van de kolonie aggregaten in een 15 ml buis met behulp van 5 ml pipet. Was de plaat met RB medium om achtergebleven aggregaten verzamelen en voeg dezelfde 15 ml buis (0,5 ml per putje voor 24 putjes en 1 ml per putje voor platen met 6 putjes). Wacht 5 minuten tot de aggregaten sediment, vervolgens voorzichtig zuig het supernatant. Wees voorzichtig de losse pellet niet te verstoren.
- Voeg 2 ml RB-medium aangevuld met 12 uM CHIR99021 en zorgvuldig over te dragenmet een 5 ml pipet uw voorbereide laminine beklede putjes (zoals in paragraaf 1.2.4) om de cellen te hechten.
- Na 24 uur, verwijder voorzichtig het medium in elk putje en voeg 1 ml uitsluitend RB medium.
Opmerking: Sommige van de aggregaten zal alleen hebben gehecht zeer zwak aan de cultuur plaat; daarom is het belangrijk om grote aggregaten die los tijdens het medium verandering procedure kan gekomen zijn niet te verwijderen. Het is echter belangrijk om zoveel mogelijk van de kleine celresten mogelijk te verwijderen. - Na 24 uur, verwijder voorzichtig het medium en voeg RB medium aangevuld met IWP2, purmorphamine en SB431542 (5 uM elk).
- Verander het medium na 2 dagen met slechts RB medium. Cellen zal beginnen om de volgende dag te verslaan.
- Verander het medium om de 3-4 dagen met slechts RB medium.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om een eenvoudige methode vast voor de grootschalige differentiatie van cardiomyocyten van hPSCs hebben we een protocol waarbij cellen werden aanvankelijk behandeld met een Wnt / β-catenine activator (CHIR99021) 16 en vervolgens met remmers van de Wnt / β- catenine en transformerende groeifactor-β (TGF-β) paden (IWP2 16 en SB431542 17, respectievelijk) en tenslotte een activator van de sonic hedgehog (SHH) route (purmorphamine) 17 (Figuur 1A). In onze differentiatiestrategie ongeveer 50% van de sferoïden (175 ± 25 urn diameter sferoïde grootte) begonnen 7 dagen slaan na aanvang van differentiatie, die vervolgens op dag 10. Interessant tot 100% toegenomen, met dit protocol, gedifferentieerd sferoïden waargenomen verder omhoog slaan tot 60 dagen na differentiatie opening 18. Bevolking studies over gesplitste sferoïdenonderzocht door stromingscytometrie bleek dat op dag 15, meer dan 90% van de bevolking bevatte cardiaal troponine T positieve (cTnT +) cellen, terwijl minder dan 12% van de cellen positief voor gladde spier en endotheliale markers (3,1% von Willibrand Factor waren (vWF +), 8,4% alfa-gladde spier actine-positieve (ASMA +)) 18. Tot op heden heeft de statische suspensie differentiatie protocol getest op 5 hESC en 4 iPSC lijnen met vermogens resulterend in ongeveer 90% van sferoïden verslaan van elke lijn, met de hoge reproduceerbaarheid van het protocol tussen verschillende HPSC lijnen (Figuur 1B).
Om een geïntegreerd platform voor grootschalige productie van humane hartspiercellen ontwikkelen, pasten we onze statische suspensie Differentiatie aan een geroerde suspensie bioreactor (figuur 2A). De differentiërende sferoïden vertoonde soortgelijk gedrag in de bioreactor environment zoals in het statische systeem (Figuur 2B) en ongeveer 100% van de sferoïden werden waargenomen te verslaan op dag 10 18. Immunokleuring in delen van het verslaan van bolletjes verzameld op dag 30 met behulp van antilichamen tegen cTnT en de cardiale transcriptiefactor NKX2-5, toonden cytoplasmatische en nucleaire expressie van deze eiwitten, respectievelijk (figuur 2C). De totale opbrengst aan cellen in de dynamische suspensiekweek ongeveer 90-100.000.000 cellen in 100 ml werkvolume na 15 dagen kweek differentiatie. Met dit laatste geval kan de cardiomyocyt opbrengst oplopen tot ongeveer 54-90.000.000 cellen (met de waargenomen 60-90% differentiatie werkzaamheid) van 20 miljoen vanaf hPSCs, geïnoculeerd in de hPSCs expansiefase als enkele cellen. We bovendien onderzocht de elektrofysiologische eigenschappen van gedifferentieerde hartspiercellen met behulp van de single-cell patch clamp-methode. Beating bolletjes uit de bioreactor culturen warengescheiden in afzonderlijke cellen op dag 30 en actiepotentialen die op representatieve cellen met behulp van de gehele cel patch clamp techniek. Gegevens bleek de aanwezigheid van de drie cardiale celtypen (atriaal, nodal- en ventriculaire-achtige cellen) in de populatie van afzonderlijke cellen 18.
Voor de twee bovengenoemde differentiatie technieken moeten hPSCs worden aangepast aan feeder-vrij en / of eencellige suspensiekweek 19-21. Sommige HPSC lijnen zijn echter zeer gevoelig voor enzymatische cel dissociatie en tonen significante cellevensvatbaarheid verlies na dissociatie, zoals in nieuw opgerichte iPSC lijnen kunnen worden waargenomen. Bovendien, bij het werken met grote cohorten lijnen, passen allemaal feeder-vrij en single-celkweek zou enorm arbeidsintensief en tijdrovend. Om deze problemen aan te pakken, werden ongedifferentieerde sferoïden vervangen door ongedifferentieerde cel aggregaten (figuur 3A).Onze gegevens tonen aan dat het gebruik van dit gemodificeerde techniek slaan clusters verscheen na 7 dagen differentiatie initiatie. De reproduceerbaarheid van deze gewijzigde versie werd bevestigd middels 42 iPSC lijnen, waarbij alle geteste cellijnen ontwikkeld gemiddeld meer dan 60% cTnT + cellen op dag 15 voor elk experiment uitgevoerd (Figuur 3B). Immunokleuring met behulp van antilichamen tegen cTnT en NKX2-5 in gedissocieerde verslaan clusters toonden cytoplasmatische en nucleaire expressie, respectievelijk (figuur 3C).
Figuur 1. Schematische voorstelling van Cardiomyocyte Differentiatie van hPSCs in Static Schorsing en representatieve gegevens. (A) Experimentele ontwerp van hPSCs differentiatie tot hartspiercellen in statische ophangsysteem. (B) Evaluatie van de efficiëntie van decardiale differentiatie wordt gemeten door het tellen van het aantal verslagen sferoïden (%). Hier worden de gemiddelden van ten minste 3 experimenten differentiatie van elk van 5 hESC en 4 iPSC lijnen 18. Totaal gemiddelde van bolletjes verslaan van alle lijnen is ongeveer 90%. Error bars vertegenwoordigt SD (n = 3). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Over het algemeen Schematische voorstelling van Cardiomyocytes Differentiatie van hPSCs in Dynamic Suspension en representatieve gegevens. (A) Experimentele ontwerp van hPSCs differentiatie tot hartspiercellen in dynamische ophangsysteem. RI: Rock remmer (B) fase contrast beeld van dag 5 sferoïden (vertegenwoordiger resultaat van Royan H5 hESC lijn). Schaal bar 200 micrometer (C) Immunokleuring van hESC afgeleide-verslaan bolletjes gesegmenteerd op dag 30 voor Nkx2.5 en cTnT. Schaal bar 100 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Overall Schematische voorstelling van Cardiomyocytes Differentiatie van hPSCs gebruik van culturen niet aangepast aan Single Cell Passage. (A) Proefopzet hPSCs differentiatie tot hartspiercellen middels kweken niet aangepast aan cel passage. (B) Flowcytometrieanalyse gedissocieerde aggregaten toon gemiddeld meer dan 60% cTnT + cellen in 42 geteste iPSC lijnen. (C) Immunokleuring van gedissocieerde cardiomyocyten afgeleid vanhiPSCs voor Nkx2.5 en cTnT (Vertegenwoordiger resultaat 646-4 iPSC lijn). Schaal bar 20 urn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Cardiomyocyten afgeleid van hPSCs is een zeer aantrekkelijke bron voor toepassing bij humane ziektemodel, drug screening / toxiciteitstests en, misschien in de toekomst regeneratieve therapieën. Een van de belangrijkste obstakels het gebruik van deze cellen is echter de mogelijkheid om voldoende hoogwaardig materiaal voor het daadwerkelijk gebruik. Met behulp van onze beschreven protocol, bieden wij een methode die deze beperking overwint.
Onlangs hebben synthetische kleine moleculen gericht op specifieke signaalwegen betrokken bij cardiogenese beschreven cardiale differentiatie 16,17,22,23 verbeteren. Deze worden nu gebruikt als alternatief voor recombinante cytokinen en serum, met veel ongedefinieerde factoren en tonen batch variatie. Het belangrijkste voordeel van een klein molecuul protocol, behalve de specificiteit, is dat het goedkoop is en component factoren algemeen een langere houdbaarheid in vergelijking met medium dat cytokinen of groeifactoren. Als kleine moleculen in onze gerapporteerde protocol laag gewicht exact molecuulgewicht, die structureel en functioneel gedefinieerd en gemakkelijk diffunderen door het celmembraan 24,25.
Tot nu toe zijn verschillende methoden toegepast om hPSCs om robuuste, schaalbare differentiatie technieken stellen; De meeste van deze methoden zijn vastgesteld 2D en kleinschalige statische kweken, die een slechte schaalbaarheid en homogeniteit kunnen bieden. Technieken zoals gedwongen aggregatie, micro-printtechnologieën en micro-carrier culturen 26-29 komen nu in gebruik genomen, maar ondanks enkele vooruitgang op dit gebied, deze methoden zijn nog ver verwijderd van het verstrekken van het aantal cellen die nodig zijn voor het gebruik ervan in hoge -demand systemen. Limited of onbewezen reproduceerbaarheid en schaalbaarheid, en de hoge kosten als gevolg van de noodzaak voor dure media (mTeSR1 of StemPro-34) of micro-dragers voor zowel uitbreiding van hPSCs en hun gericht differentiatie naar cardiomyocytes 30,31, zijn de nadelen van het gebruik van deze methoden high throughput hPSCs technologieën.
In deze studie hebben wij een eenvoudig, robuust en schaalbaar protocol voor de productie van HPSC-afgeleide cardiomyocyten gerapporteerd. De reproduceerbaarheid van dit protocol is gevalideerd met meer dan 40 verschillende HPSC lijnen, de meest uitgebreide validatie gemeld to-date. Vergeleken met eerder gerapporteerde suspensie protocollen vertoont deze werkwijze grote voordelen wat betreft schaalbaarheid, reproduceerbaarheid, betaalbaarheid, doelmatigheid en functionaliteit van de cardiomyocyten gegenereerd. Het succes van onze differentiatie protocol zorgvuldig afhankelijk van de kwaliteit van de hPSCs voor studie. Daarom is het van cruciaal belang om karyotype elke lijn en de hoge en aanhoudende expressie van pluripotentie markers door immunokleuring en PCR voor aanvang van het experiment te controleren. In het bijzonder wanneer het kweken van de cellen in de bioreactor, is het cruciaal om hPSCs die B GebruikEen gepasseerd bij de enkele-celniveau ten minste drie passages voor het begin van differentiatie. In onze protocollen gebruikten we bolvormige deeltjes met een gemiddelde grootte van 175 ± 25 urn, die sferoïden gegenereerd na 5 dagen waren. De dag waarop de bolletjes aan deze omvang beperking kan variëren, afhankelijk van de groei van de individuele HPSC lijnen; daarom is het belangrijk dat de grootte, meer dan de dag van groei, in aanmerking wordt genomen.
Dit protocol kan ook worden gemanipuleerd geschikt voor gevoelige cellijnen en grote cohorten van HPSC lijnen te worden. Hoewel dit protocol leidt tot sterk verrijkt cardiomyocyten, kan de zuiverheid worden verbeterd door het combineren van de differentiatie protocol met een metabole selectiemethode zoals lactaat-verrijkte medium 32. Bovendien kunnen verbeteringen in de rijping en functionaliteit van de afgeleide cardiomyocyten als dit protocol beschreven door het genereren toegepast driedimensionale, uitgelijnd cardialeweefsels 33. Een van de beperkingen van dit protocol is dat bepaalde subtypes van cardiomyocyten niet specifiek gegenereerd, eenvoudig een mengsel van atriale ventriculaire nodale en cellen. Nader onderzoek op dit gebied is nodig om differentiatie protocollen die sterk verrijkt subtypes cardiomyocyten kan produceren in grootschalige ontwikkelen. Hoewel sommige kleinschalige protocollen toe ontwikkeld, zouden de werkwijzen moeten strikt worden getest om er zeker opschaling mogelijk 34.
Ontwikkeling van dergelijke geïntegreerde platforms kan worden beschouwd als een belangrijke stap naar de commercialisering van HPSC-afgeleide hartspiercellen technologieën voor de klinische, farmaceutische, tissue engineering, en in vitro orgel / ontwikkeling van toepassingen organoïde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De Victor Chang Cardiac Research Institute laat zich niet in, ook niet door de vingers, de vernietiging van menselijke embryo's voor onderzoek. Haar bijdrage aan dit onderzoek was beperkt om te werken aan de menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen.
De auteurs verklaren dat ze hebben geen concurrerende financiële belangen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Knockout DMEM | Life Technologies | 10829018 | |
| Knockout Serum Replacement (KO-SR) | Life Technologies | 10828028 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| MEM Non-essential Amino Acids | Life Technologies | 11140-050 | |
| β-Mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) | Miltenyi Biotec | 130-093-843 | |
| RPMI1640 | Life Technologies | 11875093 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Life Technologies | 14190144 | |
| DPBS | Life Technologies | 14287072 | |
| Attachment Factor (AF) | Life Technologies | S006100 | |
| ECM Gel | Sigma-Aldrich | E1270 | |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| DMEM | Life Technologies | 11965-092 | |
| Fatal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 16140-071 | |
| B27 minus insulin | Gibco | A18956-01 | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070063 | |
| 0.05% Trypsin/EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
| Collagenase Type IV | Life Technologies | 17140-019 | |
| Calcium Chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| Mitomycin C | Bioaustralis | BIA-M1183 | |
| CHIR99021 | Miltenyi Biotec | 130-104-172 | |
| IWP2 | Miltenyi Biotec | 130-105-335 | |
| SB431542 | Miltenyi Biotec | 130-095-561 | |
| Purmorphamine | Miltenyi Biotec | 130-104-465 | |
| ROCK inhibitor Y-27632 | Miltenyi Biotec | 130-104-169 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Poly Vinyl Alcohol (PVA) | Sigma-Aldrich | 363073 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Trypan Blue | Bio-Rad | 145-0013 | |
| Accumax | Innovative Cell Technologies Inc. | AM105 | |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2 | |
| CELLSPIN | Integra Biosciences | 183 001 | |
| Spinner flask with 1 pendulum, 100 ml | Integra Biosciences | 182 023 | |
| Mouse Embryonic Fibroblasts (MEF) | Prepared in-house (or commercially available) | ||
| Human pluripotent stem cell (hPSC) lines | Prepared in-house (or commercially available) |
References
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Carvajal-Vergara, X., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell-derived models of LEOPARD syndrome. Nature. 465, 808-812 (2010).
- Vitale, A. M., Wolvetang, E., Mackay-Sim, A. Induced pluripotent stem cells: a new technology to study human diseases. Int. J. Biochem. Cell Biol. 43, 843-846 (2011).
- Sharma, A., et al. Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes as an in vitro model for coxsackievirus B3-induced myocarditis and antiviral drug screening platform. Circ Res. 115, 556-566 (2014).
- Zimmer, B., et al. Evaluation of developmental toxicants and signaling pathways in a functional test based on the migration of human neural crest cells. Environ Health Perspect. 120, 1116-1122 (2012).
- Diecke, S., Jung, S. M., Lee, J., Ju, J. H. Recent technological updates and clinical applications of induced pluripotent stem cells. Korean J Intern Med. 29, 547-557 (2014).
- Kimbrel, E. A., Lanza, R. Current status of pluripotent stem cells: moving the first therapies to the clinic. Nat. Rev. Drug Discov. 14, 681-692 (2015).
- Kehat, I., et al. Human embryonic stem cells can differentiate into myocytes with structural and functional properties of cardiomyocytes. J Clin Invest. 108, 407-414 (2001).
- Mummery, C., et al. Differentiation of human embryonic stem cells to cardiomyocytes: role of coculture with visceral endoderm-like cells. Circulation. 107, 2733-2740 (2003).
- Laflamme, M. A., et al. Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts. Nat Biotechnol. 25, 1015-1024 (2007).
- Fonoudi, H., et al. ISL1 protein transduction promotes cardiomyocyte differentiation from human embryonic stem cells. PLoS One. 8, e55577 (2013).
- Zhu, W. Z., Hauch, K. D., Xu, C., Laflamme, M. A. Human embryonic stem cells and cardiac repair. Transplant Rev (Orlando). 23, 53-68 (2009).
- Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. (64), e3854 (2012).
- Stover, A. E., Schwartz, P. H. Adaptation of human pluripotent stem cells to feeder-free conditions in chemically defined medium with enzymatic single-cell passaging. Methods Mol Biol. 767, 137-146 (2011).
- Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc Natl Acad Sci. 109, E1848-E1857 (2012).
- Gonzalez, R., Lee, J. W., Schultz, P. G. Stepwise chemically induced cardiomyocyte specification of human embryonic stem cells. Angew Chem Int Ed Engl. 50, 11181-11185 (2011).
- Fonoudi, H., et al. A Universal and Robust Integrated Platform for the Scalable Production of Human Cardiomyocytes From Pluripotent Stem Cells. Stem Cells Transl Med. , (2015).
- Abbasalizadeh, S., Larijani, M. R., Samadian, A., Baharvand, H. Bioprocess development for mass production of size-controlled human pluripotent stem cell aggregates in stirred suspension bioreactor. Tissue Eng Part C Methods. 18, 831-851 (2012).
- Larijani, M. R., et al. Long-term maintenance of undifferentiated human embryonic and induced pluripotent stem cells in suspension. Stem Cells Devt. 20, 1911-1923 (2011).
- Baharvand, H., Larijani, M. R., Yousefi, M. Protocol for expansion of undifferentiated human embryonic and pluripotent stem cells in suspension. Methods Mol Biol. 873, 217-226 (2012).
- Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nat Methods. 11, 855-860 (2014).
- Minami, I., et al. A small molecule that promotes cardiac differentiation of human pluripotent stem cells under defined, cytokine- and xeno-free conditions. Cell reports. 2, 1448-1460 (2012).
- Buskirk, A. R., Liu, D. R. Creating small-molecule-dependent switches to modulate biological functions. Chem Bio. 12, 151-161 (2005).
- McKinsey, T. A., Kass, D. A. Small-molecule therapies for cardiac hypertrophy: moving beneath the cell surface. Nat Rev Drug Discov. 6, 617-635 (2007).
- Niebruegge, S., et al. Generation of human embryonic stem cell-derived mesoderm and cardiac cells using size-specified aggregates in an oxygen-controlled bioreactor. Biotechnol Bioeng. 102, 493-507 (2009).
- Bauwens, C. L., et al. Geometric control of cardiomyogenic induction in human pluripotent stem cells. Tissue Eng Part A. 17, 1901-1909 (2011).
- Hwang, Y. S., et al. Microwell-mediated control of embryoid body size regulates embryonic stem cell fate via differential expression of WNT5a and WNT11. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 16978-16983 (2009).
- Nguyen, D. C., et al. Microscale generation of cardiospheres promotes robust enrichment of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 3, 260-268 (2014).
- Kempf, H., et al. Controlling expansion and cardiomyogenic differentiation of human pluripotent stem cells in scalable suspension culture. Stem Cell Reports. 3, 1132-1146 (2014).
- Hemmi, N., et al. A massive suspension culture system with metabolic purification for human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cells Transl Med. 3, 1473-1483 (2014).
- Tohyama, S., et al. Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell stem cell. 12, 127-137 (2013).
- Nunes, S. S., et al. Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Nat meth. 10, 781-787 (2013).
- Devalla, H. D., et al. Atrial-like cardiomyocytes from human pluripotent stem cells are a robust preclinical model for assessing atrial-selective pharmacology. EMBO Mol Med. 7, 394-410 (2015).
