Abstract
研究、疾患モデル、薬学的および臨床的適用のためのヒト多能性幹細胞（hPSCs）の利益を最大化することは、心筋細胞を含む機能的細胞型の大規模生産のためのロバストな方法が必要となります。ここでは、時間的なWNTの操作、TGF-β、及びSHHシグナル伝達経路は、単一セルの高効率心筋細胞への分化につながるが、静的なサスペンションと撹拌した懸濁液のバイオリアクターシステムの両方にHPSCラインを継代することを示しています。この戦略を採用することで、一貫複数HPSCラインで検証文化の15日後に> 80％の心筋トロポニンT陽性細胞を含む、〜100％破っスフェロイドをもたらしました。我々はまた、現在、単一細胞継代に適合していない細胞株で使用するために、このプロトコルの変化について報告する、の成功は42 HPSCラインに検証されています。これらのプロトコルを使用して生成された心筋細胞は、系統特異的なマーカーおよびshow期待electrophysを表現しますiological機能。我々のプロトコルは、ヒト心筋細胞の大規模生産のために、単純、効率的かつ堅牢なプラットフォームを提供します。
Introduction
ヒト胚性幹細胞（hESC）と人工多能性幹細胞（hiPSCs）を含む、ヒト多能性幹細胞（hPSCs）は、自己再生三胚葉1,2の細胞に分化する能力の能力を有します。これらの特性に、hPSCsは、6,7-高スループットドラッグスクリーニングおよび毒性アッセイのために、潜在的に臨床応用8のために、生成およびヒト疾患3-5をモデル化するための疾患関連細胞型のスケーラブルな生産のための貴重かつ無制限のソースを提供します。 hPSCsからの心筋細胞の生成は、具体的に起因する適切な動物モデルの欠如および/または影響を受けた一次組織の可用性に、以前に私たちの能力の範囲を超えて、複雑な人間の心血管疾患とその可能な治療のメカニズムを調査する機会を提供します。
hPSCs n個の前述のアプリケーションのすべて高度に濃縮および機能心筋細胞の膨大な数の生産をecessitate。このように、複数のHPSCラインに適した、インビトロ心臓分化プロトコルで 、効率的で再現性と拡張性の可用性が重要です。従来の心筋細胞分化プロトコルは、胚様体形成9共培養技術10、サイトカイン11およびタンパク質導入方法12のカクテルでの誘導のような異なる戦略を採用しています。これらの技術の進歩にもかかわらず、ほとんどまだ、効率が悪い苦しむ高価な成長因子を必要とする、または複数のHPSC回線を使用しようとすると、限られた普遍性を提供します。現在までに、これらの課題は、創薬13のための動物モデルにおいて、ならびに製薬業界で細胞治療研究のためHPSC由来の心筋細胞の生産に制限を設定しています。そのため、大型のための堅牢で手頃な価格の技術の開発スケーラブルな培養系における機能性HPSC由来の心筋細胞の-scale生産は、主にその商業的および臨床応用を促進するであろう。
本稿では、我々は非常に大規模生産のための方法を含め、ソースおよび培養の様々な方法から生成されたヒトES細胞とhiPSCsに高い有効性、再現性、適用性と費用対効果の高い、統合心臓分化システムの開発を報告しますバイオリアクターを使用してHPSC由来の心筋細胞の濃縮集団。さらに、当社は、そのような新たに設立されたhiPSCsまたは疾患のメカニズムの解析に関連するHPSCラインの大コホートとして、自由および/または単一細胞培養をフィーダするようになっていないHPSCラインにこのプロトコルを最適化しました。
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Protocol
文化メディア、未分化hPSCsの細胞培養プレートのコーティングとメンテナンスの作製
- メディアの準備
注：4週間まで光から保護して4℃で0.22μmの濾過装置とストアを使用してメディアを滅菌します。試薬名、仕入先とカタログ番号は、 材料表に記載されています。- マウス胚線維芽細胞（MEF）中には、445ミリリットルのDMEM、50ミリリットルウシ胎児血清（FBS）と5ミリリットルの細胞培養培地（ 例えば 、グルタマックス）を組み合わせます。
- hESCの中には、390ミリリットルノックアウト-DMEM（KO-DMEM）、100ミリリットルノックアウト血清代替（KO-SR）、5ミリリットルの細胞培養培地、5ミリリットルMEM最小必須アミノ酸溶液および0.5ミリリットルの55mMβメルカプトエタノールを兼ね備えています。
注意：βメルカプトエタノールは有毒です。吸入、経口摂取および皮膚接触を避けてください。 - RPMI-B27（RB）中、475ミリリットルRPMI 1640を組み合わせて、10ミリリットルB27マイナスの場合インスリン5mlの細胞培養培地5mlのMEM、最小必須アミノ酸溶液を5 mlのペニシリン/ストレプトマイシン0.5mlの55mMのβメルカプトエタノール。
- 解離溶液（DS）で10 mlの0.05％トリプシンを4ml KO-SR、1 mlのコラゲナーゼタイプIV（1mg / mlの）5mlのKO-DMEM、20μLのCaCl 2（1 M）を組み合わせます。
- ミディアム馴化フィーダー細胞については、以前にマイトマイシンCのいずれかで、または照射して治療することによって不活性化されたコンFL uentフィーダー細胞（MEFまたはヒト包皮線維芽細胞）でT75フラスコに15ミリリットルを（bFGFを伴わない）のhESC培地を追加します。収穫は24時間後に馴化培地と新鮮なhESCの培地と交換してください。細胞は、2週間まで使用することができます。
- 細胞培養プレートのコーティング
- ECMジェルコーティング：
- それは、製造業者の指示に従って、均等に一貫性のある液体状態になるまでご購入後、4℃でECMゲル抽出を解凍。割合で希釈-20℃でのコールドKO-DMEM培地、アリコートとストア内の2：1の。
注：ECMゲルの調製の間、等分およびコーティング手順の寒さで使用するために必要なすべての材料を保ちます。 ECMゲルの濃度は、バッチ番号に応じて変化します。濃度は一定分量に記されていることを確認します。アリコートは、最大6ヶ月間-20℃で保存することができます。 - 4℃でのECMゲルアリコートを解凍します。解凍すると、0.34ミリグラム/ mlの最終濃度のためにコールドKO-DMEM培地を追加します。ピペットウェルおよび6ウェルプレートの1ウェルあたり0.75ミリリットルを追加します。 37℃で1時間インキュベートします。
- それは、製造業者の指示に従って、均等に一貫性のある液体状態になるまでご購入後、4℃でECMゲル抽出を解凍。割合で希釈-20℃でのコールドKO-DMEM培地、アリコートとストア内の2：1の。
- 有糸分裂不活性化されたマウス胚線維芽細胞フィーダー細胞（MEF）コーティング
注：MEFフィーダー細胞の調製は、以前に記載されている14。- コート接着因子（AF）または5分間、室温で0.1％ゼラチン（ステップ1.2.3を参照）（6ウェルプレートの1ウェル0.75 ml）で6ウェル細胞培養プレート。削除し、乾燥するバイオセーフティキャビネット（BSC）でプレートを残します。
- 3分 - 約2、37℃の水浴に凍結バイアルを転送することによってMEFを解凍。
- 15ミリリットルチューブに7ミリリットルをMEF培地を追加します。細胞のバイアルを解凍したとき、徐々に15mlチューブにコンテンツを転送します。 4分間300×gで遠心分離します。上清を吸引除去し、MEF培地中で細胞を再懸濁します。
- 細胞をカウントし、6ウェルプレート（〜1.7×10 5細胞/ウェル）あたり1×10 6細胞をプレー。 37℃/ 5％CO 2インキュベーターに移し、細胞がO / N使用前に添付することができます。
- ゼラチンコーティング：
- 溶液（w / v）の0.1％を作るために超純水にゼラチン粉末1gを溶解します。その後、15分間121℃で溶液をオートクレーブを37℃で15分間インキュベートします。冷却すると、ウェルの必要数（6ウェルプレートの1ウェル0.75 ml）のに追加し、37℃で15分間インキュベートします。
- 溶液（w / v）の0.1％を作るために超純水にゼラチン粉末1gを溶解します。その後、15分間121℃で溶液をオートクレーブを37℃で15分間インキュベートします。冷却すると、ウェルの必要数（6ウェルプレートの1ウェル0.75 ml）のに追加し、37℃で15分間インキュベートします。
- ラミニンコーティング：
- 解凍されるまで4℃でラミニン（1mg / ml）を解凍します。ラミニン溶液5μlに、冷PBSの1ミリリットルを追加します。ピペットをよくして、ウェルの必要な数（6ウェルプレートの1ウェルあたり0.75ミリリットル）に加え、37℃で1時間インキュベートします。
- スピナーフラスコの内部表面のシリコンコーティング：
- 徹底的にほこりおよび/または培養残留物を除去するためのクリーニングブラシを使用して、蒸留水（1ガラス振り子を有する）、100mLのスピナーフラスコを洗浄します。 70％エタノールを用いて、蒸留水で30分間リンスした後、充填します。 5 MのNaOHを追加し、O / Nを残します。
- NaOH溶液を外し、5分間流水でフラスコをすすぎます。 1 M HClでフラスコを記入し、15分間放置します。完全に二重蒸留水で2回、その後、5分間流水でフラスコを洗います塩酸の痕跡を削除します。 BSCで完全に乾燥さフラスコを残します。
- フラスコにシリ溶液1.5mlを加え、全ての面をカバーするために水平方向に回転させます。ガラス振り子のために同じ手順を繰り返します。
- 1時間100℃の乾燥オーブンでコーティングされたフラスコを加熱したり、室温でO / Nを乾燥させます。 60分 - オーブンで加熱した場合、30を室温まで冷却しておきます。
- 、15分間ずつフラスコに脱イオン水で3回すすぎ、その後20分間121℃でオートクレーブで滅菌します。
- ECMジェルコーティング：
- 未分化hPSCsのメンテナンス
注：特に記載のない限り、記載されたプロトコルの各々は、細胞が増殖し、6ウェル培養プレートおよびボリュームのウェルで培養される場合、この形式に適して説明します。- 静的なサスペンションシステムにおける未分化のスフェロイドとして培養hPSCs
注：これらの手順で使用した細胞は、すでにに適合させる必要があります単一細胞培養。15- 80％の密集度 - hPSCsを約6ウェル培養プレートにECMゲル70を培養して実験を開始します。 BSCに実体顕微鏡を用いて、任意の差別化コロニーを削除します。 10μMのROCK阻害剤Y-27632を追加し、37℃で1時間インキュベートします。
注：差別コロニーを除去するため、デタッチするピペットチップを使用し、軽く実体顕微鏡下で手動ですべての差別化部分を削除。未分化コロニーを削除しないように注意してください。 - インキュベーターと吸引培地から細胞を取り出します。 1mlのPBSで細胞を洗浄し、0.5ミリリットルの細胞解離酵素を除去し、追加します。 37℃で5分間 - 4のための細胞をインキュベートします。
- 1ミリリットルのhESC培地を追加し、セルスクレーパーを用いて細胞を収穫。 p1,000ピペットを用いて単一細胞に細胞を解離します。トリパンブルーと血球計数器を使用して生細胞を数えます。
- 2×10 5実行可能なCに細胞を再懸濁しフィーダー細胞馴化培地中ells / mlのは、100ng / mlのbFGFおよび10μMのROCK阻害剤Y-27632を補いました。 5mLのピペット（6ウェルプレートのウェルあたり3 ml）を用いて、超低付着プレートに細胞を移します。
- 2日後、慎重に培地（約1.5ミリリットル）のインキュベーターと吸引半分から細胞を除去します。 100ng / mlのbFGFを添加新鮮馴化培地と交換してください。
- 5日目に今まで100ng / mlのbFGFを添加馴化培地、いずれかのさらなる培養細胞、継続的な未分化培養のための通路（ステップ1.3.1.2 - 5）で毎日培地の半分を変更し、または心臓分化（第2節で使用）。継続的な文化であれば、継代細胞ごとに4から8日間。
- 80％の密集度 - hPSCsを約6ウェル培養プレートにECMゲル70を培養して実験を開始します。 BSCに実体顕微鏡を用いて、任意の差別化コロニーを削除します。 10μMのROCK阻害剤Y-27632を追加し、37℃で1時間インキュベートします。
- フィーダー細胞上で培養し、コラゲナーゼIV型を使用して継代hPSCs
- hPSCsを継代する前に、BSCに実体顕微鏡を用いて、任意の差別化コロニーを削除します。培地を吸引し、1ミリリットルで細胞を洗浄ウェルあたりPBS。 0.75 mlのコラゲナーゼタイプIV（1mg / ml）を添加し、5 37℃でインキュベート取り除く - 剥離し始め、コロニーの縁部を有することが必要とされる、15分。
- 吸引しコラゲナーゼとは、ウェル当たりのhESC培地の1ミリリットルを追加します。 15ミリリットルチューブにp1,000ピペットを用いて細胞を転送した後、セルスクレーパーを使用して、小さなクラスターにコロニーを切り離します。小片にクラスタを壊さないように注意してください。
- 残りの細胞を回収し、15mlチューブに追加するだけでなく1ミリリットルでのhESC培地を洗ってください。 2分間100×gで遠心分離します。 100ng / mlのbFGFを添加したhESC培地中の上清と再懸濁細胞を吸引します。
- インキュベーターからMEFコーティングされたプレートを外し、MEF培地を吸引除去します。必要に応じて、3と1：10：1の比率で細胞を転送します。 100ng / mlのbFGFを添加新鮮なhESCの培地で培地を毎日変更します。継代細胞ごとに4から8日間。
- 静的なサスペンションシステムにおける未分化のスフェロイドとして培養hPSCs
2. Differenti静的なサスペンションシステムにおけるスフェロイドとしてhPSCsのエーション
- 第1.3.1項で調製した5日目の未分化スフェロイドを用いた実験を開始します。
注：この段階では、スフェロイドの平均サイズは175±25μmであるべきです。分化実験を開始するときに50スフェロイドの最小値を使用する必要があります。 - 5mLのピペットを用いて15mlチューブに移すスフェロイド。残りのスフェロイドを収集し、同じ15ミリリットルチューブに追加するだけでなく1ミリリットルとRB培地を洗ってください。スフェロイドは、（遠心分離しないでください）緩いペレットを形成するために沈降するまで5分間細胞を残します。任意のスフェロイドを取るないように注意しながら、上清を吸引除去します。
- 3ミリリットルを12μMCHIR99021を補充したRB培地を追加します。バック6ウェル超低接着プレートの1ウェルに細胞を転送します。 24時間後、ステップ2.2を繰り返します。
注：RB媒体は光に敏感です。 RB培地で作業する場合、BSCライトがオフに切り替えておきます。 - Addの3ミリリットルの細胞ペレットにRB培地。バック6ウェル超低接着プレートの1ウェルに細胞を転送します。 24時間後、ステップ2.2を繰り返します。
- （各5μM）をIWP2、purmorphamineおよびSB431542を補充し3ミリリットルRB培地を追加します。バック6ウェル超低接着プレートの1ウェルに細胞を転送します。 2日後、ステップ2.2を繰り返します。
- RB培地3ml中で細胞を再懸濁し、細胞が付着することを可能にするために、ゼラチンコートプレートに移します。
注：この段階で、細胞は、懸濁液中に維持することができます。静的懸濁培養を続ける超低付着プレートに戻って細胞を転送するためです。 - 2日後に3ミリリットルRB媒体とのメディアを変更します。培養物は、次の日にビートを開始します。 RB培地で4日間 - すべての3培地を変更します。
攪拌した懸濁液のバイオリアクターにおけるスフェロイドとしてhPSCsの3分化
- 未分化のスフェロイド培養物を実験を開始少なくとも3継代のための静的な懸濁液中のD（第1.3.1項を参照してください）。 10μMのROCK阻害剤Y-27632を追加し、37℃で1時間インキュベートします。
- インキュベーターから細胞を取り出して、5ミリリットルピペットを用いて15ミリリットルチューブにすべてのスフェロイドを移します。残りのスフェロイドを収集し、同じ15ミリリットルチューブに追加するだけでなく1ミリリットルでのhESC培地を洗ってください。スフェロイドは、（遠心分離しないでください）緩いペレットを形成するために沈降するまで5分間細胞を残します。任意のスフェロイドを取るないように注意しながら、上清を吸引除去します。
- 1mlのPBSを加えることによって、細胞を洗浄。スフェロイドは、（遠心分離しないでください）緩いペレットを形成するために沈降するまで5分間のままにしておきます。上清を除去し、0.5ミリリットル0.05％トリプシンプラス0.53 mMのEDTAを追加します。 37℃で5分間 - 4のための細胞をインキュベートします。
- インキュベーターから細胞を取り出して、1ミリリットルにヒトES細胞培地を追加します。 p1,000ピペットを用いて、トリパンブルーと血球計数器を用いて細胞をカウントし、単一細胞に細胞を解離します。 2×10 5 viabに再懸濁100ng / mlのbFGFおよび10μMのROCK阻害剤Y-27632を補足した馴化培地中のル細胞/ ml。
- 1振り子付きシリコン処理バイオリアクターフラスコに細胞懸濁液の100ミリリットルを転送する（1.2.5項を参照してください）。 35 rpmで攪拌とし、40rpmで24時間の増加の後に起動します。
- すべてのスフェロイドがフラスコの底に沈殿するまで10分 - 48時間後、5攪拌を停止します。 100ng / mlのbFGFを添加馴化培地で培地の半分を交換してください。 5日目まで同じプロセスごとに24時間を繰り返します。
注：この段階では、ミクロンを形成すべきである175±25の平均サイズを有する未分化スフェロイド。 - すべてのスフェロイドがフラスコの底に沈殿するまで10分 - 5攪拌を停止します。メディアの最小量（未満50ミリリットル）で50mlチューブにすべてのスフェロイドを転送します。慎重に何のスフェロイドを容器内に残っていません確実に、バイオリアクターフラスコ内の残りの媒体を廃棄してください。
- LEAVeは5のために - すべてのスフェロイドが50ミリリットルチューブの底に落ち着くまで、10分後、慎重に緩い細胞ペレットを中断することなく、上清を除去します。すべてのスフェロイドが再び緩いペレットを形成するために50ミリリットルチューブの底に落ち着くまで10分 - その後5のために再度残し、カルシウム、マグネシウムまたはRB培地で25ミリリットルのPBSで洗浄します。
- 上清を慎重に除去し、40ミリリットルを12μMCHIR99021、10μMのROCK阻害剤と0.1％のポリビニルアルコール（PVA）を補充したRB培地を追加します。スフェロイドを再懸濁し、バイオリアクターフラスコに戻ってすべてのセルを転送します。総容量100ミリリットルを作るためにメディアを追加します。 24時間40rpmで攪拌を再起動します。
注：RB媒体は光に敏感です。 RB培地で作業する場合のモードをオフに光の中でBSCを保ちます。 - 3.8 - 手順に3.7を繰り返します。
- 上清を慎重に除去し、培地を0.1％のPVAを補った40ミリリットルRBを追加します。スフェロイドを再懸濁し、トンに戻ってすべてのセルを転送彼は、フラスコをバイオリアクター。総容量100ミリリットルを作るためにメディアを追加します。 24時間40rpmで攪拌を再起動します。
- 3.8 - 手順に3.7を繰り返します。
- 上清を慎重に除去し、40ミリリットルをIWP2、purmorphamineおよびSB431542（5μMずつ）を補充したRB培地を追加します。スフェロイドを再懸濁し、バイオリアクターフラスコに戻ってすべてのセルを転送します。総容量100ミリリットルを作るためにメディアを追加します。 2日間40rpmで攪拌を再起動します。
- 繰り返しは、3.7から3.8までをステップ実行します。
- 上清を慎重に除去し、唯一の40ミリリットルにRB培地を追加します。スフェロイドを再懸濁し、バイオリアクターフラスコに戻ってすべてのセルを転送します。総容量100ミリリットルを作るためにメディアを追加します。 40 rpmで攪拌を再起動します。 72時間後 - 打つスフェロイドが48観察されるはずです。
- すべてのスフェロイドを容器の底に沈殿するまで10分 - 唯一の5のために攪拌を停止することにより、RB培地で4日間 - すべての3培地の半分を変更します。慎重にスフェロイドとcarefを乱すことなく培地50mlを削除ully新鮮RB培地50mlと交換してください。
単一細胞継代するようになっていない文化を使用したhPSCs 4.分化
注：このアプローチは、単一の細胞培養技術、非常に労働集約的で時間のかかるプロセスに適応することなく、HPSCラインの数が多いの高速分化に特に有用です。この技術は、新設HPSC線などの酵素細胞解離に非常に敏感である細胞株に適用可能です。
- 80％コンフルエント - 約70である（セクション1.3.2のように）MEF上で培養hPSCsで実験を開始します。 BSCに実体顕微鏡を用いて、任意の差別化コロニーを削除します。
- 培地を除去し、0.5ミリリットル解離溶液（DS）を追加します。 MEF細胞は切り上げており、hPSCsのコロニーのエッジが明確になるまで1分 - 0.5インキュベートします。すぐにDSを削除0.75 mlのコラゲナーゼタイプIV（1mg / ml）を加えます。
- インキュベート37℃で15分 - 5のための細胞。インキュベーション期間中顕微鏡下で細胞を確認し、全体のコロニーをリフトオフと切り離し、コラゲナーゼを除去し、1.5ミリリットルにヒトES細胞培地を追加し始めているとき。
15分後にコロニーのほとんどがまだ接続されている場合、バックインキュベーターにセルを置く：注意してください 。顕微鏡下で細胞を5分ごとに確認してください。 30分以上コラゲナーゼで細胞を残すしないように注意してください。コラゲナーゼ溶液中で、多くの浮遊コロニーがある場合は、コラゲナーゼを削除しないでください。ちょうど1ミリリットルのhESC媒体を追加します。 - 全体コロニーとして分離するために穏やかにピペットコロニー、p1,000ピペットを使用。小片にコロニーを破壊しないでください。 5mLのピペットを用いて15mlチューブに細胞を移します。同じチューブに追加し、残りの細胞を収集するために、1ミリリットルのhESC培地でよく洗浄します。すべてのコロニーが沈降するまで（遠心分離しないでください）5分間のままにしておきます。
- 上清を慎重に除去し、2ミリリットルにhESCのメディを追加ええと100ng / mlのbFGFを添加。 5mLのピペット（24ウェルプレートの各ウェルに1 mlで6ウェルプレートの各ウェルへの3 ml）を用いて、超低付着プレートに細胞を移します。少なくとも6時間（12時間の最大値）を37℃/ 5％CO 2でインキュベートします。
- この間、ステップ4.7のためのラミニン被覆ウェル/プレートの必要な数を用意。推奨セル転送率を24ウェルプレート（または表面積あたりの当量）の2ウェルに6ウェルプレートの1コンフルエントよくあります。
- 6時間後、注意深く5mLのピペットを用いて15mlチューブにコロニー凝集を転送します。残りの凝集体を収集し、同じ15ミリリットルチューブ（24ウェル用のウェルあたり0.5ミリリットルと6ウェルプレートウェル当たり1ミリリットル）に追加するRB培地でプレートを洗浄します。凝集体が沈降するまで5分待ってから、慎重に上清を吸引除去します。緩いペレットを乱さないように注意してください。
- 2ミリリットルRB培地を12μMのCHIR99021を補充し、慎重に移す追加します（セクション1.2.4のように）あなたの予め調製ラミニンコーティングされたウェルに5ミリリットルピペットで細胞が付着することを可能にします。
- 24時間後、慎重に各ウェル中の培地を除去し、1ミリリットルにRB培地のみを追加します。
注：凝集物の一部は、培養プレートに非常に弱く付着しています。そのためには、培地交換手順中に緩んで来ている可能性があります任意の大きな凝集体を除去しないことが重要です。これは、できるだけ小細胞破片のできるだけ多くを除去することが重要です。 - 24時間後、慎重に培地を除去し、IWP2、purmorphamineおよびSB431542（5μMずつ）を補充したRB培地を追加します。
- 唯一のRB培地で2日後に培地を変更してください。細胞は翌日ビートを開始します。
- 唯一のRB培地で4日間 - すべての3培地を変更します。
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Representative Results
hPSCsからの心筋細胞の大規模な分化のための簡単な方法を確立するために、我々は16、その後WNTの阻害剤と細胞はWNT /βカテニン活性化因子（CHIR99021）で最初に処理されたプロトコルを作成/β-カテニンおよびトランスフォーミング増殖因子β（TGF-β）経路（IWP2 16およびSB431542 17、それぞれ）とソニックヘッジホッグ（SHH）経路（purmorphamine）の最後に活性化因子17（ 図1A）。我々の差別化戦略では、スフェロイド（175±25μmのスフェロイドの直径寸法）の約50％が、このプロトコルを使用して、興味深いことに、10日目100％に増加し、分化の開始後7日に、拍動開始し、分化したスフェロイドが観察されています分化開始の18日から60日まで暴行を続行します。解離したスフェロイド上の集団研究フローサイトメトリーによって調べた細胞の12％未満では、平滑筋および内皮マーカー（3.1％フォンWillibrand因子のための陽性であった15日目で、人口の90％以上が、心臓トロポニンT陽性（cTnTの+）細胞を含んでいたことを明らかにしました（vWFを+）、8.4％のα平滑筋アクチン陽性（ASMA +））18。現在までに、静的なサスペンション分化プロトコルが異なるHPSCライン（ 図1B）の中で、このプロトコルの高い再現性を示し、各ラインからのスフェロイドを破っての約90％が得られる出力と、5のhESCおよび4 hiPSCライン上でテストされています。
ヒト心筋細胞の大規模生産のための統合プラットフォームを開発するために、我々は、撹拌懸濁バイオリアクター（ 図2A）に私達の静的懸濁液差別化戦略を適用しました。差別スフェロイドは、バイオリアクター（e）に似た挙動を示しました静的システム（ 図2B）およびスフェロイドのほぼ100％が10日18時暴行されることが観察されたようnvironment。免疫染色cTnTの心臓転写因子NKX2-5に対する抗体を用いて、30日目で収集されたスフェロイドを破ってのセクションでは、示されましたそれぞれ細胞質およびこれらのタンパク質の核発現、（ 図2C）。分化培養の15日後に作業容積100ミリリットル、100万個の細胞 - ダイナミック懸濁培養中の細胞の総収量は約90でした。単一細胞としてhPSCsの拡大期に接種2000万出発hPSCsから - これがそうであることで、心筋細胞の収率は約54から90000000細胞（90％分化有効性観察60で）に達することができます。我々は、さらに、単一細胞パッチクランプ法を用いて分化した心筋細胞の電気生理学的特性を調べました。バイオリアクター培養物からスフェロイドをした暴行全細胞パッチクランプ法を用いて、代表的な細胞に記録日30と作用電位で単一細胞に解離。データは、単一のセル18の集団における三つの主要な心臓細胞型（atrial-、nodal-心室様細胞）の存在を示しました。
上記2分化の技術については、hPSCsは、フィーダーフリーおよび/ または単一細胞懸濁培養19-21に適合させる必要があります。一部HPSC線しかし、酵素的細胞解離に非常に敏感であり、そのような新たに確立されたhiPSC系統で観察することができるように解離した後に有意な細胞生存率の損失を示します。さらに、大規模なフィーダーなしに、すべてを適応ラインのコホート、および単一細胞培養で作業する場合は、非常に労働集約的で、時間がかかるだろう。これらの問題に対処するために、未分化スフェロイドは未分化細胞の凝集体（ 図3A）で置換しました。我々のデータは、この修正された技術を使用して、拍動クラスターは7日間、分化開始後に出現することを示します。この修正版の再現性を試験したすべての行が（ 図3B）を行っ各実験のために15日、平均60％以上のcTnT +細胞上に生成された42 hiPSCラインを、使用して確認しました。解離拍動クラスターにcTnTのとNKX2-5に対する抗体を用いて免疫染色する（ 図3C）は、それぞれ、細胞質および核の発現を示しました。
図 1。 静的サスペンション及び代表的なデータでhPSCsから心筋細胞分化の概略 。静的なサスペンションシステムにおける心筋細胞へのhPSCsの分化（A）実験デザイン。の効率の（B）の評価心臓分化を拍動スフェロイド（％）の数を数えることによって測定されます。 5ヒトES細胞と4 hiPSCライン18のそれぞれから少なくとも3分化実験の平均値は、ここに示されています。すべての行からスフェロイドを破っての全体平均は約90％です。エラーバーはSDを表す（n = 3）であった。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
ダイナミックサスペンションシステムにおける心筋細胞へのhPSCsの分化の図 2。 心筋細胞分化の全体概略ダイナミックサスペンションと代表的なデータでhPSCsから 。（A）実験計画。 RI：ROCK阻害剤（B）5日目スフェロイドの位相コントラスト画像（代表的なRロワイヤンH5のhESCラインからesult）。 NKX2.5およびcTnTのために30日目に切断したhESC由来の拍動スフェロイドのスケールバーは200μm（C）免疫染色。スケールバーは100μm。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図 3。単一細胞継代するようになっていない文化を使用してhPSCsから心筋細胞分化の全体概略。 （A）単一細胞継代に適合していない培養を用いて心筋細胞へのhPSCsの分化の実験的なデザイン。（B）は、解離した凝集体のフローサイトメトリー分析42で60％以上のcTnT +細胞がhiPSCラインをテストし、平均して表示しています。解離の（C）免疫染色心筋細胞由来NKX2.5およびcTnTの（646から4 hiPSCラインからの代表的な結果）のためのhiPSCs。スケールバーは20μm。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
hPSCs由来の心筋細胞は、非常に魅力的なヒト疾患モデルで使用するためのソース、薬物スクリーニング/毒性試験と、おそらく将来的には、再生治療です。しかしながら、これらの細胞を使用する主なハードルの一つは、その効果的な使用のために十分に高品質の材料を提供する能力です。私たちの記載されているプロトコルを使用して、我々は、この限界を克服する方法を提供しています。
最近、心臓に関与する特定のシグナル伝達経路を標的とする合成小分子は、心臓分化の16,17,22,23を強化するために記載されています。これらは、現在、多くの未定義の因子を含む、バッチ変動を示し、組換えサイトカインおよび血清の代替として使用されています。その特異性以外の小分子のプロトコルの主な利点は、それが安価であり、成分の要因は、一般的に、サイトカインまたは増殖因子を含む培地と比較して長期貯蔵寿命を有することです。我々の報告プロトコールで使用する小分子は、低分子量の薬剤があるので、それらは、構造的および機能的に定義され、細胞膜24,25を介して容易に拡散することができます。
これまでに、別の方法は堅牢でスケーラブルな分化手法を確立するためにhPSCsに適用されています。しかし、これらの方法のほとんどは貧しい拡張性と均一性を提供することができる2Dおよび小規模静的な文化として確立されています。このような強制的な凝集、マイクロプリンティング技術とマイクロキャリア培養物26-29のような技術は、現在使用されつつあるが、この分野でいくつかの進歩にもかかわらず、これらの方法は高での使用のために必要な細胞数を提供するから遠くまだ-demandシステム。 Limitedまたは証明されていない再現性とスケーラビリティ、およびhPSCsの拡大と、cへの向かう分化の両方のための高い高価なメディアの必要性に起因するコスト（mTeSR1またはStemPro-34）またはマイクロキャリアardiomyocytes 30,31は 、ハイスループットhPSCs技術のこれらの方法を用いての欠点です。
本研究では、HPSC由来の心筋細胞の産生のための、単純で堅牢でスケーラブルなプロトコルを報告しています。このプロトコルの再現性は、最も広範な検証はこれまでに報告された、40種類以上のHPSCラインで検証されています。以前に報告されたサスペンション・プロトコルと比較すると、この方法は、生成された心筋の拡張性、再現性、低価格、有効性および機能性の点で大きな利点を示します。私たちの分化プロトコルの成功は、研究のために使用hPSCsの高品質に徹底的に依存しています。そのため、実験を開始する前に、免疫染色およびPCRにより、各ラインの核型および多能性マーカーの高いかつ持続的な発現を確認することが重要です。バイオリアクター中で細胞を培養する場合、特に、Bを持つhPSCsを使用することが重要ですEENは、分化の開始前に少なくとも3継代のために、単一細胞レベルで継代しました。我々のプロトコルでは、5日後に生成されたスフェロイドた175±25μmの平均サイズ、とのスフェロイドを使用しています。スフェロイドは、このサイズ制限を満たす日個々HPSC株の成長速度に応じて変化し得ます。したがって、大きさ、成長の日以上が、考慮されることが重要です。
このプロトコルは、感受性細胞株及びHPSC線の大コホート適しになるように操作することができます。高度に濃縮された心筋細胞におけるこのプロトコルの結果が、純度は、乳酸塩に富む媒体32などの代謝選択方法で分化プロトコルを組み合わせることによって改善することができます。さらに、このプロトコルに記載由来心筋細胞の成熟及び機能性の向上は、三次元整列心臓の発生によって適用することができます組織33。このプロトコルの制限の一つは、心筋細胞の特定のサブタイプは、具体的には、心房、心室及び結節細胞の単純混合物が生成されないことです。この分野でのさらなる調査は、大規模で高度に濃縮されたサブタイプ特異的心筋細胞を生成することができます分化プロトコルを開発するために必要とされます。いくつかの小規模なプロトコルがこれまでに開発されているが、この方法は、厳密にスケールアップは34可能であることを確認するためにテストされる必要があります。
このような統合プラットフォームの開発はHPSC由来の臨床、医薬品のための心筋細胞技術、組織工学、およびin vitro臓器/オルガノイド開発アプリケーションでの実用化に向けた重要なステップと考えることができます。
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Disclosures
ビクター・チャン心臓研究所で従事しておらず、研究のためのヒト胚の破壊を容認しません。本研究への寄与は、ヒト人工多能性幹細胞上で動作するように制限されました。
著者は、彼らが競合する金融利害関係を持たない宣言します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Knockout DMEM | Life Technologies | 10829018 | |
| Knockout Serum Replacement (KO-SR) | Life Technologies | 10828028 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| MEM Non-essential Amino Acids | Life Technologies | 11140-050 | |
| β-Mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) | Miltenyi Biotec | 130-093-843 | |
| RPMI1640 | Life Technologies | 11875093 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Life Technologies | 14190144 | |
| DPBS | Life Technologies | 14287072 | |
| Attachment Factor (AF) | Life Technologies | S006100 | |
| ECM Gel | Sigma-Aldrich | E1270 | |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| DMEM | Life Technologies | 11965-092 | |
| Fatal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 16140-071 | |
| B27 minus insulin | Gibco | A18956-01 | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070063 | |
| 0.05% Trypsin/EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
| Collagenase Type IV | Life Technologies | 17140-019 | |
| Calcium Chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| Mitomycin C | Bioaustralis | BIA-M1183 | |
| CHIR99021 | Miltenyi Biotec | 130-104-172 | |
| IWP2 | Miltenyi Biotec | 130-105-335 | |
| SB431542 | Miltenyi Biotec | 130-095-561 | |
| Purmorphamine | Miltenyi Biotec | 130-104-465 | |
| ROCK inhibitor Y-27632 | Miltenyi Biotec | 130-104-169 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Poly Vinyl Alcohol (PVA) | Sigma-Aldrich | 363073 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Trypan Blue | Bio-Rad | 145-0013 | |
| Accumax | Innovative Cell Technologies Inc. | AM105 | |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2 | |
| CELLSPIN | Integra Biosciences | 183 001 | |
| Spinner flask with 1 pendulum, 100 ml | Integra Biosciences | 182 023 | |
| Mouse Embryonic Fibroblasts (MEF) | Prepared in-house (or commercially available) | ||
| Human pluripotent stem cell (hPSC) lines | Prepared in-house (or commercially available) |
References
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