Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Storskala produksjon av cardiomyocytes fra Menneskelig Pluripotent stamceller ved hjelp av en meget reproduserbar lite molekyl-Based Differensiering Protocol

Published: July 25, 2016 doi: 10.3791/54276
Automatic Translation
*1,2,3,8, *1,8, 1, 6,7, 1, 6,7, 2,3,4, *2,3, *1,5
1Department of Stem Cells and Developmental Biology, Cell Science Research Center, Royan Institute for Stem Cell Biology and Technology, ACECR, 2Developmental and Stem Cell Biology Division, Victor Chang Cardiac Research Institute, 3St. Vincent´s Clinical School, Faculty of Medicine, University of New South Wales, 4School of Biotechnology and Biomolecular Sciences, University of New South Wales, 5Department of Developmental Biology, University of Science and Culture, 6Heart Centre for Children, The Children´s Hospital at Westmead, 7Sydney Medical School, University of Sydney, 8Department of Developmental Biology, University of Science and Culture, Tehran, Iran
* These authors contributed equally

Abstract

Maksimere nytten av menneskelige pluripotente stamceller (hPSCs) for forskning, sykdom modellering, farmasøytiske og kliniske applikasjoner krever robuste metoder for storskala produksjon av funksjonelle celletyper, inkludert cardiomyocytes. Her viser vi at den temporale manipulering av WNT, TGF-β, og SHH signalveier som fører til svært effektiv kardiomyocytt differensiering av enkelt-celle passert hPSC linjer i både statisk og suspensjonen omrørt suspensjon bioreaktorsystemer. Denne strategien resultert i ~ 100% slå kuler, konsekvent inneholder> 80% cardiac troponin T-positive celler etter 15 dager med kultur, validerte i flere hPSC linjer. Vi rapporterer også om en variant av denne protokollen for bruk med cellelinjer for øyeblikket ikke tilpasset encellet aging, suksessen som har blitt bekreftet i 42 hPSC linjer. Cardiomyocytes generert ved hjelp av disse protokollene uttrykke avstamning-spesifikke markører og viser forventet electrophysiological funksjonalitet. Vår protokoll presenterer en enkel, effektiv og robust plattform for storskala produksjon av menneskelige cardiomyocytes.

Introduction

Menneskelige pluripotente stamceller (hPSCs), inkludert humane embryonale stamceller (hESCs) og induserte pluripotente stamceller (hiPSCs), har evne til selvfornyelse og evnen til å differensiere i celler av de tre embryonale bakterie lag 1,2. På grunn av disse egenskaper, hPSCs tilveiebringe en verdifull og ubegrenset kilde for generering og skalerbar produksjon av sykdomsrelevant celletyper for å modellere human sykdom 3-5, for high-throughput screening medikament og toksisitetsanalyser 6,7 og potensielt for kliniske anvendelser 8 . Generering av kardiomyocytter fra hPSCs gir anledning til spesifikt å undersøke mekanismer for komplekse humane kardiovaskulære sykdommer og deres mulige behandlinger, som tidligere utenfor omfanget av de muligheter på grunn av mangel på relevante dyremodeller og / eller tilgjengeligheten av berørte primære vev.

Alle de ovennevnte anvendelser av hPSCs necessitate produksjon av massive antall høyanriket og funksjonelle cardiomyocytes. Dermed en effektiv, reproduserbar og skalerbar in vitro hjertestans differensiering protokoll egnet for flere hPSC linjer er tilgjengeligheten av avgjørende. Konvensjonelle kardiomyocytt differensiering protokoller har ansatt ulike strategier som embryoid kroppen formasjon 9, co-kultur teknikker 10, induksjon med cocktails av cytokiner 11 og protein overføringsmetoder 12. Til tross for fremskritt i disse teknikkene, de fleste fortsatt lider av dårlig effektivitet, krever dyre vekstfaktorer, eller tilby begrenset universalitet når du forsøker å bruke flere hPSC linjer. Hittil har disse utfordringene setter grenser for produksjon av hPSC-avledet cardiomyocytes for celleterapi studier i dyremodeller, samt i den farmasøytiske industrien for legemiddelforskning 13. Derfor er utviklingen av robuste og rimelige teknikker for stor-skala produksjon av funksjonelle hPSC-avledet cardiomyocytes i skalerbare kultur-systemer vil i stor grad legge til rette for sine kommersielle og kliniske applikasjoner.

I dette manuskriptet, rapporterer vi å utvikle en kostnadseffektiv og integrert kardial differensiering system med høy effektivitet, reproduserbarhet og anvendbarhet til hESCs og hiPSCs generert fra en rekke kilder og kulturmetoder, herunder en fremgangsmåte for storskala produksjon av høyt anrikede populasjoner av hPSC-avledet cardiomyocytes med en bioreaktor. I tillegg har vi optimalisert denne protokollen for hPSC linjer ikke er tilpasset mater fri og / eller enkeltcellekultur, for eksempel nyetablerte hiPSCs eller store årskull av hPSC linjer som er relevante for analyse av sykdom mekanisme.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Utarbeidelse av Culture Media, Belegg av cellekultur plater og vedlikehold av udifferensierte hPSCs

  1. Media Forberedelse
    Merk: Steriliser media ved hjelp av en 0,22 mikrometer filtrerings enheten og oppbevar ved 4 ° C beskyttet mot lys i opptil fire uker. Reagensnavn, leverandører og katalognumre oppført i Materials tabell.
    1. For Muse embryonale fibroblaster (MEF) Medium, kombinere 445 ml DMEM, 50 ml Fetal Bovine Serum (FBS) og 5 ml celledyrkingsmedier (f.eks Glutamax).
    2. For hESC Medium, kombinere 390 ml Knockout-DMEM (KO-DMEM), 100 ml Knockout Serum Replacement (KO-SR), 5 ml celledyrkingsmedier, 5 ml MEM minimum essensielle aminosyrer løsning og 0,5 ml 55 mM β-mercaptoethanol.
      FORSIKTIG: β-Mercaptoethanol er giftig. Unngå innånding, svelging og hudkontakt.
    3. For RPMI-B27 (RB) Medium, kombinere 475 ml RPMI 1640, 10 ml B27 minusinsulin, 5 ml cellekulturmedium, 5 ml MEM minimum essensielt aminosyrer løsning, 5 ml penicillin / streptomycin, og 0,5 ml 55 mM β-merkaptoetanol.
    4. For Dissosiasjon Solution (DS), kombinere 10 ml 0,05% trypsin, 4 ml KO-SR, 1 ml kollagenase type IV (1 mg / ml), 5 ml KO-DMEM og 20 ul CaCl2 (1 M).
    5. For Feeder-celle kondisjonert medium, tilsett 15 ml hESC medium (uten bFGF) til en T75 kolbe med kon fl uent mater celler (MEF eller menneskelige forhud fibroblaster) som tidligere har blitt inaktivert ved behandling med enten mitomycin C eller ved bestråling. Harvest-kondisjonert medium etter 24 timer og erstatte med frisk hESC medium. Celler kan anvendes i opp til 2 uker.
  2. Belegg av Cell Kultur Plates
    1. ECM Gel Belegg:
      1. Ved kjøp, tine ECM gel ekstrakt ved 4 ° C til den er i en jevnt konsistent flytende tilstand, i henhold til produsentens instruksjoner. Fortynn i forholdet1: 2 i kaldt KO-DMEM medium, delmengde og oppbevar ved -20 ° C.
        Merk: Under utarbeidelsen av ECM gel, holde alle materialer som kreves for bruk i aliquotting og belegg prosedyre kaldt. Konsentrasjonen av ECM gel varierer med batchnummer. Sørg for at konsentrasjonen er notert på mengdene. Porsjoner kan oppbevares ved -20 ° C i opp til 6 måneder.
      2. Tine en ECM gel delmengde ved 4 ° C. Når tint, tilsett kaldt KO-DMEM medium for en endelig konsentrasjon på 0,34 mg / ml. Pipetter godt og tilsett 0,75 ml per én brønn av en seks-brønns plate. Inkuber i 1 time ved 37 ° C.
    2. Mitotisk Inaktivert Mouse Embryonic fibroblast mater Cell (MEF) Coating
      Merk:. Fremstilling av MEF feeder-celler er blitt beskrevet tidligere 14
      1. Belegge en 6-brønners cellekulturplate med Attachment faktor (AF) eller 0,1% gelatin (se trinn 1.2.3) ved RT i 5 min (0,75 ml per en brønn i en 6-brønn plate).Ta ut og la platen i biosikkerhet kabinettet (BSC) for å tørke.
      2. Tine MEF ved å overføre en frossen ampulle til et 37 ° C vannbad i ca 2 - 3 min.
      3. Legg 7 ml MEF medium til et 15 ml rør. Når ampullen av celler tint langsomt overføre innholdet til 15 ml røret. Sentrifuger ved 300 xg i 4 min. Aspirer supernatanten og resuspender cellene i MEF medium.
      4. Telle celler og plate 1 x 10 6 celler per seks brønn plate (~ 1,7 x 10 5 celler / brønn). Overføring til en 37 ° C / 5% CO 2 inkubator og la cellene å feste O / N før bruk.
    3. Gelatin Coating:
      1. Oppløs 1 g gelatinpulver i ultrarent vann for å gi en 0,1% (vekt / volum) oppløsning. Inkuber i 15 minutter ved 37 ° C og så autoklaveres oppløsning ved 121 ° C i 15 min. Når avkjølt, legger til det nødvendige antall brønner (0,75 ml per en brønn i en 6-brønn plate) og inkuberes i 15 min ved 37 ° C.
    4. Laminin Coating:
      1. Tine laminin (1 mg / ml) ved 4 ° C inntil tint. Til 5 mL av laminin løsning, tilsett 1 ml kald PBS. Pipetten vel deretter legge til det nødvendige antall brønner (0,75 ml per en brønn i en 6-brønn plate) og inkuberes i 1 time ved 37 ° C.
    5. Silicon Coating av Spinner Flask Intern Overflate:
      1. Vask en 100 ml spinner kolbe (med ett glass pendel) med destillert vann, ved hjelp av en rensebørste for å fjerne støv og / eller kultur rester. Fyll med 70% etanol, og etter 30 min skylling med destillert vann. Tilsett 5 M NaOH og la O / N.
      2. Fjern NaOH-oppløsning og skylle kolben under rennende vann i 5 min. Fyll kolben med en M HCl og la stå i 15 min. Vask kolben under rennende vann i 5 min, deretter to ganger med dobbeltdestillert vann til fullstendigfjerne ethvert spor av HCl. La kolben helt tørr i BSC.
      3. Tilsett 1,5 ml av silikonisering oppløsning til kolben og rotere horisontalt for å dekke alle overflater. Gjenta samme prosedyre for glass pendel.
      4. Oppvarme den belagte kolben i en tørr ovn ved 100 ° C i 1 time eller tørke i O / N ved RT. Ved oppvarming i en ovn, avkjøl til romtemperatur i 30-60 min.
      5. Skyll kolben 3 ganger med avionisert vann i 15 minutter hver, og deretter sterilisere ved autoklavering ved 121 C i 20 min.
  3. Vedlikehold av udifferensierte hPSCs
    Merk:     For hver av de protokoller som er beskrevet, med mindre spesifikt nevnt, blir cellene dyrket og dyrket i brønner i 6-brønners kulturplater og volumer vil bli gitt hensiktsmessig for dette formatet.
    1. hPSCs Dyrkede som Udifferensierte Spheroids i en statisk Suspension System
      Merk: Celler som brukes i disse trinnene bør allerede være tilpassetenkeltcellekultur. 15
      1. Begynn eksperimentere med hPSCs dyrket på ECM gel i en seks-brønns kulturplate i ca 70 - 80% sammenflytning. Fjern eventuelle differensierte kolonier ved hjelp av stereomikroskopet i BSC. Tilsett 10 uM ROCK-inhibitor Y-27632 og inkuberes ved 37 ° C i 1 time.
        Merk: For å fjerne de differensierte kolonier, bruk en pipette til å løsne og forsiktig fjerne alle differensierte delene manuelt under stereomikroskop. Vær forsiktig med å fjerne udifferensierte kolonier.
      2. Fjern celler fra inkubator og aspirer mediet. Vask cellene med 1 ml PBS, fjerne og legge til 0,5 ml celledissosiasjon enzym. Cellene inkuberes i 4 - 5 min ved 37 ° C.
      3. Tilsett 1 ml hESC medium og høste celler ved hjelp av en celle skrape. Distansere cellene i enkeltceller ved hjelp av en p1,000 pipette. Telle levedyktige celler ved hjelp av trypanblått og et hemocytometer.
      4. Resuspender celler til 2 × 10 5 levedyktig cells / ml i mater-celle betinget medium tilsatt 100 ng / ml bFGF og 10 mm ROCK hemmer Y-27632. Overfør cellene til ultra-lave festeplater ved hjelp av en 5 ml pipette (3 ml per brønn av seks-brønns plate).
      5. Etter 2 dager, fjern forsiktig celler fra inkubatoren og aspireres halvparten av mediet (ca. 1,5 ml). Bytt ut med fersk kondisjonert medium tilsatt 100 ng / ml bFGF.
      6. Endre halvparten av mediet hver dag med kondisjonert medium tilsatt 100 ng / ml bFGF til dag 5. Nå, enten ytterligere kultur celler, passasje for fortsatt udifferensiert kultur (trinn 1.3.1.2 - 5), eller bruk for hjerte differensiering (del 2 ). Hvis du går videre kultur, passasje celler hver 4 - 8 dager.
    2. hPSCs dyrket på Feeder Cells og passert Bruke Collage Type IV
      1. Før aging hPSCs, fjern eventuelle differensierte kolonier ved hjelp av stereomikroskopet i BSC. Aspirer medium og vaske cellene med 1 mlPBS per brønn. Fjern deretter legge til 0,75 ml kollagenase type IV (1 mg / ml) og inkuberes ved 37 ° C i 5 - 15 min, etter behov for å ha kantene av koloniene begynner å skrelle av.
      2. Aspirer kollagenase og tilsett 1 ml hESC medium per brønn. Ta kolonier til små klynger ved hjelp av en celle skrape, deretter overføre cellene ved hjelp av en p1,000 pipette til en 15 ml tube. Vær forsiktig med å bryte opp klasene i små biter.
      3. Vask godt med 1 ml hESC medium til å samle eventuelle gjenværende cellene og legge til 15 ml tube. Sentrifuger ved 100 xg i 2 min. Aspirer supernatanten og resuspender cellene i hESC medium supplert med 100 ng / ml bFGF.
      4. Fjern en MEF belagt plate fra inkubatoren og aspirer MEF medium. Overfør cellene i et forhold mellom 1: 3 og 1:10, etter behov. Endre medium daglig med frisk hESC medium supplert med 100 ng / ml bFGF. Passage cellene hver 4 - 8 dager.

2. differensiertasjon av hPSCs som Spheroids i en statisk Suspension System

  1. Begynn eksperiment ved hjelp day 5 udifferensierte kuler som utarbeides i avsnitt 1.3.1.
    Merk: På dette stadiet, bør den gjennomsnittlige størrelsen på kulene være 175 ± 25 mikrometer. Et minimum av 50 kuler bør brukes når du starter en differensiering eksperiment.
  2. Transfer kuler inn i en 15 ml tube med en 5 ml pipette. Vask godt med 1 ml RB medium til å samle eventuelle gjenværende kuler og legge til samme 15 ml tube. La cellene i 5 min før kulene har sedimentert å danne en løs pellet (IKKE sentrifuger). Aspirer supernatanten, være forsiktig med å ikke ta noen kuler.
  3. Tilsett 3 ml RB medium supplert med 12 mikrometer CHIR99021. Overfør cellene tilbake inn i en brønn i en 6-brønns ultra-lav festeplate. Etter 24 timer, gjenta trinn 2.2.
    Merk: RB medium er lysfølsom. Når du arbeider med RB medium, holde BSC lyset slått av.
  4. ENdd 3 ml RB medium til cellepelleten. Overfør cellene tilbake inn i en brønn i en 6-brønns ultra-lav festeplate. Etter 24 timer, gjenta trinn 2.2.
  5. Tilsett 3 ml RB medium supplert med IWP2, purmorphamine og SB431542 (5 mM hver). Overfør cellene tilbake inn i en brønn i en 6-brønns ultra-lav festeplate. Etter 2 dager gjentar trinn 2.2.
  6. Resuspender cellene i 3 ml av RB-medium og overføring til en gelatin-belagt plate for å tillate cellene å feste.
    Merk: På dette stadiet, kan cellene også holdes i suspensjon. For å kunne fortsette med statisk suspensjon kultur, overføre cellene tilbake til en ultra-lav festeplate.
  7. Skift medium med 3 ml RB medium etter 2 dager. Kulturene vil begynne å slå neste dag. Endre medium hver 3 - 4 dager med RB medium.

3. Differensiering av hPSCs som Spheroids i en rørt suspensjon bioreaktor

  1. Begynn eksperimentere med udifferensiert kuler kulturd i statisk suspensjon for minst 3 passasjer (se kapittel 1.3.1). Tilsett 10 uM ROCK-inhibitor Y-27632 og inkuberes ved 37 ° C i 1 time.
  2. Fjern celler fra inkubator og overføre alle kuler i en 15 ml tube med en 5 ml pipette. Vask godt med 1 ml hESC medium til å samle eventuelle gjenværende kuler og legge til samme 15 ml tube. La cellene i 5 min før kulene har sedimentert å danne en løs pellet (IKKE sentrifuger). Aspirer supernatanten, være forsiktig med å ikke ta noen kuler.
  3. Vask cellene ved tilsetning av 1 ml PBS. Permisjon for 5 min før kulene har sedimentert å danne en løs pellet (IKKE sentrifuger). Fjern supernatanten og tilsett 0,5 ml 0,05% trypsin pluss 0,53 mM EDTA. Cellene inkuberes i 4 - 5 min ved 37 ° C.
  4. Fjern celler fra inkubatoren og tilsett 1 ml hESC medium. Ved hjelp av en pipette p1,000, dissosiere cellene inn i enkeltceller, telle celler ved hjelp av Trypan blått og et hemocytometer. Suspender til 2 × 10 5 viable celler / ml i kondisjonert medium supplert med 100 ng / ml bFGF og 10 uM inhibitor ROCK Y-27632.
  5. Overfør 100 ml av cellesuspensjonen i bioreaktoren silikonisert kolben med en pendel (se avsnitt 1.2.5). Start med 35 rpm omrøring og etter 24 timers økning til 40 rpm.
  6. Etter 48 timer, stopp omrøring i 5 - 10 minutter inntil alle kulene har slått seg ned til bunnen av kolben. Erstatte halvparten av mediet med kondisjonert medium supplert med 100 ng / ml bFGF. Gjenta den samme prosessen hver 24 time inntil dag 5.
    Merk: I denne fasen, bør udifferensierte sfæroider med en gjennomsnittlig størrelse på 175 ± 25 um dannes.
  7. Stoppe omrøring i 5 - 10 minutter inntil alle kulene har slått seg ned til bunnen av kolben. Overføre alle kuler til et 50 ml rør i en minimal mengde medium (mindre enn 50 ml). Kast eventuelt gjenværende medium i bioreaktoren kolbe, grundig sikrer ingen kuler som er igjen i beholderen.
  8. leave i 5 - 10 minutter inntil alle kulene har slått seg ned på undersiden av 50 ml tube deretter forsiktig fjerne supernatanten uten å forstyrre den løse cellepelleten. Vask med 25 ml PBS med kalsium og magnesium eller RB medium, og deretter forlate igjen i 5 - 10 minutter inntil alle kulene har slått seg ned på undersiden av 50 ml rør for igjen å danne en løs pellet.
  9. fjern supernatanten forsiktig og tilsett 40 ml RB-medium supplert med 12 uM CHIR99021, 10 uM Rock-inhibitor og 0,1% poly- vinylalkohol (PVA). Resuspender sfæroidene og overføre alle cellene tilbake til bioreaktoren kolben. Legg medium for å gjøre det totale volum 100 ml. Start omrøring ved 40 rpm i 24 timer.
    Merk: RB medium er lysfølsom. Når du arbeider med RB medium holde BSC i lyset avslått modus.
  10. Gjenta trinn 03.07 til 03.08.
  11. fjern supernatanten forsiktig og tilsett 40 ml RB medium supplert med 0,1% PVA. Suspender kulene og overføre alle cellene tilbake til than bioreaktorfunksjon kolbe. Legg medium for å gjøre det totale volum 100 ml. Start omrøring ved 40 rpm i 24 timer.
  12. Gjenta trinn 03.07 til 03.08.
  13. Fjern forsiktig supernatanten og tilsett 40 ml RB medium supplert med IWP2, purmorphamine og SB431542 (5 mM hver). Resuspender sfæroidene og overføre alle cellene tilbake til bioreaktoren kolben. Legg medium for å gjøre det totale volum 100 ml. Starte omrøring ved 40 rpm i 2 dager.
  14. Gjenta trinn 3,7-3,8.
  15. fjern supernatanten forsiktig og tilsett 40 ml RB medium bare. Resuspender sfæroidene og overføre alle cellene tilbake til bioreaktoren kolben. Legg medium for å gjøre det totale volum 100 ml. Start omrøring ved 40 rpm. Slo kuler bør observeres 48-72 timer senere.
  16. Endre halvparten av det medium hver 3 - 4 dager med RB medium bare ved stopping av omrøringen i 5 - 10 minutter inntil alle kulene har slått seg ned til bunnen av beholderen. fjerne 50 ml medium nøye uten å forstyrre kulene og carefully erstatte med 50 ml frisk RB medium.

4. Differensiering av hPSCs Bruke kulturer ikke tilpasset enkeltcelle aging

Merk: Denne fremgangsmåten er spesielt anvendelig for hurtig differensiering av et høyt antall hPSC linjer uten å måtte tilpasse seg encellede dyrkningsteknikker, et enormt arbeidskrevende og tidkrevende prosess. Denne teknikken kan anvendes på cellelinjer som er meget følsomme overfor enzymatisk celle dissosiasjon, som nylig etablerte hPSC linjer.

  1. Begynn eksperimentere med hPSCs dyrket på MEF (som i avsnitt 1.3.2) som er ca 70 - 80% sammenflytende. Fjern eventuelle differensierte kolonier ved hjelp av stereomikroskopet i BSC.
  2. Fjern medium og tilsett 0,5 ml Dissosiasjon Solution (DS). Inkuber i 0,5 - 1 minutt inntil MEF-celler har rundet oppover og kantene av hPSCs kolonier blir klar. Raskt fjerne DS og tilsett 0,75 ml collagenase type IV (1 mg / ml).
  3. Inkubercellene i 5 - 15 minutter ved 37 ° C. Sjekk cellene i mikroskop under inkubasjonstiden, og når hele kolonier begynner å løfte av og løsne, fjerne kollagenase og tilsett 1,5 ml hESC medium.
    Merk: Hvis du etter 15 min mesteparten av koloniene er fortsatt festet, sette cellene tilbake til inkubatoren. Sjekk cellene under mikroskopet hver 5 min. Vær forsiktig med å forlate cellene i collage i mer enn 30 min. Hvis det er mange flytende kolonier i collagenase løsning, ikke fjerne kollagenase; bare legge en ml hESC medium.
  4. Ved hjelp av en p1,000 pipette, forsiktig pipette kolonier å løsrive som hele kolonier. Ikke knus koloniene i små biter. Overfør cellene inn i et 15 ml rør ved hjelp av en 5 ml pipette. Vask godt med 1 ml hESC medium til å samle alle gjenværende celler for å legge til i samme rør. Permisjon for 5 min før alle kolonier har sedimentert (IKKE sentrifuger).
  5. fjern supernatanten forsiktig og tilsett 2 ml hESC medium supplert med 100 ng / ml bFGF. Overfør cellene inn i en ultra-lav festeplate ved anvendelse av 5 ml pipette (1 ml i hver brønn av en 24-brønners plate og 3 ml i hver brønn av en 6-brønn plate). Inkuber ved 37 ° C / 5% CO2 i minst 6 timer (inntil 12 timer).
  6. I løpet av denne tiden, forberede nødvendige antall laminin-belagte brønner / plater for steg 4,7. Anbefalt celleoverføringsforhold er en konfluent brønn i en 6-brønns plate til 2 brønner i en 24-brønns plate (eller ekvivalent mengde pr overflateareal).
  7. Etter seks timer, nøye overføre koloni aggregatene i et 15 ml rør ved hjelp av 5 ml pipette. Vask platen med RB medium til å samle eventuelle gjenværende aggregater og legge til samme 15 ml tube (0,5 ml per brønn for 24-brønn og 1 ml per brønn for seks-brønns plater). Vent 5 min til aggregater sediment, deretter forsiktig aspirer supernatanten. Vær forsiktig med å forstyrre den løse pellet.
  8. Tilsett 2 ml RB medium supplert med 12 mikrometer CHIR99021 og nøye overføremed en 5 ml pipette til pre-forberedt laminin belagt brønner (som i avsnitt 1.2.4), slik at cellene til å feste.
  9. Etter 24 timer, forsiktig fjerne mediet i hver brønn og tilsett 1 ml RB medium bare.
    Merk: Noen av aggregatene vil ha bare festet svært svakt til kultur plate; Derfor er det viktig å ikke fjerne eventuelle store aggregater som kan ha løsnet i løpet av mediet endringen prosedyre. Det er imidlertid viktig å fjerne så mye av de små celleavfall som mulig.
  10. Etter 24 timer, forsiktig fjerne medium og tilsett RB medium supplert med IWP2, purmorphamine og SB431542 (5 mM hver).
  11. Endre medium etter 2 dager med RB medium bare. Celler vil begynne å slå neste dag.
  12. Endre medium hver 3 - 4 dager med RB medium bare.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For å etablere en enkel fremgangsmåte for storskala differensiering av kardiomyocytter fra hPSCs, laget vi en protokoll hvori cellene ble behandlet først med et WNT / β-catenin aktivator (CHIR99021) 16 og deretter med inhibitorer av WNT / β- catenin og transformerende vekstfaktor-β (TGF-β) trasé (IWP2 16 og SB431542 17, henholdsvis) og til slutt en aktivator av den soniske pinnsvin (SHH) veien (purmorphamine) 17 (figur 1A). I vår differensiering, omtrent 50% av kulene (175 ± 25 um sfæroide diameter størrelse) begynte å slå 7 dager etter initiering av differensiering, som deretter øket til 100% ved dag 10. Det er interessant å bruke denne protokollen, differensierte sfæroider er observert å fortsette å slå opp til 60 dager etter differensiering initiering 18. Befolkningsstudier på dissosierte kulerundersøkt ved hjelp av strømningscytometri viste at ved dag 15, mer enn 90% av befolkningen inneholdt hjerte- troponin T positiv (cTnT +) celler, mens mindre enn 12% av cellene var positive for glatt muskulatur og endotel-markører (3,1% von Willibrand faktor (vWF +), 8,4% alfa glatt muskel aktin-positive (Asma +)) 18. Til dags dato har den statiske suspensjon differensiering protokollen blitt testet på 5 hESC og 4 hiPSC linjene, med utganger som resulterer i ca 90% av å slå kuler fra hver linje, som viser høy reproduserbarhet av denne protokollen mellom ulike hPSC linjer (figur 1B).

For å utvikle en integrert plattform for storskala produksjon av menneskelige cardiomyocytes, søkte vi vår statisk suspensjon differensieringsstrategi til en rørt suspensjon bioreaktor (Figur 2A). De forskjellige kuler viste lignende oppførsel i bioreaktor environment som i det statiske system (figur 2B) og ble observert ca. 100% av sfæroider som skal slå på dag 10 18. Farging i deler av å slå kuler samlet på dag 30 ved anvendelse av antistoffer mot cTnT og den kardiale transkripsjonsfaktor NKX2-5 viste cytoplasmisk og atom ekspresjon av disse proteinene, respektivt (figur 2C). Det totale utbytte av celler i det dynamiske suspensjonskultur var omtrent 90 - 100 millioner celler i 100 ml arbeidsvolum etter 15 dager med differensiering kultur. Med dette er tilfelle, kan det kardiomyocytt utbytte nå opp til omtrent 54 til 90 millioner celler (med den observerte 60-90% differensiering effekt) fra 20 millioner utgangs hPSCs, inokulert i hPSCs ekspansjonsfase som enkeltceller. Vi i tillegg undersøkt elektrofysiologiske egenskapene til differensiert cardiomyocytes med encellede patch clamp metode. Slo kuler fra bioreaktor kulturer vardissosiert til enkeltceller på dag 30 og aksjonspotensialer registrert på representative celler ved hjelp hele cellen patch clamp teknikken. Data viste tilstedeværelsen av de tre viktigste hjertecelletyper (atrial-, nodal- og ventrikulære-lignende celler) i befolkningen av enkeltceller 18.

For de to differensierings teknikker som er nevnt ovenfor, hPSCs må tilpasses til materen-fri og / eller enkeltcellesuspensjonskultur 19-21. Noen hPSC linjer derimot, er svært følsomme for enzymatisk celle dissosiasjon og viser betydelig tap av cellelevedyktigheten etter dissosiasjon, som kan observeres i nylig etablerte hiPSC linjer. I tillegg, når du arbeider med store årskull av linjer, tilpasse alt til mater-fri og singel-cellekultur ville være enormt arbeidskrevende og tidkrevende. For å løse disse problemene, ble udifferensierte kuler erstattet med udifferensiert celleaggregater (figur 3A).Våre data viser at bruk av denne modifiserte teknikk, slår klynger dukket 7 dager etter differensiering start. Reproduserbarheten av denne modifiserte versjon ble bekreftet ved bruk av 42 hiPSC linjer, hvor alle de testede linjer som genereres i gjennomsnitt mer enn 60% cTnT + -celler ved dag 15 for hvert eksperiment utført (figur 3B). Farging bruker antistoffer mot cTnT og NKX2-5 i dissosiert slo klynger viste cytoplasma og kjernekraft uttrykk, henholdsvis (figur 3C).

Figur 1
Figur 1. Skjematisk av kardiomyocytt Differensiering fra hPSCs i Static Fjæring og representative data. (A) Eksperimentell design av hPSCs differensiering til cardiomyocytes i statisk bæresystem. (B) Evaluering av effektiviteten avhjerte differensiering blir målt ved å telle antallet av å slå sfæroider (%). Vist her er gjennomsnittet av minst 3 differensiering eksperimenter fra hver av fem hESC og 4 hiPSC linjene 18. Samlet gjennomsnittlig slå kuler fra alle linjer er ca 90%. Feilfelt representerer SD (n = 3). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2. Samlet Skjematisk av cardiomyocytes Differensiering fra hPSCs i Dynamic Suspension og representative data. (A) Eksperimentell design av hPSCs differensiering til cardiomyocytes i dynamisk fjæringssystem. RI: Rock inhibitor (B) Fase kontrast på dagen 5 kuler (Representant result fra Royan H5 hESC linje). Scale bar 200 mikrometer (C) Farging av hESC avledet ledende kuler seksjonert i dag 30 for NKX2.5 og cTnT. Scale bar 100 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. Samlet Skjematisk av cardiomyocytes Differensiering fra hPSCs bruker kulturer ikke tilpasset enkeltcelle aging. (A) Eksperimentell utforming av hPSCs differensiering til kardiomyocytter ved hjelp av kulturer ikke er tilpasset enkeltcelle aging. (B) Strømningscytometri-analyse av dissosierte aggregater viser i gjennomsnitt mer enn 60% cTnT + celler i 42 testede hiPSC linjer. (C) Farging av dissosiert cardiomyocytes avledet frahiPSCs for NKX2.5 og cTnT (Representant resultat 646-4 hiPSC linje). Scale bar 20 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kardiomyocytter avledet fra hPSCs er en svært attraktiv kilde for anvendelse i human sykdom modellering, legemiddelscreening / toksisitetstesting og, kanskje i fremtiden, regenererende behandling. En av de største hindringer for å bruke disse cellene er imidlertid evnen til å gi tilstrekkelig høy kvalitet materiale for deres effektive bruk. Ved hjelp av vår beskrevet protokollen, tilbyr vi en metode som overvinner denne begrensningen.

Nylig har syntetiske små molekyler rettet mot spesifikke signalveier involvert i cardiogenesis blitt beskrevet å forbedre hjerte differensiering 16,17,22,23. Disse blir nå brukt som et alternativ til rekombinante cytokiner og serum, som inneholder mange udefinerte faktorer og viser batch variasjon. Den største fordelen med et lite molekyl protokoll, annet enn sin spesifisitet, er at det er billig og komponent faktorer generelt har en forlenget holdbarhet i forhold til medier inneholdende cytokiner eller vekstfaktorer. Ettersom de små molekyler som brukes i vår rapportert protokollen molekylvekt midler lave, de er strukturelt og funksjonelt definert og kan diffundere lett gjennom cellemembranen 24,25.

Så langt har ulike metoder blitt brukt til hPSCs for å etablere robuste, skalerbare differensiering teknikker; Men de fleste av disse metodene har blitt etablert som 2D og småskala statiske kulturer, noe som kan gi dårlig skalerbarhet og homogenitet. Teknikker som tvinges aggregering, mikro-utskrift teknologier og mikrobærer kulturene 26-29 er nå kommer inn i bruk, men til tross for noen fremskritt på dette området, er disse metoder er fortsatt langt fra å gi cellenumrene som kreves for deres bruk i høy -demand systemer. Begrenset eller ikke bevist reproduserbarhet og skalerbarhet, og de høye kostnader på grunn av nødvendigheten av kostbare medier (mTeSR1 eller StemPro-34) eller mikrobærer for begge utvidelse av hPSCs og deres differensiering rettet til cardiomyocytes 30,31, er ulempene med å bruke disse metodene i høy gjennomstrømming hPSCs teknologier.

I denne studien, har vi rapportert en enkel, robust og skalerbar protokoll for fremstilling av hPSC-avledede kardiomyocytter. Reproduserbarheten av denne protokollen er godkjent med mer enn 40 forskjellige hPSC linjer, den mest omfattende validering rapportert til dags dato. Sammenlignet med tidligere rapportert suspensjon protokoller, viser denne metoden store fordeler i forhold til skalerbarhet, reproduserbarhet, kostnader, effektivitet og funksjonalitet av cardiomyocytes generert. Suksessen til vår differensiering protokollen er grundig avhengig av høy kvalitet på hPSCs brukes for studien. Derfor er det viktig å sjekke hver linje er karyotype og den høye og vedvarende uttrykk for pluripotency markører ved farging og PCR før du starter eksperimentet. Spesielt, når dyrking av cellene i bioreaktoren, er det viktig å bruke hPSCs som har B-een passert på enkelt-celle-nivå i minst tre passeringer før starten av differensiering. I våre protokoller er det brukt kuler med en gjennomsnittlig størrelse på 175 ± 25 pm, som var sfæroider som genereres etter 5 dager. Dagen som kulene møte denne størrelsesbegrensning kan variere avhengig av vekst av individuelle hPSC linjer; Derfor er det viktig at størrelsen, mer enn dagen for vekst, er tatt i betraktning.

Denne protokollen også kan bli manipulert til å bli egnet for sensitive cellelinjer og store årskull av hPSC linjer. Selv om denne protokoll resulterer i sterkt anriket kardiomyocytter, kan renhet forbedres ved å kombinere de differensiering-protokollen med et metabolsk utvalg fremgangsmåte så som laktat anriket medium 32. Dessuten kan forbedringer i den modning og funksjon av de avledede kardiomyocytter beskrevet i denne protokoll anvendes ved generering av tre-dimensjonale, justert hjertevev 33. En av begrensningene i denne protokollen er at bestemte undergrupper av cardiomyocytes ikke er spesielt generert, rett og slett en blanding av atrial, ventrikulær og node celler. Videre undersøkelser på dette feltet er nødvendig for å utvikle differensieringsprotokoller som kan produsere høyanriket subtype-spesifikke cardiomyocytes i stor skala. Selv om noen småskala protokoller har blitt utviklet til dags dato, vil metodene må være grundig testet for å sikre oppskalering er mulig 34.

Utvikling av slike integrerte plattformer kan betraktes som et viktig skritt på veien mot kommersialisering av hPSC-avledet cardiomyocytes teknologier for klinisk, farmasi, tissue engineering, og in vitro orgel / organoid utviklings applikasjoner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Victor Chang Cardiac Research Institute driver ikke, heller ikke tolererer, ødeleggelse av menneskelige embryoer for forskning. Sitt bidrag til denne studien var begrenset til å jobbe med menneskeskapte pluripotente stamceller.

Forfatterne erklærer de har ingen konkurrerende økonomiske interesser.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Knockout DMEM Life Technologies 10829018
Knockout Serum Replacement (KO-SR) Life Technologies 10828028
Glutamax Life Technologies 35050061
MEM Non-essential Amino Acids Life Technologies 11140-050
β-Mercaptoethanol Life Technologies 21985-023
Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) Miltenyi Biotec 130-093-843
RPMI1640 Life Technologies 11875093
DPBS, no calcium, no magnesium Life Technologies 14190144
DPBS Life Technologies 14287072
Attachment Factor (AF) Life Technologies S006100
ECM Gel Sigma-Aldrich E1270
Laminin Invitrogen 23017-015
DMEM Life Technologies 11965-092                                                                                                       
Fatal Bovine Serum (FBS) Life Technologies 16140-071
B27 minus insulin Gibco A18956-01
Penicillin/Streptomycin Life Technologies 15070063
0.05% Trypsin/EDTA Life Technologies 25300-054
Collagenase Type IV Life Technologies 17140-019
Calcium Chloride (CaCl2) Sigma-Aldrich C7902
Mitomycin C Bioaustralis BIA-M1183
CHIR99021 Miltenyi Biotec 130-104-172
IWP2 Miltenyi Biotec 130-105-335
SB431542 Miltenyi Biotec 130-095-561
Purmorphamine Miltenyi Biotec 130-104-465
ROCK inhibitor Y-27632 Miltenyi Biotec 130-104-169
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich E6758
Poly Vinyl Alcohol (PVA) Sigma-Aldrich 363073
Gelatin Sigma-Aldrich G1890
Trypan Blue Bio-Rad 145-0013
Accumax  Innovative Cell Technologies Inc. AM105
Sigmacote  Sigma-Aldrich SL2 
CELLSPIN Integra Biosciences 183 001
Spinner flask with 1 pendulum, 100 ml  Integra Biosciences 182 023
Mouse Embryonic Fibroblasts (MEF) Prepared in-house (or commercially available)
Human pluripotent stem cell (hPSC) lines Prepared in-house (or commercially available)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
  2. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
  3. Carvajal-Vergara, X., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell-derived models of LEOPARD syndrome. Nature. 465, 808-812 (2010).
  4. Vitale, A. M., Wolvetang, E., Mackay-Sim, A. Induced pluripotent stem cells: a new technology to study human diseases. Int. J. Biochem. Cell Biol. 43, 843-846 (2011).
  5. Sharma, A., et al. Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes as an in vitro model for coxsackievirus B3-induced myocarditis and antiviral drug screening platform. Circ Res. 115, 556-566 (2014).
  6. Zimmer, B., et al. Evaluation of developmental toxicants and signaling pathways in a functional test based on the migration of human neural crest cells. Environ Health Perspect. 120, 1116-1122 (2012).
  7. Diecke, S., Jung, S. M., Lee, J., Ju, J. H. Recent technological updates and clinical applications of induced pluripotent stem cells. Korean J Intern Med. 29, 547-557 (2014).
  8. Kimbrel, E. A., Lanza, R. Current status of pluripotent stem cells: moving the first therapies to the clinic. Nat. Rev. Drug Discov. 14, 681-692 (2015).
  9. Kehat, I., et al. Human embryonic stem cells can differentiate into myocytes with structural and functional properties of cardiomyocytes. J Clin Invest. 108, 407-414 (2001).
  10. Mummery, C., et al. Differentiation of human embryonic stem cells to cardiomyocytes: role of coculture with visceral endoderm-like cells. Circulation. 107, 2733-2740 (2003).
  11. Laflamme, M. A., et al. Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts. Nat Biotechnol. 25, 1015-1024 (2007).
  12. Fonoudi, H., et al. ISL1 protein transduction promotes cardiomyocyte differentiation from human embryonic stem cells. PLoS One. 8, e55577 (2013).
  13. Zhu, W. Z., Hauch, K. D., Xu, C., Laflamme, M. A. Human embryonic stem cells and cardiac repair. Transplant Rev (Orlando). 23, 53-68 (2009).
  14. Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. (64), e3854 (2012).
  15. Stover, A. E., Schwartz, P. H. Adaptation of human pluripotent stem cells to feeder-free conditions in chemically defined medium with enzymatic single-cell passaging. Methods Mol Biol. 767, 137-146 (2011).
  16. Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc Natl Acad Sci. 109, E1848-E1857 (2012).
  17. Gonzalez, R., Lee, J. W., Schultz, P. G. Stepwise chemically induced cardiomyocyte specification of human embryonic stem cells. Angew Chem Int Ed Engl. 50, 11181-11185 (2011).
  18. Fonoudi, H., et al. A Universal and Robust Integrated Platform for the Scalable Production of Human Cardiomyocytes From Pluripotent Stem Cells. Stem Cells Transl Med. , (2015).
  19. Abbasalizadeh, S., Larijani, M. R., Samadian, A., Baharvand, H. Bioprocess development for mass production of size-controlled human pluripotent stem cell aggregates in stirred suspension bioreactor. Tissue Eng Part C Methods. 18, 831-851 (2012).
  20. Larijani, M. R., et al. Long-term maintenance of undifferentiated human embryonic and induced pluripotent stem cells in suspension. Stem Cells Devt. 20, 1911-1923 (2011).
  21. Baharvand, H., Larijani, M. R., Yousefi, M. Protocol for expansion of undifferentiated human embryonic and pluripotent stem cells in suspension. Methods Mol Biol. 873, 217-226 (2012).
  22. Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nat Methods. 11, 855-860 (2014).
  23. Minami, I., et al. A small molecule that promotes cardiac differentiation of human pluripotent stem cells under defined, cytokine- and xeno-free conditions. Cell reports. 2, 1448-1460 (2012).
  24. Buskirk, A. R., Liu, D. R. Creating small-molecule-dependent switches to modulate biological functions. Chem Bio. 12, 151-161 (2005).
  25. McKinsey, T. A., Kass, D. A. Small-molecule therapies for cardiac hypertrophy: moving beneath the cell surface. Nat Rev Drug Discov. 6, 617-635 (2007).
  26. Niebruegge, S., et al. Generation of human embryonic stem cell-derived mesoderm and cardiac cells using size-specified aggregates in an oxygen-controlled bioreactor. Biotechnol Bioeng. 102, 493-507 (2009).
  27. Bauwens, C. L., et al. Geometric control of cardiomyogenic induction in human pluripotent stem cells. Tissue Eng Part A. 17, 1901-1909 (2011).
  28. Hwang, Y. S., et al. Microwell-mediated control of embryoid body size regulates embryonic stem cell fate via differential expression of WNT5a and WNT11. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 16978-16983 (2009).
  29. Nguyen, D. C., et al. Microscale generation of cardiospheres promotes robust enrichment of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 3, 260-268 (2014).
  30. Kempf, H., et al. Controlling expansion and cardiomyogenic differentiation of human pluripotent stem cells in scalable suspension culture. Stem Cell Reports. 3, 1132-1146 (2014).
  31. Hemmi, N., et al. A massive suspension culture system with metabolic purification for human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cells Transl Med. 3, 1473-1483 (2014).
  32. Tohyama, S., et al. Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell stem cell. 12, 127-137 (2013).
  33. Nunes, S. S., et al. Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Nat meth. 10, 781-787 (2013).
  34. Devalla, H. D., et al. Atrial-like cardiomyocytes from human pluripotent stem cells are a robust preclinical model for assessing atrial-selective pharmacology. EMBO Mol Med. 7, 394-410 (2015).

Tags

Developmental Biology Human pluripotente stamceller stamcellebiologi cardiomyocytes Cardiac differensiering Små molekyler Stirred suspensjon bioreaktor
Storskala produksjon av cardiomyocytes fra Menneskelig Pluripotent stamceller ved hjelp av en meget reproduserbar lite molekyl-Based Differensiering Protocol
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fonoudi, H., Ansari, H.,… More

Fonoudi, H., Ansari, H., Abbasalizadeh, S., Blue, G. M., Aghdami, N., Winlaw, D. S., Harvey, R. P., Bosman, A., Baharvand, H. Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol. J. Vis. Exp. (113), e54276, doi:10.3791/54276 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter