Summary
소 각막 내피 세포의 일차 배양 각막 내피 간엽 전이의 메커니즘을 조사 하였다. 또한, 래트 각막 내피 cryoinjury 모델 생체 내 각막 내피 간엽 전환을 증명 하였다.
Protocol
모든 절차는 안과 및 비전 연구에서 동물의 사용을위한 비전 및 안과 문에 연구를위한 협회 부여 본 연구에서 다음과 국립 대만 대학 병원의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.
1. 격리, 차 문화의 제조 및 소 CECs의 면역 염색
- 로컬 도살장에서 신선한 소 눈을 획득.
- 3 분 동안 10 %의 v / w 포비돈 요오드 용액에 눈 소독. 인산염 완충 식염수 (PBS) 솔루션을 씻으십시오.
- 무균 조건에서 메스와 가위로 각막 버튼을 수확. 해부 현미경 집게로 껍질 데스 메막 (이 연구에서 그주의, 소 눈은 로컬 도살장에 의해 적출 된, 따라서 첫 번째 연구 절차는 실험실에서 preenucleated 눈의 소독이었다).
- 시도 1 ㎖에 데스 메 막을 품어30 분 동안 37 ° C에서 psin. 5 분 112 XG에서 원심 분리하여 소 CECs를 수집합니다. 보충 호르몬 상피 매체 (SHEM) HEPES 완충 둘 베코 변형 이글 배지와 5 % 소 태아 혈청이 보충 된 햄 F12 배지, 0.5 % 디메틸 술폭 시드, 인간 표피 2 ng를 / ㎖의 동일한 양을 함유하는 1 ml의 세포를 재현 탁 성장 인자, 5 밀리그램 / 인슐린 ㎖, 5 밀리그램 / 트랜스페린 ㎖, 5 NG / 셀레늄 ㎖, 콜레라 독소의 1 nmol의 / l, 50 밀리그램 / 젠타 마이신 ㎖, 1.25 밀리그램 / 암포 테리 신 B의 용액
- 6 형상 접시에 세포 (안구 당 약 1 × 105 세포)를 시드. 셈 문화를. 공기 중 5 % CO 2 분위기하에 37 ℃에서 인큐베이션 접시. 3 일마다 배지를 변경합니다.
- 세포가 합류점에 도달하면, PBS로 씻어, 5 분 동안 37 ° C에서 트립신 1 ㎖ 그들을 부화. 5 분 112 XG에서 원심 분리를 수집합니다. 셈 1 ㎖의 세포 펠렛을 다시 일시 중지합니다.
2. 쥐 각막 내피 Cryoinjury 모델 및 내원시 주입
- 2 % 자일 라진 (5.6 ㎎ / ㎏) 및 tiletamine 플러스 zolazepam (/ kg 18 mg)을 근육 주사이 12 주령의 수컷 흰쥐를 마취. 가볍게 피부 경련의 부재하에 적절한 마취를 확인하기 위하여 동물의 피부를 끼우는.
- 눈의 통증과 깜짝 반사를 최소화하기 위해 각 쥐의 오른쪽 눈에 0.5 % proparacaine 염산염 한 방울을 주입. 주입왼쪽 눈에 테트라 사이클린 연고는 각막 건조를 방지합니다.
- 액체 질소 스테인레스 스틸 프로브 (직경 = 3 mm)를 냉각. 30 초간 오른쪽 눈의 중심 각막 스테인리스 프로브를 적용한다. 자주 각막 건조를 방지하는 절차 중 우측 눈에 PBS를 주입.
- 즉시 cryoinjury 후 0.1 % 아트로핀 및 0.3 % 황산 젠타 마이신을 주입 매일 한번 섬모 경련으로 인한 안구 통증을 완화하고, 감염을 방지 할 수있다.
- 시술 후, 래트를 가열 램프를 이용하여 보온, 그들은 모터 제어를 회복 할 때까지 마취 회복 후에도 15 분마다 관찰. 또한 회복 기간 동안 각막의 건조를 방지하기 위해 우안에 테트라 사이클린 연고를 적용한다.
- 3 일 연속 각막 cryoinjury를 반복합니다.
- 전술 한 바와 같이 쥐 눈의 전방 챔버로 타틴 또는 bFGF를 전달 들어, 래트를 마취. 한 방울을 주입오른쪽 눈에 0.5 % proparacaine 염산염의 눈의 통증과 깜짝 반사를 최소화합니다.
- 멸균 PBS와 안구 표면을 관개. 홍채에 위의 평행 한 평면에 paralimbal 맑은 각막에 1 ML의 주사기에 부착 된 30 G 바늘을 삽입하여 운영 현미경으로 전방 천자를 수행합니다.
- 바늘이 최대 베벨 켜고, 약간 약간의 방수를 배출하고 안압을 줄이기 위해 각막 상처를 우울. 에 각막 약 0.02 mL의 주입. 조심스럽게 바늘을 철수하는 동안면 끝이 바늘 관을 압축합니다.
- 운영 현미경 지시 된 시점에서, 외부 눈 사진.
3. 수확 쥐 각막 버튼과 면역 염색
- 래트를 안락사하려면 안락사 챔버에 배치 분당 챔버 부피 10-30 %의 충전 속도로 100 % CO 2 달이다. 에 대한 CO 2 주입 유지호흡의 부족 및 머 금고 눈 색깔 후 추가 분.
- 날카로운 블레이드와 윤부에서 쥐의 눈을 침투. 윤부를 따라 각막 가위로 각막을 잘라. 슬라이드에 각막을 평평하게. 각막이 꼬고 경우 추가 반경 방향 절개를합니다.
- 실온에서 30 분 동안 4 % 파라 포름 알데하이드 250 ㎕를, pH가 7.4으로 각막을 수정. 5 분 동안 0.5 % 트리톤 X-100 250 ㎕를 Permeabilize 하시려면로, 30 분 동안 10 %의 소 혈청 알부민으로 차단.
- (1)의 희석 4 ° C에서 하룻밤 ABC에 대한 일차 항체로 각막을 품어 : (200) 항체 희석액에. 15 분 동안 PBS로 두 번 씻어 각막 및 이차 항체로 배양 한 1 시간 동안 실온에서 (1 항체 희석제 100). 셀 2 μg의 4 / ㎖ ', 6-diamidino -2- 페닐 인돌로 세포를 피복함으로써 핵 및 15 분 동안 PBS로 두 번 세포를 씻어 Counterstain과.
- 설치 솔루션을 방지 페이딩의 각막을 탑재합니다. 산부인과20X 대물 확대 한 레이저 스캐닝 공 초점 현미경으로 면역 (405)의 여기 파장 및 561 nm의 이미지를 주석 박.
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Representative Results
소 CECs의 분리 후, 세포를 시험관 내에서 배양 하였다. (1)가 소 CECs의 위상차 이미지를 보여주고있다. 합류 셀의 육각형은 세포가 세포 분리 동안 각막의 간질 섬유 아세포에 의해 오염되지 않은 것으로 나타났다. (2)는 지정된 시점에서 ABC, 달팽이와 민달팽이에 대한 항체를 이용하여 수행 한 면역 염색을 보여주고있다. 외에도 체외 배양 표현형 변화에서, ABC 및 EMT 레귤레이터 대응 핵 전위가 관찰되었다.도 3은 시험 관내 배양 소 CECs의 EnMT 프로세스에 타틴 효과, 광범위한 스펙트럼 MMP 억제제를 나타낸다.도 도 4는 전방 내 주사 하였다 cryoinjury 후 쥐의 외부 눈 사진을 포함한다.도 5는, R의 면역 염색을 나타낸다 각막 버튼에 그 전방 내 주입 한 다음 cryoinjury 후 ABC에 대해 항체를 사용 하였다. ABC의 핵 전좌는 PBS 그룹에서 관찰되었으며 크게의 Wnt / β 카테닌 시그널링 및 EnMT 과정의 활성화를 나타내는 bFGF의 군에서 증가 하였다. 의 bFGF의 전방 내 주입 타틴 주입 한 다음 후, ABC의 핵 염색 타틴의 EnMT 억제 효과를 시사 감소했다.
그림 1 :. 체외 배양 소 CECs이 배양 접시에 접종 한 후, 소 CECs가 처음 등장의 위상 콘트라스트 이미지가 섬유 아세포와 같은 일 3 6. 그들은 = 하루 9 스케일 바의 완전한 합류에 도달하면 더 육각되었다 50 μm의. 3 복제의 대표 이미지.4329fig1large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 :. 활성 β-catenin이 : 체외 배양 소 CECs 소 CECs, ABC, 달팽이와 민달팽이의 핵 전위의 체외 배양 동안 하루 14 ABC를 통해 발견 된의 면역 염색. 스케일 바 = 100 μm의. 3 복제의 대표 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 :. 또는 다른 세포 합류 수준에서 타틴없이 체외 배양 소 CECs의 면역 염색 면역 염색 악마ABC는 달팽이와 민달팽이는 또는 그러나 일 3. 타틴 10 μM없이 소 CECs의 핵에 분명 있다고 보이는 것, 타틴은 크게 9 일 소 CECs의 핵 ABC, 달팽이의 염색 및 슬러그 감소 완전히 합류했다. 스케일 바 = 100 μm의. 3 복제의 대표 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 :. cryoinjury 후 지정된 시점에서 쥐의 외부 눈 사진, 3 일 연속 cryoinjury 다음은, 쥐가 0.02 ml로, 하루 6 일 일 3. NG / ㎖의 bFGF PBS의 0.02 ml의 50의 전방 내 주입 하였다 PBS가 다른 2 GROU 주입 된 반면, 10 μM 타틴는 bFGF에 / 마리 그룹에 각막 주입PS (N = 9 각 그룹에서). 타틴 더 감소 각막 부종 혼자의 bFGF와 비교. N = 각 그룹의 9 반면 외부의 눈 사진은, bFGF를 주입 한 후 각막 부종을 감소 밝혔다. 스케일 바 = 1mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5. 9 일에 수확 된 쥐의 각막 버튼의 쥐 각막 버튼의 면역 염색 면역 염색은 PBS 그룹에서 ABC의 작은 핵 염색을 밝혔다. bFGF를 그룹에서 크게 bFGF를 / 마리 그룹에서 감소 된 ABC의 광범위한 핵 염색이 있었다. 스케일 바 = 100 μm의. 생의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오의 그림입니다.
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Discussion
CECs는 세포 증식 동안 EnMT를 받아야하는 그들의 성향 알려져있다. 치료 목적 EnMT 처리를 억제하기위한 전략을 개발하려면 EnMT기구의 완전한 이해가 필요하다. 우리는 EnMT, 체외 배양 모델 쥐의 각막 내피 세포의 cryoinjury 모델, 즉 소 CEC를 조사하기 위해이 모델을 설명했다. 우리의 결과는 두 모델의 EnMT 과정을 보여 주었다. 또한, 타틴의 EnMT 억제 효과는이 두 모델은 동일한 메커니즘을 공유 할 것을 제안, 두 모델에서 재현되었다.
체외 배양 모델의 소 CEC는 조작의 용이성을 제공합니다. 또한, 이전의 연구 (17, 18)에 사용되는 체외 배양 모델에서 인간 영장류 또는 CEC 비해 소의 눈을 더 크고 더 확보하기 쉽게하고, 따라서 더 CECs 사용할 수있다. 우리의 연구에서, 우리는 지역 도살장에서 세포핵이 제거 된 소의 눈을 인수했다. 때문에 Fres의의 소 눈의 시간 자연, 수확 소 CECs의 정확한 수는 눈 당 약 1 × 10 5 세포에서 변동 될 수 있습니다. 반대로 정상적인 인간 각막 CECs 수 안구 당 약 3 × 105이다. 이 숫자는 연구 수준의 각막에 낮과 이식 후 잔여 각막 림에 더 낮은 것입니다. 채취 절차 동안 조작 더 얻어진 세포의 수를 감소시킬 것이다. 또한, 소 CECs이 증식 할 수 있고 자발적으로 EnMT를 받아야; 따라서, 체외 배양 모델에서 소 CEC는 EnMT 메커니즘을 조사 및 타틴 같은 EnMT 억제 화학 물질을 스크리닝에 유용하다. 이러한 CECs의 증식 능력 종의 관련 차이에 대한 우려가 남아 있지만, 우리의 결과는 소 CECs의 EnMT 신호 경로가의 Wnt / β-catenin이 18, 19의 활성화를 포함하여 인간의 CECs의 것과 유사하다는 것을 보여 주었다.
소 CECs의 분리 동안 텐트 ">는 데스 메 막을 박리하는 것이 중요하다. 일부 소 눈에서 데스 메 막을 박리 데스 메막에 과도한 간질 조직을 선도, 각막 기질과 밀착성을 가질 수있다. 또한 트립신이 될 수 있습니다 세포의 순도에 영향을주고, 따라서 실험 결과. 본 연구에서 우리는 현미경 신중 데스 메 막 박리 각막 섬유 아세포로 변환. 상기 세포의 순도를 보장하기 위해 각막 실질 세포의 박리는, 먼저 6에서 수확 된 세포를 배양 세포 합류 할 때까지 cm 접시. 세포 모양의 육각형했다 만 그들은 더 실험에 사용 하였다.또한 체외 배양 모델에서 소 CEC의 연구 결과를 입증하기 위해, 우리는 이전의 연구 (20, 21)에서 채택 된 쥐의 각막 내피 세포의 cryoinjury 모델을 사용했다. cryoinjury 후, 쥐 CECs은 재생, manife 동안 EnMT을 시행이 Wnt / β-catenin이 신호의 활성화는 CEC 재생하는 동안 종 가운데 보존되어있는 것을 나타내는 활성 β-catenin이의 핵 전좌에 의해 STED. 낮은 CEC 기능은 분명 각막 부종을 초래하기 때문에 또한,이 모델은 CECs의 기능을 조사하는 데 유용합니다. 이러한 초음파 생체 현미경, 전 안부 빛 간섭 단층 촬영 및 공 초점 현미경 등의 장비와 결합, 각막 두께를 정량적으로 평가하여 CEC 기능을 반영 할 수있다.
CECs의 재생을 자극하고 상처 치유 후 EnMT을 억제하기 위해, 우리는 타틴 주입 다음의 bFGF의 전방 내 주사를 투여. 치료는 크게 각막 부종의 정도를 감소시켰다. 이전의 연구는 노치 억제제 (21, 22) 등 ROCK 저해제 및 EnMT 억제 제제로서 CEC 성장을 자극 에이전트의 국소 응용 프로그램을 사용하고 있습니다. 그러나, CEC에 약물의 침투 누워ER은 치료 효능 (23)에 영향을 미칠 수있는 각막 상피 세포 및 기질에 의해 제한된다. 국소 도포는 달리, 전방 내 주사는 직접 전방 내로 약물을 도입하여 각막 내피 세포에 직접 액세스 할 수있다. 따라서, 화학 물질의 성장을 자극하고 EnMT이 억제 효과는 다음 cryoinjury unbiasedly 평가 될 수있다. 우리의 연구에서는 전방 내 주입 전 안압을 낮추기 위해 전방 천자를 시행 하였다. 천자없이, 안압의 급격한 증가는 각막 부종 또는 바늘 관을 통해 홍채라도 탈출시킨다. 부드럽게 상처를 밀봉하고 안구 감염을 예방 바늘 철수 보조 동안 기관을 압축.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| trypsin | ThermoFisher Scientific | 12604-013 | |
| Dulbecco’s modified Eagle medium and Ham's F12 medium | ThermoFisher Scientific | 11330 | |
| fetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | 26140-079 | |
| dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| human epidermal growth factor | ThermoFisher Scientific | PHG0311 | |
| insulin, transferrin, selenium | ThermoFisher Scientific | 41400-045 | |
| cholera toxin | Sigma | C8052-1MG | |
| gentamicin | ThermoFisher Scientific | 15750-060 | |
| amphotericin B | ThermoFisher Scientific | 15290-026 | |
| paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 111219 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| bovine serum albumin | Sigma | A7906 | |
| marimastat | Sigma | M2699-25MG | |
| anti-active beta-catenin antibody | Millpore | 05-665 | |
| anti-snail antibody | Santa cruz | sc28199 | |
| anti-slug antibody | Santa cruz | sc15391 | |
| goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody | ThermoFisher Scientific | A-11001 | for staining of ABC of bovine CECs |
| goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody | ThermoFisher Scientific | A-11003 | for staining of ABC of rat corneal endothelium |
| goat anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody | ThermoFisher Scientific | A-11008 | for staining of snail and slug of bovine CECs |
| antibody diluent | Genemed Biotechnologies | 10-0001 | |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole | ThermoFisher Scientific | D1306 | |
| mounting medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| laser scanning confocal microscope | ZEISS | LSM510 | |
| xylazine | Bayer | N/A | |
| tiletamine plus zolazepam | Virbac | N/A | veterinary drug |
| proparacaine hydrochloride ophthalmic solution | Alcon | N/A | veterinary drug |
| 0.1% atropine | Wu-Fu Laboratories Co., Ltd | N/A | clinical drug |
| 0.3% gentamicin sulfate | Sinphar Group | N/A | clinical drug |
| basic fibroblast growth factor | ThermoFisher Scientific | PHG0024 | clinical drug |
References
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