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Developmental Biology

En vitro y en modelos in vivo para estudiar la transición del endotelio corneal-mesenquimal

Published: August 20, 2016 doi: 10.3791/54329
Automatic Translation
1,2, 3, 3, 1, 3, 2,4, 3,4
1Department of Ophthalmology, Far Eastern Memorial Hospital, 2Institute of Clinical Medicine, National Taiwan University, 3Department of Ophthalmology, National Taiwan University Hospital, 4College of Medicine, National Taiwan University

Summary

Un cultivo primario de células endoteliales corneales bovinas se utilizó para investigar el mecanismo de la transición endotelial-mesenquimal corneal. Además, se utilizó un modelo de endotelio corneal criolesión rata para demostrar transición endotelial-mesenquimal corneal in vivo.

Protocol

Todos los procedimientos seguidos en este estudio estaba de acuerdo con la Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología para el Uso de Animales en Investigación Oftálmica y Visión y fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional del Hospital de la Universidad Nacional de Taiwán.

1. Aislamiento, cultivo primario de preparación, y la inmunotinción de bovino CEC

  1. Adquirir nuevos ojos bovinos de un matadero local.
  2. Desinfectar los ojos en una solución de povidona yodada al 10% w / v durante 3 min. Lavarlas con la solución salina (PBS) tamponada con fosfato.
  3. Se recoge el botón corneal con un escalpelo y tijeras en condiciones estériles. membrana de la cáscara de la de Descemet con pinzas bajo un microscopio de disección (tenga en cuenta que en este estudio, los ojos bovinos fueron enucleados por un matadero local, por lo tanto, el primer procedimiento del estudio fue la desinfección de los ojos preenucleated en el laboratorio).
  4. Incubar la membrana de Descemet en 1 ml de trypsin a 37 ° C durante 30 min. Recoge los países de Europa central bovina por centrifugación a 112 xg durante 5 min. Resuspender las células en 1 ml de medio suplementado epitelial hormonal (SHEM) que contiene volúmenes iguales de HEPES-tamponada medio de Dulbecco modificado de Eagle y medio F12 de Ham, suplementado con suero bovino fetal al 5%, 0,5% de sulfóxido de dimetilo, 2 ng / ml de la epidermis humana factor de crecimiento, 5 mg / ml de insulina, 5 mg / ml de transferrina, 5 ng / ml de selenio, 1 nmol / l de la toxina del cólera, 50 mg / ml de gentamicina y 1,25 mg / ml de anfotericina B.
  5. Sembrar las células (aproximadamente 1 x 10 5 células por ojo) en una placa de 6 cm. Cultura en el Shem. Incubar la placa a 37 ° C en una atmósfera de 5% de CO2 en aire. Cambiar el medio de cultivo cada 3 días.
  6. Cuando las células alcanzan la confluencia, lavarlos con PBS y se incuban en 1 ml de tripsina a 37 ° C durante 5 min. Recójalas por centrifugación a 112 xg durante 5 min. Vuelva a suspender el sedimento celular en 1 ml de la SHEM. Contar las células en un hemocitómetro. Sembrar las células en los portaobjetos de cubierta en una densidad de 1 x 10 4 por pocillo en una placa de 24 pocillos, y cultivar las células en la SHEM. Para investigar el efecto de supresión de EnMT marimastat, se incuban las células en SHEM con 10 M de marimastat añadieron al medio de cultivo, y cambiar el medio de cultivo cada 3 días.
  • Fijar las células en un punto de tiempo indicado con 250 l de paraformaldehído al 4%, pH 7,4, durante 30 minutos a temperatura ambiente. Permeabilizar con 250 l de 0,5% de Triton X-100 para 5 min. Bloque con 10% de albúmina de suero bovino durante 30 min.
  • Se incuban las células con anticuerpos primarios contra activa beta-catenina (ABC), caracoles, babosas y una noche a 4 ° C. La dilución de los anticuerpos primarios utilizados es 1: 200. Los anticuerpos se diluyeron en diluyente de anticuerpo compuesto por PBS 10 mM, 1% w / v albúmina de suero bovino, y 0,09% w / v de azida de sodio.
  • Lavar las células dos veces con PBS durante 15 min, y se incuba lam con el anticuerpo conjugado con Alexa Fluor-secundario (1: 100 en diluyente de anticuerpo) a temperatura ambiente durante 1 hr.
  • Contratinción el núcleo de la célula, cubriendo las células con 2 mg / ml de 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol, se lavan las células dos veces con PBS durante 15 min, y montarlos con solución de montaje anti-decoloración.
  • Obtener imágenes de inmunofluorescencia en las longitudes de onda de excitación de 405 y 488 nm mediante el uso de un microscopio confocal de barrido láser con 20X aumento del objetivo.

    • 2. Modelo de rata de la córnea del endotelio lesión criogénica y intracameral Inyección

    1. Anestesie 12 semanas de edad ratas Sprague-Dawley macho con inyecciones intramusculares de 2% de xilazina (5,6 mg / kg) y tiletamina más zolazepam (18 mg / kg). pellizcar suavemente la piel de los animales para confirmar la anestesia adecuada en ausencia de contracciones de la piel.
    2. Inculcar una gota de clorhidrato de proparacaína 0,5% en el ojo derecho de cada rata para minimizar el dolor ojo y el reflejo de parpadeo. Instilartetraciclina pomada para el ojo izquierdo para evitar la sequedad de la córnea.
    3. Se enfría una sonda de acero inoxidable (diámetro = 3 mm) en nitrógeno líquido. Aplicar la sonda de acero inoxidable a la córnea central del ojo derecho durante 30 segundos. inculcar frecuentes PBS para el ojo derecho durante el procedimiento para evitar la sequedad de la córnea.
    4. Inculcar 0,1% atropina y 0,3% de sulfato de gentamicina inmediatamente después de criolesión y una vez al día para aliviar el dolor ocular resultante de espasmo ciliar y para prevenir la infección.
      1. Después del procedimiento, mantienen las ratas caliente usando una lámpara de calor, y observar su recuperación cada 15 minutos después de la anestesia hasta recuperar el control del motor. Además, aplique una pomada de tetraciclina en el ojo derecho para evitar la sequedad de la córnea durante el período de recuperación.
    5. Repetir la lesión criogénica de la córnea durante 3 días consecutivos.
    6. Para la entrega de marimastat o bFGF en la cámara anterior de los ojos de rata, anestesiar las ratas como se describió anteriormente. Inculcar una gotade clorhidrato de proparacaına 0,5% en el ojo derecho para minimizar el dolor de los ojos y el reflejo de parpadeo.
    7. El riego de la superficie ocular con PBS estéril. Realizar paracentesis de la cámara anterior con un microscopio de operación mediante la inserción de una aguja 30 G unida a una jeringa de 1 ml en la córnea clara paralimbales en un plano por encima y paralelo al iris.
    8. Girar la aguja de bisel hacia arriba y presione ligeramente la herida corneal para drenar un poco de humor acuoso y reducir la presión intraocular. Inyectar 0,02 ml de la droga intracameral. comprimir suavemente el trayecto de la aguja con una punta de algodón durante la retirada de la aguja.
    9. Fotografiar la parte externa del ojo en un punto de tiempo indicado bajo el microscopio quirúrgico.

    3. Explotación del Rat botón corneal y Inmunoticción

    1. Para practicar la eutanasia a las ratas, los coloca en una cámara de la eutanasia y de infundir 100% de CO 2 a una velocidad de llenado del 10-30% del volumen de la cámara por minuto. Mantener CO 2 de infusión para unaminuto adicional después de falta de respiración y color de los ojos se desvaneció.
    2. Penetrar en el ojo de la rata en el limbo con una cuchilla afilada. Cortar las córneas con tijeras corneales a lo largo del limbo. Aplanar las córneas en una diapositiva. Hacer incisiones radiales adicionales si las córneas se encogen.
    3. Fijar las córneas con 250 l de paraformaldehído al 4%, pH 7,4, durante 30 minutos a temperatura ambiente. Permeabilizar con 250 l de 0,5% de Triton X-100 durante 5 min, y se bloquea con 10% de albúmina de suero bovino durante 30 min.
    4. Incubar las córneas con anticuerpos primarios contra ABC durante la noche a 4 ° C con una dilución de 1: 200 en diluyente de anticuerpo. Lavar las córneas dos veces con PBS durante 15 min, y se incuba con el anticuerpo secundario (1: 100 en diluyente de anticuerpo) a temperatura ambiente durante 1 hr. Contratinción el núcleo de la célula, cubriendo las células con 2 mg / ml de 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol, y lavar las células dos veces con PBS durante 15 min.
    5. Montar las córneas en la solución de montaje protectora de la fluorescencia. Transmisión exteriorner las imágenes de inmunofluorescencia en longitudes de onda de excitación de 405 nm y 561 con un microscopio confocal de barrido láser de 20 aumentos objetivo.

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    Representative Results

    Después del aislamiento de CECs de la especie bovina, las células se cultivaron in vitro. La Figura 1 presenta las imágenes de contraste de fase de los países de Europa central de la especie bovina. La forma hexagonal de las células en confluencia indica que las células no estaban contaminadas por los fibroblastos del estroma corneal durante el aislamiento celular. Figura 2 representa la inmunotinción que se realizó utilizando anticuerpos contra ABC, caracol, y babosa en un punto de tiempo indicado. Aparte de los cambios fenotípicos en el cultivo in vitro, se observó una translocación nuclear correspondiente de la ABC y de EMT reguladores. Figura 3 ilustra el efecto de marimastat, un inhibidor de MMP de amplio espectro, en el proceso de EnMT de los países de Europa central bovinas cultivadas in vitro. La figura 4 comprende las fotografías externos del ojo de ratas después de criolesión seguido de la inyección intracameral. la Figura 5 muestra la inmunotinción de la r en el botón corneal que se realizó utilizando anticuerpos contra el ABC después de lesión criogénica seguido de la inyección intracameral. Se observó la translocación nuclear de ABC en el grupo de PBS y se incrementó significativamente en el grupo de bFGF, lo que indica la activación de la señalización / β-catenina Wnt y el proceso EnMT. Después de la inyección intracameral de bFGF seguido por inyección marimastat, la tinción nuclear de ABC fue disminuida, lo que sugiere el efecto de inhibición de EnMT de marimastat.

    Figura 1
    Figura 1:. Imágenes de contraste de fase de CECs bovinas cultivadas Después de ser sembradas en la placa de cultivo, la CECs bovina aparecieron inicialmente in vitro similar a fibroblastos en los días 3 y 6. Se volvieron más hexagonal al llegar a la confluencia completa en días 9. Barra de escala = 50 micras. Imágenes representativas de 3 repeticiones.4329fig1large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

    Figura 2
    Figura 2: La inmunotinción in vitro de los CEC bovinas cultivadas Durante el cultivo in vitro de los CEC bovina, la translocación nuclear de ABC, caracoles, babosas y se detectó hasta el día 14. ABC:. Activa β-catenina. Barra de escala = 100 micras. Imágenes representativas de 3 repeticiones. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

    figura 3
    Figura 3:. Inmunotinción de los CEC bovinas cultivadas in vitro con o sin marimastat en los diferentes niveles de confluencia celular Inmunoticción demoniostrado que la cadena ABC, caracoles, babosas y eran evidentes en el núcleo de los países de Europa central de la especie bovina con o sin 10 mM de marimastat en el día 3. Sin embargo, marimastat redujo significativamente la tinción nuclear de ABC, caracoles, babosas y el día 9, cuando los países de Europa central de la especie bovina entró en pleno confluente. Barra de escala = 100 micras. Imágenes representativas de 3 repeticiones. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

    Figura 4
    Figura 4:. Fotografías externos del ojo de ratas en los puntos de tiempo indicados después de criolesión Siguiendo criolesión durante 3 días consecutivos, las ratas se sometieron a inyección intracameral de 0,02 ml de PBS o 50 ng / ml bFGF en el día 3. En el día 6, 0,02 ml de 10 M marimastat intracameral se inyectó en el grupo de bFGF / Mari, mientras PBS se inyectó en los otros 2 groups (n = 9 en cada grupo). Fotografías de los ojos exteriores reveló reducen el edema corneal después de la inyección de bFGF, mientras que marimastat reducido aún más edema corneal en comparación con bFGF solo. N = 9 en cada grupo. Barra de escala = 1 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

    Figura 5
    Figura 5:. La inmunotinción de los botones de la córnea de rata inmunotinción de los botones de la córnea de ratas que fueron cosechados en el día 9 reveló poca tinción nuclear de ABC en el grupo PBS. En el grupo de bFGF, hubo extensa tinción nuclear de ABC, que se redujo significativamente en el grupo bFGF / Mari. Barra de escala = 100 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de this figura.

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    Discussion

    CECs son conocidos por su propensión a sufrir EnMT durante la proliferación celular. Para desarrollar estrategias para suprimir el proceso EnMT con fines terapéuticos, es necesario un conocimiento profundo del mecanismo EnMT. Describimos 2 modelos para investigar EnMT, a saber, la CCA bovina en el modelo de cultivo in vitro y la rata modelo de lesión criogénica endotelio corneal. Nuestros resultados demuestran el proceso EnMT en ambos modelos. Además, el efecto de supresión de EnMT de marimastat se reprodujo en ambos modelos, lo que sugiere que estos 2 modelos comparten el mismo mecanismo.

    La CCA bovina en el modelo de cultivo in vitro ofrece facilidad de manipulación. Además, en comparación con la CCA humano o primate en modelos de cultivo in vitro empleadas en estudios previos 17,18, ojos bovinos son más grandes y más fácil de adquirir, y por lo tanto tienen más CECs disponible. En nuestro estudio, hemos adquirido los ojos bovinos enucleados de un matadero local. Debido a las fres h naturaleza de los ojos bovinos, el número exacto de países de Europa central bovina cosechado está sujeto a variación, en aproximadamente 1 x 10 5 células por ojo. Por el contrario, el número de países de Europa central humanos en una córnea normal es de aproximadamente 3 x 10 5 por ojo. Este número es menor en las córneas de estudio de grado y es aún menor en corneales residuales después del trasplante. Manipulaciones durante el procedimiento de recolección reducirán aún más el número de células obtenidas. Por otra parte, los CEC de vacuno pueden proliferar y sufrir EnMT de forma espontánea; Por lo tanto, la CCA bovina en el modelo de cultivo in vitro es útil en la investigación del mecanismo de EnMT y cribado químicos EnMT-supresores, como marimastat. Aunque sigue habiendo preocupación con respecto a las diferencias entre especies relacionadas, tales como la capacidad proliferativa de CECs, nuestros resultados demostraron que la vía de señalización EnMT de CECs bovina es similar a la de CECs humanos, incluyendo la activación de Wnt / β-catenina 18,19.

    tienda "> Durante el aislamiento de los países de Europa central bovina, descamación de la membrana de Descemet es crítica. En algunos ojos bovinos, la membrana de Descemet puede tener adherencia apretado con el estroma de la córnea, dando lugar a tejido estromal excesiva en la membrana de Descemet pelado. Además tripsinización puede dar lugar a la liberación de los queratocitos estromales que se transforman en fibroblastos corneales, que afectan a la pureza de células y por lo tanto los resultados experimentales. en nuestro estudio, hemos pelar la membrana de Descemet cuidadosamente bajo un microscopio. Para garantizar aún más la pureza de células, que primero cultivaron las células cosechadas en un 6 cm plato hasta confluencia celular. Sólo cuando las células eran de forma hexagonal se utilizaron en experimentos adicionales.

    Para fundamentar aún más los resultados de la CCA bovina en el modelo de cultivo in vitro, se utilizó el modelo de lesión criogénica endotelio corneal rata adoptado en estudios previos 20,21. Después de lesión criogénica, los países de Europa central ratas se sometieron a EnMT durante la regeneración, manifested por la translocación nuclear de activo β-catenina, lo que indica que la activación de la señalización / β-catenina Wnt se conserva entre especies durante la regeneración de la CCA. Además, este modelo es útil en la investigación de la función de los países de Europa central porque la baja función CEC conduce a edema corneal evidente. En combinación con otros equipos, como el biomicroscopio de ultrasonidos, segmento anterior tomografía de coherencia óptica y microscopía confocal, grosor de la córnea puede ser evaluado cuantitativamente y por lo tanto reflejan función CEC.

    Para estimular la regeneración de CECs y suprimir EnMT después de la curación de la herida, se administró inyecciones intracamerales de bFGF seguido de la inyección marimastat. El tratamiento redujo significativamente la extensión del edema corneal. Estudios anteriores han utilizado la aplicación tópica de agentes que estimulan el crecimiento de la CCA, como inhibidor de ROCK, y agentes EnMT-supresores, tales como 21,22 inhibidor de Notch. Sin embargo, la penetración de los fármacos en el CCA yacíaer está limitada por el epitelio corneal y el estroma, que puede influir en la eficacia del tratamiento 23. En contraste con la aplicación tópica, inyección intracameral permite el acceso directo al endotelio corneal mediante la introducción de fármacos directamente en la cámara anterior. Por lo tanto, el efecto de estimulación del crecimiento y EnMT de supresión de productos químicos se puede evaluar unbiasedly siguiente criolesión. En nuestro estudio, se realizó la paracentesis de la cámara anterior para disminuir la presión intraocular antes de la inyección intracameral. Sin paracentesis, un aumento brusco de la presión intraocular provoca edema corneal o incluso prolapso del iris a través del tracto de la aguja. comprimir suavemente el tracto durante ayudas retirada de la aguja en el sellado de la herida y prevención de la infección intraocular.

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    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    trypsin ThermoFisher Scientific 12604-013
    Dulbecco’s modified Eagle medium and Ham's F12 medium ThermoFisher Scientific 11330
    fetal bovine serum ThermoFisher Scientific 26140-079
    dimethyl sulfoxide Sigma D2650
    human epidermal growth factor ThermoFisher Scientific PHG0311
    insulin, transferrin, selenium  ThermoFisher Scientific 41400-045
    cholera toxin Sigma C8052-1MG
    gentamicin ThermoFisher Scientific 15750-060
    amphotericin B ThermoFisher Scientific 15290-026
    paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 111219
    Triton X-100 Sigma T8787 
    bovine serum albumin Sigma A7906
    marimastat Sigma M2699-25MG
    anti-active beta-catenin antibody Millpore 05-665
    anti-snail antibody Santa cruz sc28199
    anti-slug antibody Santa cruz sc15391
    goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody ThermoFisher Scientific A-11001 for staining of ABC of bovine CECs
    goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody ThermoFisher Scientific A-11003 for staining of ABC of rat corneal endothelium
    goat anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody ThermoFisher Scientific A-11008 for staining of snail and slug of bovine CECs
    antibody diluent Genemed Biotechnologies 10-0001
    4',6-diamidino-2-phenylindole ThermoFisher Scientific D1306
    mounting medium Vector Laboratories H-1000
    laser scanning confocal microscope ZEISS LSM510
    xylazine  Bayer N/A
    tiletamine plus zolazepam Virbac N/A veterinary drug
    proparacaine hydrochloride ophthalmic solution Alcon N/A veterinary drug
    0.1% atropine Wu-Fu Laboratories Co., Ltd N/A clinical drug 
    0.3% gentamicin sulfate Sinphar Group N/A clinical drug 
    basic fibroblast growth factor ThermoFisher Scientific PHG0024 clinical drug 

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

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    Biología del Desarrollo No. 114 endotelio corneal mesenquimal metaloproteinasas de la matriz β-catenina N-cadherina inyección intracameral
    <em>En vitro</em> y <em>en</em> modelos <em>in vivo</em> para estudiar la transición del endotelio corneal-mesenquimal
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    Ho, W. T., Su, C. C., Chang, J. S.,… More

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