Introduction
Hensikten med denne studien var å utvikle en positronemisjonstomografi / beregnet tomografi (PET / CT) basert metode for å kvantifisere in vivo, sanntid opptak av glukose fra blodstrømmen inn i spesifikke vev hos mus. Dette ble oppnådd ved anvendelse av 18 F-merkede fluordeoksyglukose (FDG) for å måle glukoseopptak og kinetisk modellering for å estimere forekomsten av 18F-FDG-opptak fra plasma til det intracellulære rom, transporthastigheten fra intracellulære rom til plasma og hastigheten 18F-FDG fosforylering.
I gnagere, har 18F-FDG blitt brukt i pre-klinisk vurdering av en rekke kreftbehandlinger 1, studier av tumorprogresjon 2 og tumor metabolisme 3 samt avbildning av brunt fettvev 4, neuroinflamation 5 og hjernemetabolisme 6
Tradisjonelle metoder for å undersøke vevet spesifikt opptak av glukose i mus og rotter () innbefatter generelt behandling med 2-deoksyglukose radiomerket med enten 3-H eller 14 C etterfulgt av eutanasi, samling vev og måling av radioaktivitet i hvert vev til 7. Anvendelse av PET / CT gir mulighet for ikke-invasiv bestemmelse av glukoseopptak og metabolisme i flere organer og regioner samtidig i levende dyr. I tillegg, som eutanasi er ikke et krav, er denne teknikken er egnet for anvendelse i langsgående studier.
Type 2 diabetes mellitus (diabetes mellitus type 2) er karakterisert ved forstyrret glukosemetabolismen og hyperglykemi sekundært til redusert vev respons overfor insulin (insulinresistens) og den manglende evne av pankreas-cellene til å produsere tilstrekkelige mengder av insulin 8. Kinetisk analyse av glukoseopptak og metabolisme kan gi viktig innsikt ivirkningsmekanismen og effekten av terapeutiske inngrep, samt at for avansert overvåking av sykdomsprogresjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer beskrevet i denne studien ble godkjent av Sydney Local Health District og University of Sydney Animal etiske komiteer og fulgte guiden NIH for omsorg og bruk av forsøksdyr, åttende utgave (2011).
1. Dyrepreparat
Merk: I denne protokollen hann db / db-mus (BKS.Cg- Dock7 m + / + Lepr db / J) ble opprettholdt i gruppe boliger med ad libitum adgang til Chow og vann inntil 6 ukers alder. På tidspunktet for avbildning, mus veide ~ 30 g. Alle mus som brukes i denne protokoll hadde fastende blodglukosenivåer mellom 10 og 14 mmol / l.
- Om nødvendig, rask mus. I det foreliggende eksempel, faste musene i 5 timer før den eksperimentelle prosedyre.
- Behandle mus med det ønskede middel (f.eks legemiddel, protein, peptid) før begynnelsen av bildebehandling. I dette eksempel administrere en subkutan injeksjon av insulin (3U / kg humant insulin) eller tilsvarende volum PBS, 30 min før starten av bildebehandling.
2. Sett opp arbeidsflyt
MERK: Denne protokollen ble gjennomført på en PET / CT-skanner. Erverve PET data først, fulgt av kjøp av CT-data.
- PET innstillinger:
- Velg isotop som 18F, sett scan varighet til 3600 s, og øvre og nedre nivå energi diskriminering til 350 keV - 650 keV (standard) med et sammentreff tidsvindu fra 3.432 ns (standard). Histogram liste-modusdata i 16 rammer (6 x 10 s, 4 x 60 sek 1 x 300 s, 5 x 600 s) for perioden 0 - 60 min etter at sporstoffinjeksjons. Rekonstruere utslipp sinograms ved hjelp av 2D-FBP med en zoom 1,5.
MERK: rekonstruerte bilder besto av 16 dynamiske rammer, hver med 128 x 128 x 159 vokslene og en voxel størrelse på 0,52 x 0,52 x 0,796 mm 3.
- Velg isotop som 18F, sett scan varighet til 3600 s, og øvre og nedre nivå energi diskriminering til 350 keV - 650 keV (standard) med et sammentreff tidsvindu fra 3.432 ns (standard). Histogram liste-modusdata i 16 rammer (6 x 10 s, 4 x 60 sek 1 x 300 s, 5 x 600 s) for perioden 0 - 60 min etter at sporstoffinjeksjons. Rekonstruere utslipp sinograms ved hjelp av 2D-FBP med en zoom 1,5.
- CT innstillinger:
- Tilen hel legeme CT, setter strøm på 500 A, spenningen på 50 kV, eksponeringstid på 500 ms og 200 fremspring i løpet av en 360 rotasjon. Still detektorfelt (FOV) til 30722048, rekke bed stillinger til 3 (for å dekke hele PET FoV range), overlapping mellom sjiktposisjoner = 30,234713% og detektor binning til 4.
MERK: CT rekonstruksjon ble utført ved bruk av konus stråle-tomografi bilderekonstruksjon programvare med HU kalibrering, bilineær interpolasjon og Shepp-Logan filter.
- Tilen hel legeme CT, setter strøm på 500 A, spenningen på 50 kV, eksponeringstid på 500 ms og 200 fremspring i løpet av en 360 rotasjon. Still detektorfelt (FOV) til 30722048, rekke bed stillinger til 3 (for å dekke hele PET FoV range), overlapping mellom sjiktposisjoner = 30,234713% og detektor binning til 4.
- 18F-FDG:
- Størrelsesorden tilstrekkelig til 18F-FDG (for eksempel 450 MBq i 0,5 ml) fra en lokal leverandør for å ankomme ~ 30 minutter før den første injeksjonen. Alikvoter og fortynne den 18F-FDG, slik at dyrene får ~ 10 MBq av 18F-FDG i et sluttvolum på 0,1 ml.
3. Imaging Protocol
- Tørk av induksjonskammeret og avbildning seng med 80% (v / v) etanol for å opprettholde aseptiske betingelser. Place musen i en induksjonskammeret og bedøve med 5% isofluran i oksygen.
- Plasser mus på en avbildnings seng utstyrt med en elektrisk varmepute for å opprettholde kroppstemperatur og en presisjonsfordamper nesekonus for å levere isofluran (vedlikehold, 1,5 til 2%) ved en strømningshastighet på 1 l / min. Påfør oftalmisk salve på øynene for å hindre tørrhet mens under narkose.
- Før musen i en utsatt stilling på en sensorpute for å overvåke puste og sikre en tilstrekkelig plan av anestesi blir opprettholdt.
- Varm halen ved hjelp av en varmepakning i 1 - 2 minutter for å utvide den laterale halevenen. Kateterisere den laterale halevene ved å sette inn en 30-gauge nål inn i den laterale halevenen. Fest nålen på plass med kirurgisk lim og fest kateteret.
- Belastningsavbildningssjiktet inn i skanneren og beveger seg i sjiktet gjennom maskinen, slik at kateteret kan nås fra baksiden av maskinen.
- Feste kateteret til 18F-FDG sprøyte i et syringe driver. Beregne det nøyaktige 18F-FDG dose (10 MBq) basert på aktivitet i sprøyten før injeksjon og volumet som skal administreres (<100 ul, injiseres i løpet av 10 s).
- For å minimere virkningen av anestesi på variasjon av glukoseopptaket, sikre en konstant tid mellom induksjon av anestesi og injeksjon av 18F-FDG (for eksempel 30 minutter).
- Påbegynne PET scan umiddelbart før injeksjon av 18F-FDG. Etter endt PET scan (3600 s), utføre et CT-scan (~ 10 min) for å tillate ko-registrering av radioaktivitetsopptak med vev.
- Bevege avbildnings sengen til utgangsstillingen, fjernes dyret fra sengen.
- På dette punktet avlive dyret eller la den komme:
- For eutanasi, utføre cervikal dislokasjon mens det fortsatt er under narkose og samle organer av interesse for senere analyse.
- Dersom slik at musen for å gjenvinne, plassere musen i enkelt hus på en varmepute ellerforan en varmelampe. Overvåke mus før den har gjenvunnet nok bevissthet til å opprettholde sternal recumbency. Tillat musen for å gjenvinne i 1 time før retur til gruppe boliger.
4. PET Bildebehandling
MERK: Bilde rekonstruksjon ble utført ved hjelp av oppkjøp arbeidsplassen programvare v1.5.0.28 og analyse i forskning arbeidsplassen programvare v4.2.
- Co-register CT og PET-bilder og at innrettingen er korrekt i alle 3 dimensjoner.
- I 'Fil' -menyen, velg 'Folder Search / Import' og velg mappen som inneholder dataene. Velg ønskede PET- og CT-data og klikk på fanen Generelt Analysis ".
- Sortering dataene slik at CR er betegnet 'kilde' og PET er betegnet 'Target'. I 'Arbeidsflyt' -menyen, velg 'Påmelding'. Hvis bildene krever justering for å være riktig co-registrert, bruke verktøyene i the 'Registrering' menyen.
- I 'Arbeidsflyt' -menyen, velg 'ROI Kvantifisering'.
- Bruk 'Pan' og 'zoom' funksjoner i 'Bilde-kategorien for å finne ønsket region. I 'Verktøy' -menyen, velg 'Opprett' -fanen og klikk på pensel ikonet. Tegn ROI på bildet
- Pakk tidsaktivitetskurver ved å velge 'Lagre ROI Kvantifisering' fra 'Lagre' -menyen. Lagre dataene som en CSV-fil.
- Kvantifisere radioaktivitetsopptak som Bq pr cm3 av vev. Konvertere verdier inn i prosentandel av injisert dose pr cm3 (% ID / cm3) ved å laste inn CSV-filen til et regneark.
5. Input Function
- For å korrigere for systemet punktspredefunksjonen, dekonvolvere den estimerte system PSF til 5 iterasjoner ved hjelp av reblurred Van Cittert dekonvolveringsmetoden som tidligere beskrevet ni.
MERK: Dette er nødvendig på grunn av den lille størrelsen på vena cava i en mus. - Bruk legg dekonvolvering bilder for å frembringe en blodinngangsfunksjon tid-virkningskurve slik som beskrevet ovenfor.
6. Kinetic Modellering
MERK: FDG to-vevsområde modellen (figur 1) krever plasma inngangsfunksjon.
- Konverter blodet inngangsfunksjon i CSV-filen til plasmaet inngangsfunksjonen ved hjelp av følgende ligning 10: Input_plasma = Input_blood x (0,386 e - 0.191t + 1,165).
- I den kinetiske modelleringsverktøy klikk 'Kinetic' -knappen. Importere vev og plasma total aktivitet teller CSV-filer i den kinetiske modellverktøyet ved å velge 'Last Time Aktivitet Curve' fra 'Meny'.
- I "Model-menyen velger du 2 vevsområder. Sørg for at boksen ved siden av k4 er opphevetog angi en verdi på 0. For den første montering, fjerner merket for vB (blodvolumfraksjon) og angi en verdi på 2%.
- Klikk 'Tilpass gjeldende område'. Korriger ekstrahert regionen av interesse for dispergering 11, 12. Oppnå dette ved å minimalisere Chi-kvadratverdien for den FDG modell for forskjellige sprednings tider.
- Utføre en annen form ved hjelp av flytende BB-verdi (i boksen ved siden av boksen for BB) og den optimaliserte dispersjonen verdi for å beregne de regionale hastighetskonstantene (k 1 -k 3). Beregn den regionale tilstrømningen konstant som Ki = (k 1 x k 3) / (k2 + k3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi har tidligere brukt db / db musemodell for å undersøke effekten av å øke plasma apoA-I nivåer på kinetikken av glukoseopptak og metabolisme 13. I denne studie benyttet vi db / db-mus behandlet med insulin for å demonstrere anvendbarheten av PET / CT-avbildning for å overvåke opptaket av 18F-FDG fra plasma til gastrocnemius muskelen i sanntid.
Seks uker gamle db / db-mus ble bedøvet og behandlet med 3 U humant insulin / kg, eller tilsvarende volum PBS via subkutan injeksjon 30 minutter før starten av PET-skanning. Mus mottok 10 MBq av 18F-FDG via intravenøs injeksjon og opptak måles ved hjelp av PET i 60 min. En CT-skanning ble utført for anatomisk referanse.
Regioner av interesse ble trukket på vena cava og gastrocnemius muskelen ved hjelp av CT-bilder (Figur 2). Behandling av db / db-mus med økt insulin i den 18F-FDG-aktivitet i gastrocnemius ROI over innhentingstiden periode (figur 3A). Resultatene oppnådd for vena cava ROI verdiene ble omdannet fra blod til plasma-verdier, og ble ikke endret ved behandling med insulin i insulinbehandlede mus i forhold til kontroll (figur 3B).
Tidsvirkningskurver ble fylt i den kinetiske modelleringsverktøy for beregning av kinetiske parametre. Data ble innledningsvis montert på en to-vevsområde metode med k 4 = 0 med et V b (blodvolumfraksjon) verdi på 2% for å beregne spredningsverdier (80 s og 70 s for PBS og insulinbehandlede mus, henholdsvis). Montering ble deretter utført ved anvendelse av de ovennevnte spredningsverdiene og en flytende Vb verdi.
Ingen signifikant forskjell i prisen på 18 F-FDG transport fra det arterielle plasma i den intracellulære rom (k 1), eller fra det intracellulære rom til plasma (k 2) ble observert i insulin-behandlede mus sammenlignet med kontrollgruppen (tabell 1). Hastigheten av 18F-FDG-fosforylering (k 3) var signifikant økt i insulinbehandlede mus (7,06 ± 6,60 x 10 -3 vs 2,26 ± 0,72 x 10 -2 min -1 for henholdsvis PBS og insulinbehandlede grupper, p <0,05 ). Insulinbehandling også signifikant øket tilstrømning konstant (Ki) sammenlignet med PBS-behandlede dyr (5,51 ± 4,25 x 10 -4 vs 2,01 ± 0,28 x 10 -3 ml min -1 -1 g, henholdsvis, p <0,05).
Figur 1: Regional tid-aktivitetskurver ble tilpasset en to-tissu e, trekompartmentmodell, med C1 blir konsentrasjonen av FDG i plasma og C2 og C3 konsentrasjonen av FDG og fosforylert FDG i vev, henholdsvis. k 1 representerer FDG opptakshastigheten i vev, k 2 klarfrekvensen fra vevet tilbake til plasmakammeret, og k 3 fosforyleringen hastigheten FDG. Den defosforylering av FDG ble antatt å være neglisjerbar (k 4 = 0).
Figur 2: Eksempel på tegning av regioner av interesse i gastrocnemius muskel (A) og vena cava (B) på en ko-registrert PET-CT-bilde. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
OAD / 55184 / 55184fig3.jpg"/>
Figur 3: Tid-virkningskurver for regioner av interesse i gastrocnemius muskel (A) og vena cava (B). Hann db / db-mus, ble fastet i 4,5 timer før behandling med 3 U / kg insulin (rød) eller tilsvarende volum PBS (svart). 18F-FDG (10 MBq) ble levert via intravenøs injeksjon og 18 F-FDG-nivåer i gastrocnemius muskelen og vena cava bestemmes av PET / CT i 60 minutter. Verdier er gjennomsnitt ± SD og uttrykt som prosent av injisert dose, beregnet fra en fullt synsfelt (n = 4 / gruppe). Forandringer fra Cochran et al. 13 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Behandling | k 2 | k 3 | Ki | |
| (ml min-1 g-1) | (min-1) | (min-1) | (ml min-1 g-1) | |
| PBS | 1,31 ± 0,42 x 10 -2 | 0,12 ± 0,11 | 7,06 ± 6,60 x 10 -3 | 5,51 ± 4,25 x 10 -4 |
| Insulin | 1,45 ± 0,59 x 10 -2 | 0,09 ± 0,05 | 2,26 ± 0,72 x 10 -2 * | 2,01 ± 0,28 x 10 -3 * |
Tabell 1: Kinetisk analyse av økt 18F-FDG fra plasma til gastrocnemii muskel i insulin behandlet db /db-mus. Verdier er gjennomsnitt ± SD. * P <0,05 vs PBS i henhold til en Mann-Whitney-test (n = 4 / gruppe).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen er beskrevet her er en robust, ikke-invasiv metode for å bestemme kinetikken for glukoseopptak fra blodstrømmen inn i vev og påfølgende metabolisme hos mus.
Db / db-mus er en er en godt etablert dyremodell av type 2 diabetes 14 som har blitt brukt i stor utstrekning for å undersøke insulinresistens og relevante intervensjoner. Imidlertid har tidligere studier kun kvantifisert endepunkt opptak i hjertet 15 og hjerte- og skjelettmuskel 16.
Bruken av kinetisk analyse for å bestemme fysiologiske hastighetskonstanter og model opptaket av 18F-FDG fra plasma til vev gjør det mulig for innsikt i virkningen av antidiabetiske behandlinger på glukoseopptak og metabolisme. I tillegg kan disse eksperimentene utføres i lengderetningen for å vurdere, for eksempel, virkningen av alder eller diett på glukosemetabolismen. Dette er Advantageous i forhold til tradisjonelle metoder som krever aktiv dødshjelp og samling av organer av interesse og dermed gir informasjon kun på ett tidspunkt.
Mens inngangsfunksjoner, er tidligere blitt bestemt ved anvendelse av hele hjertet 17, så vel som hjerte, lever og en blodprøver 18 i mus, protokollen som er beskrevet her tillater beregning av inngangsfunksjon ved hjelp av et område av interesse i løpet av vena cava 19. Det er også mulig å beregne inngangsfunksjoner, ved hjelp av arterielle blodprøver i løpet av en PET-undersøkelsen. Dette er imidlertid upraktisk på grunn av den lille blodvolum hos mus.
Bruken av et plasma inngangsfunksjon i stedet for 18 F-FDGsignal i fullblod er på grunn av opptak av 18F-FDG i mus røde blodceller 20. Dessuten representerer den røde blodcelleassosierte aktivitet 18F-FDG inne røde celler, og følgelig erikke lett tilgjengelig for transport til andre vevsområder.
I denne protokollen, er det viktig for å sikre riktig plassering av kateteret plasseres i halevenen for levering av 18F-FDG bolus til vena cava og i hele kroppen av musen. Oppvarming av halen for å dilatere halevenen forbedrer inst å sette inn dette kateter betydelig. Det er også viktig å sørge for at PET og CT-bilder er skikkelig coregistered slik at Rois trukket på CT bildet riktig tilsvare PET signal.
Det er noen debatt om valg av anestesimiddel i studier som undersøker glukoseopptak. Mens isofluran er en vanlig brukt veterinær bedøvelse, kan bruken av sevoflurane være fordelaktig i 18 F-FDG PET eksperimenter 21. I denne protokollen, er det viktig å sikre at eventuelle skjevheter i forbindelse med isofluran anestesi blir minimalisert ved å holde den tid between induksjon av anestesi og begynnelsen av avbildnings konstant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PET/CT Scanner | Siemens | Inveon | |
| 18F-FDG | PETNET Solutions | ||
| Isoflurane | Pharmachem | ||
| 30 guage needle | BD | 305106 | |
| PMOD modelling software | PMOD Technologies | ||
| BKS.Cg-Dock7m +/+ Leprdb/J mice | Jackson Laboratory | 000642 | |
| Human insulin | Sigma-Aldrich |
References
- Jensen, M. M., Kjaer, A. Monitoring of anti-cancer treatment with (18)F-FDG and (18)F-FLT PET: a comprehensive review of pre-clinical studies. Am J Nucl Med Mol Imaging. 5, 431-456 (2015).
- Duncan, K., et al. (18)F-FDG-PET/CT imaging in an IL-6- and MYC-driven mouse model of human multiple myeloma affords objective evaluation of plasma cell tumor progression and therapeutic response to the proteasome inhibitor ixazomib. Blood Cancer J. 3, e165 (2013).
- Wang, Y., Kung, A. L. 18F-FDG-PET/CT imaging of drug-induced metabolic changes in genetically engineered mouse lung cancer models. Cold Spring Harb Protoc. 2015, 176-179 (2015).
- Wang, X., Minze, L. J., Shi, Z. Z. Functional imaging of brown fat in mice with 18F-FDG micro-PET/CT. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2012).
- Radu, C. G., Shu, C. J., Shelly, S. M., Phelps, M. E., Witte, O. N. Positron emission tomography with computed tomography imaging of neuroinflammation in experimental autoimmune encephalomyelitis. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 1937-1942 (2007).
- Toba, S., et al. Post-natal treatment by a blood-brain-barrier permeable calpain inhibitor, SNJ1945 rescued defective function in lissencephaly. Sci Rep. 3, 1224 (2013).
- Halseth, A. E., Bracy, D. P., Wasserman, D. H. Overexpression of hexokinase II increases insulinand exercise-stimulated muscle glucose uptake in vivo. Am J Physiol. 276, E70-E77 (1999).
- Defronzo, R. A. Banting Lecture. From the triumvirate to the ominous octet: a new paradigm for the treatment of type 2 diabetes mellitus. Diabetes. 58, 773-795 (2009).
- Tohka, J., Reilhac, A. Deconvolution-based partial volume correction in Raclopride-PET and Monte Carlo comparison to MR-based method. NeuroImage. 39, 1570-1584 (2008).
- Wu, H. M., et al. et al. In vivo quantitation of glucose metabolism in mice using small-animal PET and a microfluidic device. J Nucl Med. 48, 837-845 (2007).
- Oikonen, V. Model equations for the dispersion of the input function in bolus infusion PET studies. , Available from: http://www.turkupetcentre.net/reports/tpcmod0003.pdf (2002).
- Iida, H., et al. Error analysis of a quantitative cerebral blood flow measurement using H2(15)O autoradiography and positron emission tomography, with respect to the dispersion of the input function. J Cereb Blood Flow Metab. 6, 536-545 (1986).
- Cochran, B. J., et al. In vivo PET imaging with [18F]FDG to explain improved glucose uptake in an apolipoprotein A-I treated mouse model of diabetes. Diabetologia. 59, 1977-1984 (2016).
- Kobayashi, K., et al. The db/db mouse, a model for diabetic dyslipidemia: molecular characterization and effects of Western diet feeding. Metabolism. 49, 22-31 (2000).
- Yue, P., et al. Magnetic resonance imaging of progressive cardiomyopathic changes in the db/db mouse. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 292, H2106-H2118 (2007).
- Hagberg, C. E., et al. Targeting VEGF-B as a novel treatment for insulin resistance and type 2 diabetes. Nature. 490, 426-430 (2012).
- Alf, M. F., et al. Quantification of brain glucose metabolism by 18F-FDG PET with real-time arterial and image-derived input function in mice. J Nucl Med. 54, 132-138 (2013).
- Tantawy, M. N., Peterson, T. E. Simplified [18F]FDG image-derived input function using the left ventricle, liver, and one venous blood sample. Molecular imaging. 9, 76-86 (2010).
- Thorn, S. L., et al. Repeatable noninvasive measurement of mouse myocardial glucose uptake with 18F-FDG: evaluation of tracer kinetics in a type 1 diabetes model. J Nucl Med. 54, 1637-1644 (2013).
- Wagner, R., Zimmer, G., Lacko, L. An interspecies approach to the investigation of the red cell membrane glucose transporter. Biochim Biophys Acta. 771, 99-102 (1984).
- Flores, J. E., McFarland, L. M., Vanderbilt, A., Ogasawara, A. K., Williams, S. P. The effects of anesthetic agent and carrier gas on blood glucose and tissue uptake in mice undergoing dynamic FDG-PET imaging: sevoflurane and isoflurane compared in air and in oxygen. Mol Imaging Biol. 10, 192-200 (2008).
