Introduction
Цель данного исследования заключалась в разработке позитронно - эмиссионной томографии / компьютерной томографии (ПЭТ / КТ) на основе методологии для количественного определения в естественных условиях, в режиме реального времени поглощение глюкозы из крови в специфических тканях у мышей. Это было достигнуто с использованием 18 Р-меченной фтордезоксиглюкозы (ФДГ) , чтобы измерить поглощение глюкозы и кинетическое моделирование для оценки темпов 18 поглощения F-ФДГ из плазмы в межклеточное пространстве, скорость переноса из внутриклеточного пространства в плазму крови и скорости 18 F-ФДГ фосфорилирования.
У грызунов, 18 F-ФДГ был использован в доклинической оценки многочисленных методов лечения рака 1, исследований прогрессии 2 опухоли и опухоли метаболизма 3, а также визуализации коричневых жировых депо 4, 5 neuroinflamation и мозг метаболизма 6
Традиционные методы , используемые для изучения тканеспецифического поглощения глюкозы у мышей и крыс () обычно включает в себя лечение с 2-дезоксиглюкозой меченой либо 3 H или 14 C с последующей эвтаназией, сбором ткани и измерением радиоактивности в каждой ткани 7. Использование ПЭТ / КТ позволяет неинвазивного определения поглощения глюкозы и метаболизма в различных органах и регионах одновременно в живых животных. Кроме того, как эвтаназии не является обязательным требованием, этот метод пригоден для использования в продольных исследованиях.
Сахарный диабет 2 типа (T2DM) характеризуются нарушенным метаболизмом глюкозы и гипергликемией вторичной по отношению к снижению реактивности тканей к инсулину (инсулинорезистентность) и неспособность поджелудочной железы производить -клетках достаточного количество инсулина 8. Кинетический анализ усвоения глюкозы и метаболизм может дать важную информацию омеханизм действия и эффективности терапевтических вмешательств, а также позволяет для расширенного мониторинга прогрессирования заболевания.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры , описанные в данном исследовании , были утверждены округа и университета комитетов Сидней животных этики Сидней местного здравоохранения и затем Руководство NIH по уходу и использованию лабораторных животных, Восьмое издание (2011).
1. Подготовка животных
Примечание: В этом протоколе мужского дБ / дБ мышей (BKS.Cg- Dock7 м + / + Lepr дБ / J) , не были сохранены в группе корпус с вволю доступом к Chow и воду до 6 - недельного возраста. Во время обработки изображений, мышей взвешивали ~ 30 г. Все мыши, используемые в этом протоколе были натощак уровень глюкозы в крови от 10 до 14 ммоль / л.
- При необходимости, быстро мышей. В настоящем примере, быстро мышей в течение 5 ч до начала экспериментальной процедуры.
- Treat мышей с желаемым агентом (например , лекарственное средство, белок, пептид) перед началом визуализации. В этом примере, вводить подкожную инъекцию инсулина (3Ед / кг инсулина человека) или эквивалентный объем PBS, за 30 мин до начала визуализации.
2. Настройка рабочего процесса
Примечание: Этот протокол был реализован на сканере ПЭТ / КТ. Приобретать данные ПЭТ первым, а затем получение данных КТ.
- Настройки ПЭТ:
- Выбор изотопа , как 18 F, установить длительность сканирования 3600 с, а верхний и нижний энергетический уровень дискриминации до 350 кэВ - 650 кэВ ( по умолчанию) с окном совпадения синхронизации от 3.432 нс ( по умолчанию). Гистограмма данные списка режима в 16 кадров (6 × 10 с, 4 × 60, 1 × 300 с, 5 × 600 с) за период 0 - 60 мин после инъекции трассирующей. Восстанавливает излучение синограмм с использованием 2D-FBP с увеличением 1.5.
Примечание: Восстановленные изображения состояли из 16 динамических кадров, каждый из которых 128 × 128 × 159 вокселей и размер воксела 0,52 × 0,52 × 0,796 мм 3.
- Выбор изотопа , как 18 F, установить длительность сканирования 3600 с, а верхний и нижний энергетический уровень дискриминации до 350 кэВ - 650 кэВ ( по умолчанию) с окном совпадения синхронизации от 3.432 нс ( по умолчанию). Гистограмма данные списка режима в 16 кадров (6 × 10 с, 4 × 60, 1 × 300 с, 5 × 600 с) за период 0 - 60 мин после инъекции трассирующей. Восстанавливает излучение синограмм с использованием 2D-FBP с увеличением 1.5.
- Параметры CT:
- Длявсе тело КТ, установить ток при 500 А, напряжение при 50 кВ, время экспозиции 500 мс и 200 выступов над 360 вращения. В поле детектора зрения (FOV) до 30722048, числа позиций кровати до 3 (чтобы покрыть полный диапазон ПЭТ F), перекрытие между слоем позицией = 30.234713% и детектором биннингом до 4.
Примечание: реконструкция КТ была выполнена с использованием конусной лучевой томографии программного обеспечения восстановления изображений с ХА калибровки, билинейной интерполяции и Shepp-Логан фильтр.
- Длявсе тело КТ, установить ток при 500 А, напряжение при 50 кВ, время экспозиции 500 мс и 200 выступов над 360 вращения. В поле детектора зрения (FOV) до 30722048, числа позиций кровати до 3 (чтобы покрыть полный диапазон ПЭТ F), перекрытие между слоем позицией = 30.234713% и детектором биннингом до 4.
- 18 F-ФДГ:
- Заказ достаточного 18 F-ФДГ (например , 450 МОк в 0,5 мл) от местного поставщика , чтобы прибыть ~ 30 минут до первой инъекции. Аликвоты и разбавить 18 F-ФДГ таким образом , чтобы животные получали ~ 10 МБк 18 F-ФДГ в конечном объеме 0,1 мл.
3. Протокол обработки изображений
- Вытирают индукционную камеру и кровать изображений с 80% (об / об) этанола для поддержания асептических условий. Пласе мыши в индукционной камере и анестезия с 5% изофлураном в кислороде.
- Поместите мышь на кровать с изображением, снабженной электрической грелкой, чтобы поддерживать температуру тела и испаритель носового конусом точности для доставки изофлурана (техническое обслуживание, 1,5 - 2%) при скорости потока 1 л / мин. Применение глазной мази на глаза, чтобы предотвратить сухость во время под наркозом.
- Поместите мышь в положении лежа на сенсорной панели, чтобы контролировать дыхание и обеспечить адекватный плоскость анестезии сохраняется.
- Теплый хвост с использованием теплового пакета в течение 1 - 2 мин, чтобы расширить боковую хвостовую вену. Катетеризировать боковую хвостовую вену, вставляя 30 калибра иглу в боковую хвостовую вену. Закрепите иглу на месте с хирургическим клеем и закрепить катетер.
- Загрузка изображений кровать в сканер и перемещать кровать через машину так, чтобы катетер можно получить доступ с задней стороны машины.
- Прикрепите катетер к шприцу 18 F-ФДГА в СыреВодитель Инге. Вычислить точную 18 F-ФДГ дозы (10 МБк) на основе активности в шприц перед инъекцией и объем , чтобы вводить (<100 мкл, впрыскиваемого в течение 10 с).
- Для того, чтобы свести к минимуму влияние анестезии на изменчивость глюкозы, обеспечить постоянное время между индукцией анестезии и инъекции 18 F-ФДГ (например, 30 мин).
- Начинают ПЭТ непосредственно перед инъекцией 18 F-ФДГ. После завершения сканирования ПЭТ (3600 сек), выполнить КТ (~ 10 мин), чтобы обеспечить совместную регистрацию поглощения радиотрейсер с тканями.
- Перемещение кровати изображений в исходное положение, удалить животное от кровати.
- На данный момент усыпить животное или позволить ему восстановить:
- Для эвтаназии, выполнять цервикальную дислокацию в то время как все еще под наркозом и собирают органы, представляющие интерес для последующего анализа.
- Если мышь позволяет восстановить, поместить мышь в одном корпусе на грелку илив передней части нагревательной лампы. Монитор мыши, пока он не пришел в сознание достаточного для поддержания грудины лежачее. Разрешить мыши, чтобы восстановить в течение 1 часа, прежде чем вернуться в группу жилья.
4. Обработка изображений ПЭТ
Примечание: реконструкция изображения была выполнена с использованием рабочего места приобретения программного обеспечения v1.5.0.28 и анализа в исследование программного обеспечения на рабочем месте v4.2.
- Со-регистр КТ и ПЭТ изображений и гарантировать, что выравнивание является правильным во всех 3-х измерениях.
- В меню «Файл» выберите «Folder Search / Импорт» и выберите папку, содержащую данные. Выберите нужные данные ПЭТ и КТ и нажмите на вкладку «Общий анализ».
- Сортировка данных так, что CR будет называться «Источник» и ПЭТ назначенные «Target». В меню «WorkFlow», выберите «Регистрация». Если изображения требуют регулировок, чтобы быть правильно совмещались, использовать инструменты яМеню е «Регистрация».
- В меню «Workflow», выберите «ROI КОЛИЧЕСТВЕННУЮ».
- Использование функций в «Pan» и «Уменьшить» на вкладке «Изображение», чтобы найти нужный регион. В меню «Сервис», выберите вкладку «Создать» и нажмите на значок кисточки. Нарисуйте ROI на изображении
- Извлечение кривых времени активности, выбрав «Сохранить ROI КОЛИЧЕСТВЕННАЯ» из меню «Сохранить». Сохранение данных в виде файла CSV.
- Количественно поглощение радиоактивности в Бк на см 3 ткани. Преобразование значения в процентах от введенной дозы на см 3 (% ID / см 3) путем загрузки файла CSV - в электронную таблицу.
5. Входные функции
- Для исправления для функции рассеяния точки системы, деконволюции оценочной системы PSF в течение 5 итераций с использованием методы деконволюции reblurred Ван Циттерто , как описано выше 9.
Примечание: Это необходимо из-за небольшой размером Вена Кава у мыши. - Использование почтовых изображений деконволюции, чтобы сгенерировать кривую функции времени активности входа в крови, как описано выше.
6. Кинетическое моделирование
Примечание: ФДГ две ткани модель отсека (Рисунок 1) требует функции входа плазмы.
- Преобразование функция ввода крови в CSV файл для функции входа плазмы , используя следующее уравнение 10: Input_plasma = Input_blood × (0,386 е - 0.191t + 1,165).
- В кинетическом инструмент моделирования нажмите кнопку «Kinetic». Импорт ткани и плазмы общая активность подсчитывать CSV файлов в кинетическом инструмент моделирования, выбрав «Load Time Activity Curve» из «Меню».
- В меню «Модель» выберите 2 отделение ткани. Убедитесь, что флажок рядом с К4 невыбранныйи введите значение 0. Для начального фитинга, снимите флажок Vb объем крови (фракция) и введите значение в 2%.
- Нажмите кнопку «Fit текущего региона». Правильно извлеченная область интереса для диспергирования 11, 12. Достичь этого путь минимизации хи-квадрат значения для модели ФДГА в разное время диспергирования.
- Выполните вторую посадку , используя значение с плавающей Vb (флажок рядом с полем для Vb) и оптимизированное значение дисперсии для расчета константы скорости региональной (K 1 -k 3). Рассчитывают региональный приток постоянной , как K я = (к 1 × K 3) / (K 2 + к 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ранее мы использовали / модель мыши дб дб исследовать влияние увеличения плазменных уровней апоА-I на кинетику поглощения глюкозы и метаболизме 13. В этом исследовании мы использовали дБ / дБ мышей , получавших инсулин , чтобы продемонстрировать полезность ПЭТ / КТ для контроля поглощения 18 F-ФДГ из плазмы в икроножной мышце в режиме реального времени.
Шесть недельных дБ / дБ мышей анестезировали и обрабатывали 3 U человеческого инсулина / кг, или эквивалентный объем PBS с помощью подкожной инъекции за 30 мин до начала ПЭТ. Мыши получили 10 МОк 18 F-ФДГА с помощью внутривенной инъекции и поглощения , измеренной ПЭТ в течение 60 мин. КТ была выполнена для анатомической ссылки.
Интересующие регионы были нарисованы на Вена Кава и икроножной мышцы , используя изображения CT (Figure 2). Лечение дБ / дБ мыши с инсулином увеличивали 18 F-ФДГ активность в икроножной ROI в течение периода времени приобретения (рисунок 3А). Значения , полученные для Вена Кава ROI были преобразованы из крови к значениям плазмы и не были изменены путем обработки инсулина в инсулин обработанных мышей по сравнению с контролем (рис 3B).
Кривые Время активности были загружены в кинетический инструмент моделирования для расчета кинетических параметров. Данные были изначально установлены на методе отделения двух тканей с к 4 = 0 со значением V B (кровь объемная доля) 2% для расчета значений дисперсии (80 сек и 70 сек для PBS и инсулина у мышей , получавших, соответственно). Монтаж затем выполняется с использованием указанных выше значений дисперсии и плавающее значения V B.
Нет существенной разницы в размере 18 F-ФДГ транспорт из артериальной плазмы в межклеточном пространстве (к 1) или из внутриклеточного пространства плазмы (K 2) наблюдалось у мышей , которым вводили инсулин по сравнению с контролем (таблица 1). Скорость 18 F-ФДГ фосфорилирования (к 3) была значительно увеличена у мышей , которым вводили инсулин (7,06 ± 6,60 × 10 -3 против 2,26 ± 0,72 × 10 -2 мин -1 для PBS и инсулина группах , получавших, соответственно; р <0,05 ). Лечение Инсулин также значительно увеличился постоянный приток (K I) по сравнению с PBS-обработанных животных (5,51 ± 4,25 × 10 -4 против 2,01 ± 0,28 × 10 -3 мл мин -1 г -1, соответственно; р <0,05).
Рисунок 1: Кривые Региональное время активности были установлены на два Tissu е, три модели отсека, с С1 является концентрацией ФДГА в плазме и С2 и С3 концентрации ФДГА и фосфорилированного ФДГ в ткани, соответственно. K 1 представляет собой скорость поглощения ФДГА в ткани, K 2 скорость клиренса из ткани обратно в плазменной камеру и K 3 скорости фосфорилирования ФДГА. Дефосфорилирование ФДГ Предполагалось , что им можно пренебречь (к 4 = 0).
Рисунок 2: Пример чертежа областей , представляющего интерес в икроножной мышце (А) и Вена Кава (В) на совместный учет ПЭТ-КТ изображения. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
ДОА / 55184 / 55184fig3.jpg»/>
Рисунок 3: Кривые время активности для областей , представляющего интереса в икроножной мышце (А) и Вена Кава (B). Мужской дБ / дБ мышей подвергали голоданию в течение 4,5 ч до получения 3 ед / кг инсулина (красный) или эквивалентный объем PBS (черный). 18 F-ФДГ (10 МБк) был доставлен с помощью внутривенной инъекции и 18 уровней F-ФДГ в икроножной мышцы и Вена Кава , определяемой ПЭТ / КТ в течение 60 мин. Значения представляют собой среднее ± SD и выражали в процентах от введенной дозы, рассчитанные из полного поля зрения (п = 4 / группу). Модифицированный из Cochran и др. 13 Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
| лечение | K 2 | K 3 | K я | |
| (мл мин -1 г -1) | (мин -1) | (мин -1) | (мл мин -1 г -1) | |
| PBS | 1,31 ± 0,42 × 10 -2 | 0,12 ± 0,11 | 7,06 ± 6,60 × 10 -3 | 5,51 ± 4,25 × 10 -4 |
| инсулин | 1,45 ± 0,59 × 10 -2 | 0,09 ± 0,05 | 2,26 ± 0,72 × 10 -2 * | 2,01 ± 0,28 × 10 -3 * |
Таблица 1: Кинетический анализ увеличенного 18 F-ФДГ из плазмы к икроножной мышце в инсулине обрабатывает дб /дБ мыши. Значения представляют собой среднее ± SD. * Р <0,05 по сравнению с PBS в соответствии с тестом Mann-Whitney (п = 4 / группу).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Протокол, описанный здесь, представляет собой надежную, неинвазивный методику для определения кинетики поглощения глюкозы из крови в ткани и последующего обмена веществ у мышей.
ДБ / дБ мышь является является хорошо создан животной моделью сахарного диабета 2 типа 14 , который был использован широко для изучения резистентности к инсулину и соответствующие вмешательств. Однако, предыдущие исследования только количественно поглощение конечной точки в сердце 15 и сердечных и скелетных мышцах 16.
Использование кинетического анализа для определения констант скорости физиологических и модели поглощения 18 F-ФДГ из плазмы в ткани позволяет взглянуть на воздействие противодиабетических лечения на поглощение глюкозы и обмен веществ. Кроме того, эти эксперименты могут быть выполнены в продольном направлении, чтобы оценить, например, влияние возраста или диеты на метаболизм глюкозы. Это Advantageous по сравнению с традиционными методами, которые требуют эвтаназию и сбор органов, представляющих интерес, и, таким образом, предоставляют информацию только в одной точке времени.
В то время как входные функции были ранее определены с использованием всего сердца 17, а также сердца, печени и образцов крови у мышей 18, протокол , описанный здесь , обеспечивает вычисление функции входа , используя область интереса через Вена Кава 19. Кроме того, можно вычислить входные функции с использованием артериальных образцов крови при исследовании ПЭТ. Тем не менее, это непрактично из-за небольшой объем крови мышей.
Использование входной функции плазмы , а не 18 F-FDGsignal в цельной крови происходит из - за поглощения 18 F-ФДГ в клетки мыши красных кровяных 20. Кроме того, связанная активность красных кровяных клеток представляет собой 18 F-ФДГ внутри красных клеток, и , следовательно,не легко доступны для транспорта в других тканях.
В этом протоколе, важно обеспечить правильное размещение катетера , помещенного в хвостовую вену для доставки 18 F-ФДГ болюса в Вена Кава и по всему телу мыши. Утепление хвоста, чтобы расширить хвостовую вену значительно улучшает легкость вставки этого катетера. Важно также, чтобы гарантировать, что изображения ПЭТ и КТ правильно coregistered так что трансформирования нарисованной на изображении КТ правильно соответствует сигналу ПЭТ.
Существует некоторая дискуссия по поводу выбора анестетика в исследованиях, исследующих поглощение глюкозы. В то время как изофлуран является широко используемым ветеринарной анестетик, использование севофлурана может быть выгодным в 18 F-ФДГ ПЭТ экспериментов 21. В этом протоколе, важно обеспечить, чтобы любые возможные искажения, связанные с изофлураном анестезии минимизируются путем поддержания времени betwееп индукция анестезии и начало постоянной визуализации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PET/CT Scanner | Siemens | Inveon | |
| 18F-FDG | PETNET Solutions | ||
| Isoflurane | Pharmachem | ||
| 30 guage needle | BD | 305106 | |
| PMOD modelling software | PMOD Technologies | ||
| BKS.Cg-Dock7m +/+ Leprdb/J mice | Jackson Laboratory | 000642 | |
| Human insulin | Sigma-Aldrich |
References
- Jensen, M. M., Kjaer, A. Monitoring of anti-cancer treatment with (18)F-FDG and (18)F-FLT PET: a comprehensive review of pre-clinical studies. Am J Nucl Med Mol Imaging. 5, 431-456 (2015).
- Duncan, K., et al. (18)F-FDG-PET/CT imaging in an IL-6- and MYC-driven mouse model of human multiple myeloma affords objective evaluation of plasma cell tumor progression and therapeutic response to the proteasome inhibitor ixazomib. Blood Cancer J. 3, e165 (2013).
- Wang, Y., Kung, A. L. 18F-FDG-PET/CT imaging of drug-induced metabolic changes in genetically engineered mouse lung cancer models. Cold Spring Harb Protoc. 2015, 176-179 (2015).
- Wang, X., Minze, L. J., Shi, Z. Z. Functional imaging of brown fat in mice with 18F-FDG micro-PET/CT. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2012).
- Radu, C. G., Shu, C. J., Shelly, S. M., Phelps, M. E., Witte, O. N. Positron emission tomography with computed tomography imaging of neuroinflammation in experimental autoimmune encephalomyelitis. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 1937-1942 (2007).
- Toba, S., et al. Post-natal treatment by a blood-brain-barrier permeable calpain inhibitor, SNJ1945 rescued defective function in lissencephaly. Sci Rep. 3, 1224 (2013).
- Halseth, A. E., Bracy, D. P., Wasserman, D. H. Overexpression of hexokinase II increases insulinand exercise-stimulated muscle glucose uptake in vivo. Am J Physiol. 276, E70-E77 (1999).
- Defronzo, R. A. Banting Lecture. From the triumvirate to the ominous octet: a new paradigm for the treatment of type 2 diabetes mellitus. Diabetes. 58, 773-795 (2009).
- Tohka, J., Reilhac, A. Deconvolution-based partial volume correction in Raclopride-PET and Monte Carlo comparison to MR-based method. NeuroImage. 39, 1570-1584 (2008).
- Wu, H. M., et al. et al. In vivo quantitation of glucose metabolism in mice using small-animal PET and a microfluidic device. J Nucl Med. 48, 837-845 (2007).
- Oikonen, V. Model equations for the dispersion of the input function in bolus infusion PET studies. , Available from: http://www.turkupetcentre.net/reports/tpcmod0003.pdf (2002).
- Iida, H., et al. Error analysis of a quantitative cerebral blood flow measurement using H2(15)O autoradiography and positron emission tomography, with respect to the dispersion of the input function. J Cereb Blood Flow Metab. 6, 536-545 (1986).
- Cochran, B. J., et al. In vivo PET imaging with [18F]FDG to explain improved glucose uptake in an apolipoprotein A-I treated mouse model of diabetes. Diabetologia. 59, 1977-1984 (2016).
- Kobayashi, K., et al. The db/db mouse, a model for diabetic dyslipidemia: molecular characterization and effects of Western diet feeding. Metabolism. 49, 22-31 (2000).
- Yue, P., et al. Magnetic resonance imaging of progressive cardiomyopathic changes in the db/db mouse. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 292, H2106-H2118 (2007).
- Hagberg, C. E., et al. Targeting VEGF-B as a novel treatment for insulin resistance and type 2 diabetes. Nature. 490, 426-430 (2012).
- Alf, M. F., et al. Quantification of brain glucose metabolism by 18F-FDG PET with real-time arterial and image-derived input function in mice. J Nucl Med. 54, 132-138 (2013).
- Tantawy, M. N., Peterson, T. E. Simplified [18F]FDG image-derived input function using the left ventricle, liver, and one venous blood sample. Molecular imaging. 9, 76-86 (2010).
- Thorn, S. L., et al. Repeatable noninvasive measurement of mouse myocardial glucose uptake with 18F-FDG: evaluation of tracer kinetics in a type 1 diabetes model. J Nucl Med. 54, 1637-1644 (2013).
- Wagner, R., Zimmer, G., Lacko, L. An interspecies approach to the investigation of the red cell membrane glucose transporter. Biochim Biophys Acta. 771, 99-102 (1984).
- Flores, J. E., McFarland, L. M., Vanderbilt, A., Ogasawara, A. K., Williams, S. P. The effects of anesthetic agent and carrier gas on blood glucose and tissue uptake in mice undergoing dynamic FDG-PET imaging: sevoflurane and isoflurane compared in air and in oxygen. Mol Imaging Biol. 10, 192-200 (2008).
