Summary
אנו מציגים פרוטוקול ליצירת השושלת chondrogenic מן הדם ההיקפי האנושי (PB) באמצעות תאי גזע pluripotent המושרה (iPSCs) בשיטה ללא אינטגרציה, הכוללת גבריות הגוף (EB) היווצרות, הרחבת תאים fibroblastic, אינדוקציה chondrogenic.
Abstract
במחקר זה, השתמשנו בתאי דם היקפיים (PBCs) כתאי זרע כדי לייצר chondrocytes באמצעות תאי גזע pluripotent המושרה (iPSCs) בשיטה ללא אינטגרציה. לאחר גדילה של הגוף (EB) והתפשטות תאים fibroblastic, iPSCs הם המושרה עבור בידול chondrogenic במשך 21 ימים תחת סרום ללא תנאים ללא xeno. לאחר אינדוקציה chondrocyte, פנוטיפים של התאים מוערכים על ידי ניתוח מורפולוגי, immunohistochemical, וביוכימי, כמו גם על ידי כמותי בזמן אמת PCR בדיקה של סמנים בידול chondrogenic. את chondrogenic pellets להראות חיובי alcian כחול כחול toluidine מכתים. אימונוהיסטוכימיה של קולגן II ו- X מכתים הוא גם חיובי. תכולת ה- glycosaminoglycan (sGAG) וה- chondrogenic differentiation markers, COLLAGEN 2 ( COL2 ), COLLAGEN 10 ( COL10 ), SOX9 ו- AGGRECAN מוגברות באופן משמעותי ב- chondכדורי rogenic לעומת hiPSCs ותאי fibroblastic. תוצאות אלו מראות כי PBCs ניתן להשתמש בתאי זרע כדי ליצור iPSCs עבור תיקון הסחוס, שהוא החולה ספציפי וחסכוני.
Introduction
רקמת הסחוס יש יכולת ירודה מאוד לתיקון עצמי התחדשות. התערבויות כירורגיות שונות וטיפולים ביולוגיים משמשים כדי לשחזר סחוס פונקציה משותפת, עם תוצאות לא מספקות. הפיתוח האחרון של טכנולוגיית תא גזע עשוי לשנות את השדה תיקון סחוס כולו 1 . תאי גזע שונים נחקרו כתאי זרע, אך תאי גזע מושרים אנושיים (hiPSCs) להיראות הבחירה המבטיחה ביותר, כפי שהם יכולים לספק סוגים רבים של תאים ספציפי חולה מבלי לגרום לתגובות דחיית 2. יתר על כן, הם יכולים להתגבר על הטבע השגשוג המוגבל של תאים בוגרים ולשמור על התחדשות עצמית ויכולות pluripotent שלהם. יתר על כן, מיקוד גנטי יכול לשמש כדי לשנות את הגנוטיפ כדי לקבל סוגים מסוימים של chondrocytes.
Fibroblasts כבר בשימוש נרחב כדי ליצור iPSCs כי הפוטנציאל שלהם תכנות מחדש יש גם נחקרו היטב.עם זאת, יש עדיין כמה מגבלות שיש להתגבר, כגון ביופסיה כואבת מן המטופלים ואת הצורך הרחבה במבחנה של fibroblasts, אשר עלול לגרום מוטציות גנים 3 . לאחרונה, PBCs נמצאו להיות יתרון עבור תכנות מחדש 4 ; יתר על כן, הם היו בשימוש נפוץ מאוחסן בשפע. זה אפשרי כי הם עשויים להפנות את המחקר להתמקד מן העור. עם זאת, למיטב ידיעתנו, ישנם כמה דוחות על תכנות מחדש PBC ואחריו בידול לתוך chondrocytes.
במחקר הנוכחי, אנו משתמשים PBCs כמקור חלופי על ידי תכנות מחדש אותם לתוך iPSCs ולאחר מכן הבדל iPSCs לתוך השושלת chondrogenic באמצעות מערכת התרבות גלולה על מנת לחקות היווצרות chondrocyte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
פרוטוקול הדור של hiPSCs מ PBCs ניתן למצוא במחקר הקודם שלנו 5 . המחקר אושר על ידי המוסד לביקורת מוסדית של המוסד שלנו.
1. גבריות גוף (גיבוש) גיבוש
- בצע 50 מ"ל של המדיום hiPSC: נוקאוט Dulbecco השתנה בינוני בינוני (DMEM) בתוספת 15% החלפת נוקאאוט בסרום (KSR), 5% בסרום שור עוברית (FBS), 1 × חומצות אמינו לא חיוניות, 55 מיקרומטר 2-mercaptoethanol, 2 מ"מ L - glutamine, ו 8 ng / mL בסיסי fibroblast גורם הצמיחה (bFGF).
- הפוך 50 mLof בינוני היווצרות EB: DMEM בתוספת KSR 15%, 5% FBS, 1x חומצות אמינו חיוניות, 55 מיקרומטר 2-mercaptoethanol, ו 2 מ"מ L- גלוטמין.
- הפוך 50 מ"ל של המדיום התרבות הבסיסית: DMEM בתוספת 20% FBS, 1 × חומצות אמינו לא חיוניות, 55 מיקרומטר 2-mercaptoethanol, ו 2 מ"מ L- גלוטמין.
- הכן 10 מ"ל של פתרון dispase, 1 מ"ג / מ"ל ב נוקאאוט DMEM.
- CultuRe hiPSCs על 60 מ"מ צלחות תרבות רקמה עם תאים מזין ( כלומר, monolayer של תאים עובריים fibroblast עובריים עכבר). כאשר התאים הם 80-90% confluent, disassociate התאים עם dispase ומעבר hiPSCs 1: 3 כל 4-5 ימים. מניחים את התאים לתוך 37 ° C ו 5% CO 2 חממה.
- לנתח את מושבות hiPSC לא מובחן לחתיכות קטנות יותר (כ 50-100 מיקרומטר בקוטר) באמצעות מחט זכוכית מצוירת באש כאשר iPSCs הם 80-90% ומחוברות. בדרך כלל, להשתמש מושבות hiPSC בצלחת 60 מ"מ לייצר EBS צלחת 100 מ"מ פטרי.
- תרבות פחות מ 100 חתיכות קטנות של מושבות צלחת 100 מ"מ, לא חסיד פטרי המכיל 10 מ"ל של המדיום היווצרות EB. מניחים את הכלים לתוך 37 ° C ו 5% CO 2 חממה.
- החלף כ 25% של המדיום הראשוני עם כמות שווה של המדיום התרבות הבסיסית כל 2 ימים. להטות את המנה לתת EBs להתיישב. הסר בזהירות 3 מ"לשל המדיום העליון ומוסיפים 4 מ"ל של מדיום בינוני טרי. אין להפריע EBS.
הערה: EBs מאופיינים מורפולוגית על ידי פיסות המושבות, לוקח על מראה עגול עם הגבולות החלקים מתחת למיקרוסקופ. - לאחר 10 ימים של תרבות בצלחת פטרי לא חסיד, מעיל חדש 100 מ"מ צלחת רקמה תרבות עם 4 מ"ל של ג'לטין 0.1% למשך 30 דקות על 37 מעלות צלזיוס לפני השימוש.
- מעבירים את המדיום בתוספת EBS מ 100 מ"מ, צלחת פטרי חסין לצינור חרוטי 15 מ"ל. תן משקעים EBS במשך 4-5 דקות. לשאוב supernatant בזהירות ולהשאיר פחות מ 0.5 מ"ל של מדיום בתוספת EBS
- זרע פחות מ -100 EBS על 100 מ"מ, צלחת גלאטין מצופה רקמות תרבות עם 10 מ"ל של המדיום התרבות הבסיסית. מניחים את הכלים לתוך 37 ° C ו 5% CO 2 חממה.
2. תא גלולה גיבוש בידול chondrocyte
- הפוך 10 מ"ל של 0.25% טריפסין / ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA). הפוך 80 מ"ל של basאל תרבות בינוני: DMEM בתוספת 20% FBS, 1x חומצות אמינו חיוניות, 55 מיקרומטר 2-mercaptoethanol, ו 2 מ"מ L- גלוטמין.
- הפוך 10 מ"ל של המדידה בידול chondrogenic: DMEM (גלוקוז גבוהה) בתוספת 10% אינסולין- transferrin- סלניום פתרון (ITS), 0.1 מיקרומטר dexamethasone, 1 mM חומצה אסקורבית, 1% pyruvate נתרן, ו 10 ng / mL שינוי גורם הצמיחה, בטא 1 (TGF-β1).
- רענן את המדיום עם 10 מ"ל של המדיום התרבות הבסיסית לאחר 48 שעות. לאחר מכן, לרענן את המדיום כל שלושה ימים עם 10 מ"ל של המדיום התרבות הבסיסית.
הערה: לאחר 10 ימים בתרבית, תאי תאים fibroblastic צריך התרחב EBS.- סמל 100 מנות מ"מ עם 4 מ"ל של ג'לטין 0.1% למשך 30 דקות על 37 מעלות צלזיוס לפני השימוש. מחק supernatant התא לשטוף את התאים עם Dulbecco של פוספט שנאגרו מלוחים (DPBS) פעם אחת.
- לעכל את התאים עם 3 מ"ל של 0.25% טריפסין / EDTA ב 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות לנטרל עם 4 מ 'L בינוני בינוני.
- לנתק את התאים לתוך תאים בודדים על ידי pipetting מעלה ומטה 5-10 פעמים והעברת אותם דרך רשת ניילון 70 מיקרומטר. צנטריפוגה ההשעיה התא ב XG 200 במשך 5 דקות. Re- זרע התאים על 100 מ"מ חדש, צלחת גלאטין מצופה רקמות תרבות עם 10 מ"ל של המדיום התרבות הבסיסית.
- רענן את המדיום עם 10 מ"ל של המדיום התרבות הבסיסית לאחר 48 שעות. לאחר מכן, לרענן את המדיום כל שלושה ימים עם 10 מ"ל של המדיום התרבות הבסיסית.
הערה: התאים לרכוש מורפולוגיה הומוגנית, דמוי fibroblast. - כאשר ~ 90-100% מפגש הוא הגיע ( כלומר, כ 5-7 ימים), למסוק את התאים עם 3 מ"ל של 0.25% טריפסין / EDTA ב 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. לנטרל עם 4 מ"ל של המדיום התרבות הבסיסית. לנתק את התאים לתוך תאים בודדים על ידי pipetting למעלה ולמטה 5 פעמים. השתמש hemocytometer לספור את מספר התא.
- מקום 3 x 10 5 תאים בצינור פוליפרופילן 15 מ"ל. צנטריפוגה ב 200 xgבמשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT). Re- להשעות את התאים 1 מ"ל של המדידה בידול chondrogenic.
- מחדש צנטריפוגה התאים ב XG 300 במשך 3 דקות ולשמור על התאים בצורת גלולה קטנה. שים את הצינור לתוך 37 ° C ו 5% CO 2 חממה במשך 21 ימים. אין לדפוק את המכסה בחוזקה ולאפשר את החלפת הגז.
- החלף 3/4 של המדיום תרבות כל שלושה ימים עם בינוני בידול chondrogenic טריים.
הערה: לאחר 21 ימים בתרבות, hiPSC-chondrogenic pellets (hiPSC-Chon) צריך להיווצר. תאי גזע mesenchymal האדם, כמו שליטה חיובית, נאספים גם תרבותי במדיום בידול chondrogenic במשך 21 ימים כדי ליצור כדורי chondrogenic (hMSC-Chon).
3. ניתוח של דיפרנציאציה chondrogenic
- הכן 10 מ"ל של 10% נייטרלית שנאגרו פורמלין.
- הכן 50 מ"ל של מגיב כחול alcian 0.1% ו 50 מ"ל של מגיב 1% toluidine כחול.
- יחסי ציבורEpare 1 מ"ל של הנוגדנים העיקריים: נוגדנים פוליקלוניים ארנב נגד קולגן II (1:50) או נוגדנים עכבר מונוקלונליים נגד קולגן X (1:50). כמו כן, להכין אנטי ארנב או נוגדנים משניים העכבר.
- הפוך 1 מ"ל של פתרון papain: 10 U / מ"ל ב PBS עם 0.1 M אצטט אצטט, 2.4 מ"מ EDTA, ו 5 מ"מ L- ציסטאין.
- הפוך 100 מ"ל dimethylmethylene כחול (DMMB) פתרון צבע: 100 μL של 16 מ"ג / L 1,9-dimethylmethylene כחול, 40 מ"מ גליצין, 40 מ"מ NaCl, ו 9.5 מ"מ HCL; PH 3.0.
- הערכת בידול chondrogenic ידי כתמים כחולים alcian ו toluidine כתמים של קטעים גלולה.
- תקן אחד hiPSC-chon גלולה או hMSC-Chon גלולה ב 1 מ"ל של 10% נייטרלי שנאגרו פורמלין במשך 24 שעות.
- מעבירים את גלולה ל 1 מ"ל של 70% אתנול ב H 2 O. להתייבש גלולה עם 1 מ"ל של סדרת אתנול מדורגים ( כלומר, 25, 50, 75, 90, 95, 100, ו 100%, 3 דקות כל אחד).
- להבהיר את גלולה ב 1 מ"ל של קסילן 100% שלוש פעמים. מסתנןדואר גלולה עם פרפין עבור 1 שעות בתנור 65 מעלות צלזיוס. הטבעת את גלולה בלוקים פרפין עם 7 x 7 x 5 מ"מ 3 עובש הבסיס, לאחר הליכים היסטולוגיים שגרתית 6 .
- הפוך סעיפים סמוכים על ידי microtome עם עובי של כ 4 מיקרומטר 7 . דבק את החלקים על גבי שקופיות זכוכית.
- יבש את השקופיות עבור 2 שעות ב 60 מעלות צלזיוס בתנור. Deparaffinize הסעיפים בשלושה מחזורים (3 דקות כל אחד) באמצעות 100% xylene.
- השתמש בסדרה אלכוהול הפחתת עבור התייבשות ( כלומר, 100, 100, 95, 95, 70, 50, ו 25% H 2 O, 3 דקות כל אחד) ולאחר מכן לבצע שטיפה הסופי עם מים deionized במשך 5 דקות.
- הכתם את הסעיפים עם 0.1% alcian כחול מגיב או 1% מכתים toluidine כחול במשך 4-5 שעות ולאחר מכן לשטוף אותם עם מים מזוקקים.
- להתייבש עם סדרת אתנול מדורגת ( כלומר, 25, 50, 75, 90, 95, 100, ו 100%, 3 דקות כל אחד) ואחריו שלושה ברציפות רחובEps של הבהרה ב 100% xylene. הרכוב שקופיות לדמיין אותם תחת מיקרוסקופ.
- לבצע אימונוהיסטוכימיה.
הערה: חלקים נוספים גלולה מוערכים נוספת על ידי אימונוהיסטוכימיה.- לאחר deparaffinization ו rehydration, להביא את השקופיות לרתיחה ב 1 מ"מ EDTA, pH 8.0 (עמיד למים במים מבושל על ידי החיטוי). תן להם לשבת במשך 8 דקות בטמפרטורה רותחים תת ולאחר מכן לאפשר את השקופיות להתקרר ב RT.
- יש לשטוף את השקופיות עם מים deionized 3 פעמים. דגירה הסעיפים ב 3% H 2 O 2 פתרון מתנול ב RT במשך 15 דקות לחסום פעילות peroxidase אנדוגני.
- שוטפים את השקופיות עם מים deionized ו לטבול אותם DPBS במשך 5 דקות. החל 50-100 μL של נוגדן ראשוני בדילול נאות (1:50) העיקרי על החלקים על השקופיות ולאחר מכן דגירה אותם בחדר humidified ב RT עבור 1 שעות.
- לשטוף את השקופיות 3 פעמים (5 דקות כל אחד) עם DPBS. דגירה saדגימות עם נוגדנים המשניים המקביל ( כלומר, נגד ארנבת או עכבר) במשך 15 דקות ב RT.
- לשטוף את השקופיות 3 פעמים (במשך 5 דקות כל אחד) עם DPBS. בצע זיהוי DAB תחת מיקרוסקופ.
- לשטוף את השקופיות עם DPBS 3 פעמים (2 דקות כל אחד). Counterstain גרעיני התא על ידי שקוע את השקופיות hematoxylin במשך 1-2 דקות. להתייבש עם סדרת אתנול מדורגת (25, 50, 75, 90, 95, 100, ו 100%, 3 דקות כל אחד) ואחריו שלושה שלבים רצופים של הבהרה עם קסילן. לבסוף, הר שקופיות לדמיין אותם תחת המיקרוסקופ.
- זיהוי תוכן sGAG.
- לעכל כדורי chondrogenic בפתרון papain ב 60 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות.
- קביעת תוכן ה- DNA באמצעות ערכת assay dsDNA ומערכת fluorometer. למדוד את התוכן sGAG על ידי ערבוב זה עם פתרון DMMB צבע תחת מדידה absorbance ב 525 ננומטר 8 .
- חישוב הריכוז של sGAG נגד עקומת תקן שלכריש גופרית כונדרואיטין.
- בצע את ניתוח ה- PCR בזמן אמת של סמנים בידול chondrogenic ב hiPSC-chon pellets.
- קציר 3-4 של כדורי chondrogenic אותו על ידי הוספת 500 μL של מגיב החילוץ הקרה לצינור אחד. וורטקס ביסודיות. דגירה המדגם במשך 5 דקות ב RT.
- הוסף 0.1 מ"ל של כלורופורם. וורטקס המדגם עבור 15 ים ו לדגור אותו RT למשך 3 דקות. צנטריפוגה המדגם במשך 15 דקות ב XG 12,000 ו 4 ° C. מעבירים את השלב מימית העליון (כ 250 μL) לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מ"ל חדש.
- הוסף 25 μL של אצטט נתרן ו 1 μL של גליקוגן למדגם. להאיץ את RNA על ידי ערבוב זה עם 250 μL של אלכוהול איזופרופיל. מערבבים היטב. דגירה המדגם ב RT במשך 10 דקות.
- צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 12,000 XG ו 4 ° C. הסר את supernatant לחלוטין. לשטוף את גלולה רנ"א פעמיים עם 500 μL של 75% אתנול.
- צנטריפוגה 5 דקותב 7,500 XG ו 4 ° C. הסר את כל אתנול שאריות האוויר יבש את גלולה RNA עבור 5-10 דקות. ממיסים את רנ"א 10 μL של מים ללא nuclease.
- המרת RNA לתוך cDNA באמצעות מערכת transcriptase הפוכה. נושא דגימות cDNA ל- PCR בזמן אמת באמצעות שילוב QPCR מאסטר הורים (2x) ומערכת PCR בזמן אמת 9 .
הערה: רצפי הפריימר הם:
H AGGRECAN -F: TCGAGGACAGGGAGGCCCC;
H AGGRECAN -R: TCGAGGGTTAGTGTTAGAGAGAA;
H β- ACTIN -F: TTTGAATGATGAGCCTTCGTCCCC;
H β- ACTIN -R: GGTCTCAAGTCAGTGTACAGGTAAGC;
H COL2 -F: TGGACGATCAGGCGAAACC;
H COL2 -R: GCTGCGGATGCTCTCAATCT;
H SOX9 -F: AGCGAACGACATCAAGAC;
H SOX9 -R: CTGTAGGCGATCTGTTGGGG;
H COL10- F: ATGCTGCCACAAATACCCTTT;
שעה COL10 -R: GGTAGTGGGTTTATGCCT.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בידול Chondrogenic של hiPSCs:
EB בינוני בינוני בינוני בינוני שימשו כדי להבדיל את hiPSCs לתוך השושלת mesenchymal. שיטה רב תרבותית שלב שימש ( איור 1 ). ראשית, hiPSCs נבדלו באופן ספונטני באמצעות היווצרות EB במשך 10 ימים (D10, איור 2 א ). שנית, תאים נעלמו מן EBS עוד 10 ימים (D10 + 10). במהלך שני שלבים אלה, iPSCs בהדרגה איבדו מורפולוגיות המקורי שלהם להשיג מורפולוגיות בצורת ציר ( איור 2 ב ), אשר לאחר מכן השתנה צורה fibroblastic לאחר המעבר. שלישית, תאים הורחבו monolayer לאחר תת ( איור 2 ג ). תאים לא מובחנים לא נכללו בשלב זה. לאחר מכן, התאים הורחבו ומחויבים לתאים דמויי פיברובלסטים5-7 ימים בתרבות monolayer (D10 + 10 + 7). הרביעית, כאשר hiPSC-fibroblastic כמו תאים (hiPSC-F) הגיעו כ -90% מפגש, הם היו המושרה כדי להבדיל לתוך chondrocytes באמצעות תרבות גלולה 3D ( איור 2 ) 10 .
אפיון של hiPSC-Chon כדורי:
HiPSC-F היו מתורבת 15 צינורות פוליפרופילן מ"ל ב גלולה במשך 21 ימים. תאים chondrogenic עשויים להרכיב במבחנה לייצר מטריצה תאיים אופייניים כאשר בתרבות צפיפות גבוהה. בסוף התרבות, אנו יכולים לראות צפיפות, כמו סחוס כמו צבירה, hiPSC-Chon גלולה, אשר היה עד 2-3 מ"מ ארוך 3 מ"מ עובי ( איור 2 ד ). התאים היו חיוביים עבור alcian כחול ( איור 3 א ) ו toluidine כחול ( איור 3B ) מכתים, אשר הצביע על successfבידול chondrogenic ul של כדורי hiPSC. ניתוח אימונוהיסטוכימיה עבור קולגן II ( איור 3 ג ) ו קולגן X ( איור 3D ) הוכיחו עוד כי כדוריות hiPSC-Chon פיתחה פנוטיפ דמוי chondrocyte. בקרות שליליות של אימונוהיסטוכימיה עבור קולגן II ו קולגן X בוצעו כדי להוכיח טוב יותר את מכתים חיובי (נתונים לא מוצג) 5 .
ניתוח sGAG בוצע גם לאחר בידול chondrogenic ( איור 3E ). תוכן sGAG התגלו hiPSC-chon pellets, hiPSC-F, EBs, ואת hiPSCs undifferentiated. תוכן ה- sGAG היה מבוקר בצורה בולטת יותר בפריטי hiPSC-Chon מאשר בקבוצות האחרות ( P <0.05). בשליטה החיובית של hmsc-chon, תוכן sGAG היה גם upregulated משמעותית ( P <0.05) לעומת hMSCs. עם זאת, התוכן sGAGבין hMSC pellets ו hiPSC-chon pellets לא הראו הבדל ( P > 0.05).
ביטוי גנים של דיפרנציאציה chondrogenic סמנים:
ביטוי גנים של סמנים בידול עבור השושלת אב קדמון ( SOX9 ו COL2 ) ו chondrocytes מובחן לחלוטין ( AGGRECAN ו COL10 ) שימשו כדי לאפיין את הפנוטיפ של כדורי chondrogenic ( איור 4 ). בהשוואות בין hiPSCs, hiPSC-F, ו- hiPSC- chon pellets, ביטויים של COL2 , COL10 , SOX9 ו- AGGRECAN היו באופן משמעותי upregulated ב hiPSC-Chon מאשר בקבוצות אחרות ( P <0.05). בשליטה החיובית של hmsc-chon, הביטוי של סמנים אלה היה גם upregulated משמעותית מאשר hmsCs ( P <0.05). עם זאת, ביטוי גנים בין HMSC pellets ו hiPSC-chon pellets לא הראו הבדלים ( P > 0.05). בסך הכל, תוצאות אלה מצביעים על תהליך בידול chondrogenic מוצלח מ iPSCs האדם.
איור 1: סקירה סקטית של הפרוטוקול. שיטה רב תרבותית שלב המשמש להבדיל iPSCs האדם לתוך chondrocytes, כולל : 1) הבחנה ספונטנית באמצעות היווצרות EB, 2) תול תוצאה של EBS, 3) monolayer תרבות התא לאחר תת תרבות, 4) 3D תרבות גלולה. פנוטיפ chondrocyte מוערך על ידי ניתוח היסטולוגית, ניתוח ביוכימי, ביטוי chondrogenic גנים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: הדור של chondrocytes מ hiPSCs. ( א ) היווצרות EB על D10. סולם בר = 100 מיקרומטר. ( B ) תולדה תא מ EBS על D10 + 10. סולם בר = 100 מיקרומטר. ( ג ) תרבות תא monolayer על D10 + 10 + 7. סולם בר = 100 מיקרומטר. ( D ) 3D תרבות גלולה. נתון זה השתנה ממחקר הקודם שלנו 5 . אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: אפיון של hiPSC-Chon כדורי. ( א ) מכתים כחול Alcian ו ( ב ) toluidine מכתים כחול של glycosaminoglycans ו proteoגליקנים. סולם בר = 100 מיקרומטר. ( C ו- D ) אימונוהיסטוכימיה עבור קולגן II ו קולגן X. קנה מידה בר = 100 מיקרומטר. ( E ) אפיון ביוכימי של hiPSC-chon pellets לעומת hiPSCs, EBs, ו- hiPSC-F לעומת hmsc-chon לעומת hMSCs. SGAG לכל DNA. הבר מייצג את הממוצע ± SEM. N = 3, * P <0.05. נתון זה השתנה ממחקר הקודם שלנו 5 . אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4: ניתוח ביטוי גנים. RT-QPCR ניתוח ביטוי גנים של סמנים בידול chondrogenic ( COL2 , COL10 , SOX9 , ו AGGRECAN ) ב hiPSC-Chon לעומת hiPSCs ו hiPSCF לעומת hMSC-Chon לעומת hMSCs. הבר מייצג את הממוצע ± SEM. N = 3, * P <0.05. נתון זה השתנה ממחקר הקודם שלנו 5 . אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאן, אנו מספקים פרוטוקול כדי ליצור chondrocytes מ PBCs באמצעות iPSCs. מכיוון שתוכניות PBC נפוצות יותר ונמצאות בשימוש נרחב בתחום הקליני, הן מוצגות כחלופה פוטנציאלית לתכנות מחדש. במחקר זה, נוקבים וקטורים (EV) שימשו כדי לתכנת מחדש PBCs לתוך iPSCs, בעקבות השיטה שנקבעה על ידי ג 'אנג et al. 11 . גישה זו נטולת אינטגרציה אינה כוללת שילוב של גנוטוקסיטיזם הקשור לנגיף, אשר מאמינים כי יש לו השפעה רחבה בתחום הקליני 12 , 13 . היעילות של תכנות מחדש של יצירת iPSCs ללא אינטגרציה של תאי דם במחקר זה היה מרוצה. יותר מ 30 iPSCs יכול להיות מיוצר מ 2 מ"ל של דם היקפי. לכן, PBCs יש פוטנציאל להיות תאים זרע המשמש לייצור iPSCs עבור הנדסת סחוס ויישומים קליניים אחרים.
השלבים העיקריים של differe chondrogenicNtiation מ hiPSCs כללו: היווצרות EB, תול תא מן EBs, תרבות monolayer, תרבות 3D גלולה. Unifferentiated hiPSC מושבות הם גזור לתוך חתיכות קטנות יותר באמצעות מחט זכוכית מצוירת באש. השיטה המכנית, אם כי טכנית יותר, עדיף על עיכול אנזימטי (כגון dispase או collagenase) בגלל הנזק מופחת בגודל ספציפי (50-100 מיקרומטר בקוטר) בעת הרכישה. יתר על כן, עיכול מכני יכול להשליך באופן ידני של תאים מזין, אשר ידכא את ההבחנה hiPSC. HiPSCs להבדיל באופן ספונטני ליצור EBs, אשר מאופיינים כמו תלת מימדי, אגרגטים רב הסלולר עם גבולות חלקה. כמה EBS יכול מקבץ יחד כדי ליצור צורות לא סדירות. על מנת לשמור על EBS בתנאים טובים, פחות מ 100 EBS מתורבתים 100 מ"מ, צלחת פטרי חסין, עם 10 מ"ל של המדיום היווצרות EB. כ -50 EBS בצלחת אחת 100 מ"מ נחשב הכי טוב ריכוז. EBs הם seeded מכן ב עד 10 ס"מ, מנות מצופות ג'לטין עם בינוני תרבות בסיסי. צפיפות ההתפלגות של EBS חשובה לתוצאה מספקת של EBS. פחות מ 100 EBS מתורבתים על צלחת 100 מ"מ. בתוך 10 ימים של תרבות, תאים fibroblastic הם בהדרגה outgrown והורחב מן EBS. הצעד monolayer מבוצעת כדי להוציא תאים שרידי לא מזוהה נוכח EBS, כמו גם להרחיב תאים מחויבים השושלת mesenchymal. 0.5-1 x 10 6 תאים הם seeded צלחת 100 מ"מ לתרבות תאים monolayer. הביטוי של סמנים משטח התא על hiPSC-F נותחו על ידי ניתוח זרימת cytometric במחקר הקודם שלנו 5 . התוצאות הראו כי רוב hiPSC-F לידי ביטוי CD73 (81.81 ± 2.05%) ו CD105 (endoglin, 81.90 ± 1.61%), אשר ידועים להיות סמנים חיוביים mesenchymal האדם. יתר על כן, שישה iPSCs שונים תא גזע עובריים אנושיים (ESC) שימשו לשחזר שיטות אלה.
"הבידול chondrogenic המושרה של תאים pluripotent הוא גם תהליך מפתח מורכב.למרות זאת, המדידה chondrogenic הקלאסי נוצל עבור אינדוקציה של chondrogenesis מ hiPSCs TGF-beta1 ו dexamethasone מתווספים בינוני תרבות גלולה. הוכחו יש השפעה משמעותית על יכולות פוטנציאליות chondrogenic 14. הבדל נוסף פרוטוקולים אחרים היה ריכוז של 10% ITS, שהוא הרבה יותר גבוה מאשר דיווחו בדרך כלל 1% ITS 15 , 16. 1% ITS בתוספת 10% FBS משופרים היווצרות סחוס בשיטות אחרות 17 , 18. ITS כתחליף בסרום יכול לקדם התפשטות chondrocyte והיווצרות ולשמור על פנוטיפים chondrogenic.על מנת להחליף את הרכיבים החייתיים של FBS, שדרגנו את הריכוז של ITS ל 10%, אשר הוכח כדי פרומו יעילבידול chondrocyte 7 .צפיפות גבוהה בתרבית תאים הוא גורם חיוני נוסף בידול chondrogenic. ישנן שיטות רבות אחרות בתרבית תאים שניתן להשתמש בהם כדי לגרום בידול chondrogenic, כגון תרבות micromass, שיתוף תרבות עם תאים אחרים, תרבות ביו מבוסס, ומניפולציה גנטית 1 , 19 , 15 . 3D תרבות גלולה במחקר שלנו, אשר התוצאות של צפיפות תא גבוהה אינטראקציה תא תא גבוהה, קל יותר לבצע ללא תאים או חומרים אחרים. מאז זה מתבצע צינורות 15 צנטריפוגה מ"ל, מגבלה אחת היא כי זה יכול לשמש רק בקנה מידה קטן assond הבחנה chondrogenic. עם זאת, 96-גם צלחות עם תחתית עגולה יכול לשמש חלופה מבטיחה 7 . לכן, שיפור אחר לשיטות התרבות יכול לקדם את היעילות של chondrogenicבידול במבחנה . במחקר שלנו, אינדוקציה chondrogenic במשך 21 ימים נעשה תחת מצב ללא תסמונת ללא xeno, שבמהלכו כל הרכיבים הקשורים לבעלי חיים הוסרו. לכן, ההליך במחקר שלנו הוא הסתגל עבור יישומים קליניים עתידיים.
הוא האמין כי תאי גזע אוטולוגיים יהיה הבחירה האידיאלית עבור תיקון הסחוס, שכן הם עשויים לא רק ירידה דחייה, אלא גם להשיג התחדשות רקמות על ידי ניצול של הקורס הטבעי של התפתחות עובריים 20 , 21 . עם זאת, הם נמצאו פוטנציאל מוגבל שגשוג במבחנה 22 . לכן, שיטה נטולת אינטגרציה ליצירת chondrocytes מ PBCs באמצעות iPSCs עשוי להיות גישה מבטיחה יותר עבור הנדסת רקמות סחוס. עם השיטה שלנו, 2 מ"ל של דם יכול להיות מספיק כדי לגרום chondrocytes ספציפיים החולה הדרוש defec הסחוסTs. יתר על כן, השתמשנו גם hMSCs כבקרה חיובית להשוות עם תאים מובחנים מ iPSCs, אשר הציע כי iPSCs יש פוטנציאל chondrogenic בידול פוטנציאליים.
לסיכום, מחקר זה הוכיח כי PBCs יכול לשמש מועמדים עבור התחדשות chondrocyte. זה יכול עוד לשקף את הכיוון העתידי לייצר תאים זרע לתיקון סחוס בגישה המטופל ספציפי וחסכוני לרפואה רגנרטיבית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לגלות.
Acknowledgments
המחברים מבקשים להודות לזיאובין ג'אנג על הפלסמיד שלו. אנו מודים גם שאורונג גאו ו Qianfei ואנג על עזרתם סוג במהלך הניסוי. מחקר זה נתמך על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (No.81101346, 81271963, 81100331), פרויקט הכשרונות הגבוהים בבייג'ינג 215 (No.2014-3-025), ובית החולים צ'או-יאנג בבייג'ינג (לא . CYXX-2017-01), ואת הנוער החדשנות לקידום האגודה של האקדמיה הסינית למדעים (YL).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Knockout DMEM | Invitrogen | 10829018 | Basal medium used for hiPSC culture and EB formation medium |
| Knockout Serum Replacement (KSR) | Invitrogen | 10828028 | A more defined, FBS-free medium supplement used for hiPSC culture and EB formation medium |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | sh30070.03 | Used for hiPSC culture and EB formation medium,offers excellent value for cell culture |
| Nonessential amino acids | Chemicon | TMS-001-C | Used as a growth supplement in all the cell culture medium, to increase cell growth and viability |
| L-glutamine | Invitrogen | TMS-002-C | An amino acid required for cell culture |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF) | Peprotech | 100-18B | A cytokine used for sustaining the pluripotency and self-renewal of hiPSCs |
| Dispase | Invitrogen | 17105041 | Used for hiPSC dissociation for subculture |
| DMEM | Gibco | C11960 | Basal medium used for MSC culture medium |
| 0.1% gelatin | Millipore | ES-006-B | Used for cell attachment onto the dishes |
| 0.25% trypsin/EDTA | Gibco | 25200072 | Used for cell dissociation |
| DPBS | Gibco | 14190250 | A balanced salt solution used for cell wash or reagent preparing |
| 2-mercaptoethanol | invitrogen | 21985023 | Used as a growth supplement in all the cell culture medium. |
| ITS | invitrogen | 41400045 | Insulin, Transferrin, Selenium Solution.Used for chondrogenic differentiation. |
| Ascorbic acid | Sigma | 4403 | Known as vitamin C. It helps in active growth and has antioxidant property. |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360070 | Added to cell culture medium as an energy source in addition to glucose. |
| Transforming growth factor-beta 1 | Peprotech | AF-100-21C | A cytokine that regulate cell proliferation, growth and chondrogenic differentiation. |
| Rabbit polyclonal antibodies against Collagen II | Abcam | ab34712 | This antibody reacts with Type II collagens,which is specific for cartilaginous tissues. |
| Mouse monoclonal antibodies to Collagen X | Abcam | ab49945 | This antibody reacts with Type X collagen,which is a product of hyperthrophic chondrotocytes. |
| Permount | Fisher Scientific | SP15-100 | For mounting and long-term storage of slides |
| Toluidine blue | Sigma | 89640 | Used for proteoglycans detection. |
| Alcian blue | Amresco | #0298 | Used for glucosaminoglycans detection. |
| Papain | Sigma | P4762-25MG | Used to digest chondrogenic pellets. |
| Dimethylmethylene blue | Sigma | 341088-1G | Used to quantitate glycosaminoglyans |
| Chondroitin sulfate sodium salt from shark cartilage | Sigma | C4384-250MG | Used to draw the standard curve for sGAG content measurement. |
| Qubit dsDNA HS assay kit | Invitrogen | Q32851 (100) | Used to determine DNA content |
| TRIzol | Invitrogen | 15596018 | Used for RNA isolation from cells |
| Reverse Transcriptase System | Promega | A3500 | Used to convert RNA into cDNA |
| SYBR FAST qPCR kit Master Mix | Kapa | KK4601 | Used for Real-time PCR |
References
- Diekman, B. O., et al. Cartilage tissue engineering using differentiated and purified induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (47), 19172-19177 (2012).
- Park, I. H., et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell. 134 (5), 877-886 (2008).
- Loh, Y. H., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human blood. Blood. 113 (22), 5476-5479 (2009).
- Zhang, X. B. Cellular reprogramming of human peripheral blood cells. Genomics Proteomics Bioinformatics. 11 (5), 264-274 (2013).
- Li, Y., et al. Reprogramming of blood cells into induced pluripotent stem cells as a new cell source for cartilage repair. Stem Cell Res Ther. 7 (31), (2016).
- Canene-Adams, K. Preparation of formalin-fixed paraffin-embedded tissue for immunohistochemistry. Methods Enzymol. 533, 225-233 (2013).
- Solchaga, L. A., Penick, K. J., Welter, J. F. Chondrogenic differentiation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells: tips and tricks. Methods Mol Biol. 698, 253-278 (2011).
- Oldershaw, R. A., et al. Directed differentiation of human embryonic stem cells toward chondrocytes. Nat Biotechnol. 28 (11), 1187-1194 (2010).
- Monje, L., Varayoud, J., Luque, E. H., Ramos, J. G. Neonatal exposure to bisphenol A modifies the abundance of estrogen receptor alpha transcripts with alternative 5'-untranslated regions in the female rat preoptic area. J Endocrinol. 194 (1), 201-212 (2007).
- Teramura, T., et al. Induction of mesenchymal progenitor cells with chondrogenic property from mouse-induced pluripotent stem cells. Cell Reprogram. 12 (3), 249-261 (2010).
- Su, R. J., et al. Efficient generation of integration-free ips cells from human adult peripheral blood using BCL-XL together with Yamanaka factors. PLoS One. 8 (5), e64496 (2013).
- Carey, B. W., et al. Reprogramming factor stoichiometry influences the epigenetic state and biological properties of induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 9 (6), 588-598 (2011).
- Okita, K., et al. An efficient nonviral method to generate integration-free human-induced pluripotent stem cells from cord blood and peripheral blood cells. Stem Cells. 31 (3), 458-466 (2013).
- Staerk, J., et al. Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 7 (1), 20-24 (2010).
- Qu, C., et al. Chondrogenic differentiation of human pluripotent stem cells in chondrocyte co-culture. Int J Biochem Cell Biol. 45 (8), 1802-1812 (2013).
- Guzzo, R. M., Gibson, J., Xu, R. H., Lee, F. Y., Drissi, H. Efficient differentiation of human iPSC-derived mesenchymal stem cells to chondroprogenitor cells. J Cell Biochem. 114 (2), 480-490 (2013).
- Koyama, N., et al. Human induced pluripotent stem cells differentiated into chondrogenic lineage via generation of mesenchymal progenitor cells. Stem Cells Dev. 22 (1), 102-113 (2013).
- Liu, X., et al. Role of insulin-transferrin-selenium in auricular chondrocyte proliferation and engineered cartilage formation in vitro. Int J Mol Sci. 15 (1), 1525-1537 (2014).
- Guzzo, R. M., Scanlon, V., Sanjay, A., Xu, R. H., Drissi, H. Establishment of human cell type-specific iPS cells with enhanced chondrogenic potential. Stem Cell Rev. 10 (6), 820-829 (2014).
- Goepfert, C., Slobodianski, A., Schilling, A. F., Adamietz, P., Portner, R. Cartilage engineering from mesenchymal stem cells. Adv Biochem Eng Biotechnol. 123, 163-200 (2010).
- Ingber, D. E., et al. Tissue engineering and developmental biology: going biomimetic. Tissue Eng. 12 (12), 3265-3283 (2006).
- Yoshida, Y., Yamanaka, S. Recent stem cell advances: induced pluripotent stem cells for disease modeling and stem cell-based regeneration. Circulation. 122 (1), 80-87 (2010).
