Summary
Polyurethan kateter indsættelse i aorta lumen og sutur ligatur af aorta fremkalde kronisk hypoxi skyldes hypoperfusion af adventitial vasa vasorum. I denne artikel beskrives en roman dyremodel af abdominalt aortaaneurisme (AAA) med karakteristika svarende til AAA i mennesker.
Abstract
Adventitial vasa vasorum (VV) giver ilt og næring til aortavæggen. Iltmangel i aorta væggen kan forårsage forstørret abdominale aortaaneurismer (AAA). Denne artikel introducerer og beskriver en standardprotokol, der bruges til at fremkalde AAAs gennem adventitial VV hypoperfusion lavet med en kombination af polyurethan kateter indsættelse i aorta lumen og sutur ligatur af den infrarenal abdominale aorta.
Protokollen indebærer anvendelse af mandlige rotter vejer 300-400 g, som leveres mad og vand ad libitum. Efter laparotomi med en ventrale midterlinjen abdominal snit udføres eksfoliering af aorta, som blokerer blodtilførslen fra perivascular væv. Aortotomy med et lille snit ved siden af nyrearteriestenose grene er udført, og en polyurethan kateter er indsat ved hjælp af en 18-gauge iboende nål. Efter reparation indsnit, stramme ligatur af aorta over kateter blokke VV blod flyde fra den proksimale retning gennem aorta væggen uden at forstyrre aorta blodgennemstrømningen. Denne teknik kan fremkalde en AAA med progressive aorta dilatation.
Den største fordel ved denne model er, at VV hypoperfusion forårsager væv hypoxi og udviklingen af en infrarenal AAA, som har morfologiske og patologisk kendetegn svarer til en menneskelig AAA.
Introduction
Den abdominale aorta består af følgende tre lag: indre vaskulære væg (intima), mediale lag (medier) og ydre vaskulære væg (adventitia), og af disse, adventitia har en unik blodforsyning system kaldet vasa vasorum (VV). Aorta væv leveres med ilt gennem adventitial VV perfusion og simpel ilt diffusion fra aorta blod flow1. Den abdominale aorta har dog geografisk, mindst fordelingen af VVs i forhold til det i andre dele af aorta. 2
En tidligere undersøgelse rapporterede på væv hypoxi i menneskelige abdominalt aortaaneurisme (AAA) vægge med tykke intraluminal Trombe (ILT)3. Derudover har været vist, at en adventitial VV i aneurysmal vægge er tilstoppet med arteriosklerotisk ændringer på et betydeligt højere sats, som er forbundet med væv hypoxi i AAA vægge4. Baseret på disse resultater, blev en roman gnaver model af AAA oprettet ved at inducere adventitial VV hypoperfusion5. I denne model forårsaget VV hypoperfusion væv hypoxi og udviklingen af en infrarenal AAA, som havde morfologiske og patologisk kendetegn svarer til en menneskelig AAA6. Prime eksempler var tilstedeværelsen af ILTs og ophobning af hyperplastiske adipocytter6, og potentiale til at forårsage brud7,8. Disse resultater har været sjældent observeret i tidligere gnavere modeller. Derfor kan denne model bidrage væsentligt til en dybere forståelse af den mekanisme, der er ansvarlig for udvikling af AAA og brud. Vi introducere og beskrive en standardprotokol, der bruges til at fremkalde AAAs gennem adventitial VV hypoperfusion, og vi forklare, hvordan man fremkalde hypoxi i aorta væggen ved hjælp af kirurgiske teknikker.
Protocol
dyrs pleje og eksperimenter blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne i Hamamatsu University skole af medicin dyret pleje Udvalget på Center for Animal Care.
1. kirurgisk Procedure for oprettelse af Model
Bemærk: placere de kirurgiske instrumenter i en perle sterilizer for 10 s præoperativt. Bruge sterile handsker intraoperatively.
- Brug mandlige rotter vejer 300-400 g. rotter adgang til mad og vand ad libitum.
- Bedøver rotte med isofluran indånding (2,0-3,0 mL/L). Bekræfte korrekt anesthetization af tå knivspids.
- Barbere hår på maven med en barbermaskine, og krat maven med alkohol og en povidon-jodopløsning.
- Placere rotten i den liggende stilling på driften tabellen. Bruge vet salve på rotten ' s øjne til at forhindre tørhed under anæstesi.
- Udføre en laparotomi med en ventrale midterlinjen abdominal snit ved hjælp af en saks. For at sikre en klar kirurgiske felt, pakke abdominal indholdet inde i bughulen med steril gaze ved hjælp af en såret retractor.
- At løsne aorta fra perivascular væv, forsigtigt samle op og rive retroperitoneum med pincet at eksponere aortavæggen og eksfoliere infrarenal aorta i retroperitoneal rummet fra niveauet for den venstre nyre-vene til tvedeling fra den perivascular væv ( figur 1A).
- Ligate de fartøjer, der forgrener sig fra den abdominale aorta med en 5-0 silke snor til blok blod levering på et tidspunkt fra aorta, der ikke indsnævre aorta lumen.
- Til at blokere aorta blodgennemstrømning, placere vaskulære clips lige under nyrearteriestenose og lige over tvedeling af aorta.
Bemærk: Størrelsen af klippene skal være større end aorta diameteren at blokere blodtilførslen helt. En midlertidig 5-0 silke snor ligatur er også tilstrækkeligt for at blokere blodgennemstrømning i stedet for klippene. - Svarende til at skabe en dot blødning på overfladen af aorta muren, skæres den forreste aorta væggen ved hjælp af en mikro-saks 5 mm distalt fra aorta klippet, støder op til nyrearteriestenose grene, for at indsætte en polyurethan kateter.
- Indsætte en polyurethan kateter (udvendig diameter 0,55 mm, indvendig diameter 0,37 mm) ved hjælp af en 24-gauge indlagte nål grundt gennem snit til at vaske væk blodet i aorta med vand. Administrere en 1 mL sprøjte fyldt med vand i polyurethan kateteret og vaske væk de resterende blodet i aorta med vand. Efter vanding, fjerne kateteret fra aorta.
- Før du isætter en polyurethan kateter (udvendig diameter 1,20 mm, indvendig diameter 0,94 mm) ved hjælp af en 18-gauge iboende nål, skære polyurethan kateteret 10 mm lang ( figur 1B).
- Indsæt afskårne stykke af polyurethan kateteret ind i aorta lumen fra indsnit i trin 1.9. Helt sted 10-mm kateteret ind i aorta lumen, og flytte midtpunktet af kateter til at matche placeringen i indsnittet (dvs., dække snit med kateter).
- Reparation snit med afbrudte suturer ved hjælp af en 8-0 monofilamenter streng ( figur 1 c).
- Ligate den abdominale aorta ved hjælp af en kombination af 5-0 silke snor og polyurethan kateteret ( fig. 1 d).
Bemærk: Aorta lumen kan vedligeholdes af den iboende kateter. Ligate aorta fast for at forhindre misaligning kateter holdning. Kirurgen ' s knude anbefales, da det tilføjer en ekstra twist, når binde knude, danner en dobbelt overhånd knude, første kast og en ekstra tur giver mere friktion og kan reducere løsne. - Efter ligatur, fjerne den vaskulære klip ved aorta tvedeling, og fjern derefter, vaskulære klippet nedenfor nyrearteriestenose gendanne antegrad blodgennemstrømning. Bekræfte brutto aorta pulsering.
- Lukker den abdominale snit i to lag, bughinden og andre lag, med en 4-0 polypropylen sutur. Stramt sutur snit for at forhindre en fremspringende orgel.
- Anvend aktuel lidocain på den abdominale snit. Placere rotten på en varmepude, indtil bevidsthed returnerer. Efterlad ikke en rotte automatiseret indtil den har genvundet tilstrækkelig bevidsthed for at opretholde brystbenet recumbency. Returnerer ikke en rotte, der har gennemgået operation til selskab med anden rats, indtil det er fuldt tilbagebetalt.
- Overvåge rotten nøje efter operationen. Indsprøjtes en bolus af sterilt saltvand (1,0-2,0 mL) subkutant, hvis en rotte viser tegn på angst eller kroppen vægttab.
- Efter operationen, observere tidsforløb udviklingen af den udvidede aorta på en ultralyd echogram. Foranstaltning den maksimale diameter fra indersiden kant til den udvendige kant af den abdominale aorta som beskrevet 5.
2. Høst, fastsættelse, og bananskud-van Gieson (EVG) farvning
- tyve-otte dage efter operationen, administrere natrium pentobarbital ≥ 100 mg/kg intraperitoneal at aflive rats.
- Skar rotten ' s abdominal hulrum ventrally. Gøre den første indsnit ved hjælp af en skalpel. Høste aneurisme ved hjælp af saks og placere de høstede aortas i 10% neutralt buffered formalin for 24-48 h.
Bemærk: Kirurgen skal være omhyggelig med at forhindre skade til aorta og andre organer, når udsætter aneurisme. Et forhøjet abdominal organ bør overholdes, med angivelse af AAA dannelse. figur 2 viser et billede i vivo og ex vivo billede; denne repræsentativt udsnit af AAAs er ikke bristet. - EVG farvning 9
- Løsning forberedelse
- Forbered Verhoeff ' s hæmatoxylin ved at blande følgende i den givne rækkefølge: alkoholholdige hæmatoxylin 20 mL, 10% ferrichloridopløsning 8,0 mL, og Lugol ' s jod 8 mL. Bland løsning mellem hver tilsætning. Denne opløsning kan tilberedes frisk resultatfilen.
- Forbered Van Gieson ' s løsning ved at blande 1% syre fuchsin 1 mL og mættede picrinsyre syre 45 mL. Lad det stå natten over og bland godt. Denne løsning er holdbar i 2 uger.
- Forberede differentiering løsning (2% ferrichloridopløsning) ved at blande 10% FeCl 3 10 mL i 40 mL destilleret vand. Denne opløsning kan tilberedes frisk resultatfilen.
- Forbered 5% hypo ved at opløse 5.0 g natrium thiosulfate i 100 mL destilleret vand. Denne opløsning er stabil i 1 år.
- Farvning procedure
Bemærk: Se reference 9 for detaljer.- Kort, fugte de faste paraffinsnit af de høstede aortas i destilleret vand for 10 min. placere aortas i Verhoeff ' s hæmatoxylin i 25 min. Skyl med vand og dip 10 - 30 gange i differentiere løsning (2% FeCl 3). Skylles i vand. Sted i 5% hypo i 1 min. vask i vand. Sted i Van Gieson ' s løsning i 5 min.
- Dehydrate med alkohol i følgende rækkefølge: 75%, 90%, 95%, 100% og 100% alkohol for 30 s hver. Så klart i xylen i 5 min, to gange. Sted på en coverslip med harpiksholdige montering medium.
Bemærk: elastiske fibre synes blå-sort til sort; kerner: blå til blaCK; kollagen: rød; og andre væv elementer: gul.
- Løsning forberedelse
Representative Results
De beskrevne operationsteknikker oprette en roman dyremodel af en kronisk hypoxi-induceret aortaaneurisme ved hjælp af en kombination af polyurethan kateter indsættelse og sutur ligatur af den infrarenal abdominale aorta i rotter. Rotter er beskrevet i afsnittet protokol var aflivede 28 dage efter indgrebet. Aortas blev høstet og afbildet for at visualisere aneurisme dannelse. Figur 2 viser udviklingen af fusiform AAA. De øvre og nedre ender af aorta i ex vivo har en normal diameter uden dilatation. Aorta diametre blev målt ved hjælp af transabdominal ultralyd (figur 3). Diameter generelt når sin maksimale størrelse på omkring 14 dage efter procedure; derefter, det er uændret eller øger lidt. Figur 4 viser de histopatologiske billede af aneurisme på sin maksimale diameter efter EVG farvning. Billede af væv dag 28 (aneurisme) viste fremtrædende nedbrydning af elastiske fibre sammenlignet på dag 0.
Figur 1: Kirurgiske procedurer til at fremkalde en abdominalt aortaaneurisme (AAA).
(A) infrarenal aorta er ekspanderet fra det omgivende væv. (B) en polyurethan kateter skære 10 mm lang er indsat gennem et lille snit i aorta. C indsnit er repareret med en 8-0 monofilamenter sutur og blodtilførslen er genoprettet. (D) aorta er forbundet med en 5-0 silke sutur over de indsatte kateter. Skalalinjen = 5 mm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Postoperativ repræsentative resultater.
Makroskopisk se på postoperative dag 28 viser udviklingen af fusiform abdominale aortaaneurismer. Forhøjede margenen af retroperitoneum svarer til yderkanten af aneurisme (brudte linjer, venstre). De øvre og nedre ender af aorta i ex vivo er normale (til højre). Skalalinjen = 3 mm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Maksimalt aorta diametre måles ved hjælp af transabdominal ultralyd.
Aorta diameteren steget støt i denne rotte model. Aorta diametre er præsenteret som en gennemsnit ± standardafvigelse (n = 12). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Repræsentative billeder af aneurysmal væv med Elastica van Gieson farvning.
Histologisk vurdering med EVG farvning viser den degenerative elastisk lamina i medier og dannelsen af en intraluminal Trombe 28 dage efter indgrebet (til højre). Elastisk fiber opsplitning i aorta medierne og sparsom kollagen fiber i aorta adventitia er observeret på dag 28. Dag 0 er før proceduren (venstre). Skalalinjen = 500 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Fysiologiske betingelser, er de inderste lag af aorta væggen næret af diffusion fra den luminale blodgennemstrømning, mens de ydre og mellemste lag er næret af VV, som trænger ind fra adventitia i den mediale VV1. VV blod flyde ind i abdominal aorta væggen kan stamme fra følgende tre retninger/områder: (1) proksimal retning gennem aorta væggen, (2) distal retning gennem aorta væggen, og (3) perivascular væv10. Tidligere, vores histologiske analyse af humane væv identificeret betydelig stenose eller okklusion af VV i AAA væg, tyder på, at VV blod flyde ind i abdominal aorta væggen kan være nedsat4. Det er et meget vigtigt punkt i denne protokol, at en infrarenal AAA var forårsaget af en kombination af polyurethan kateter indsættelse og sutur ligatur af den infrarenal abdominale aorta. At omhyggeligt eksfoliere væv lag, skal kirurger problemfrit indsætte en polyurethan kateter i aorta og fast ligate aorta for at forårsage kronisk hypoxi skyldes hypoperfusion af adventitial VV og aneurisme dannelse. Brug af disse teknikker, blodgennemstrømningen i aorta væggen er derfor faldet, og en lokal hypoksiske miljø er induceret. Blood flow reduktion og hypoxi-induceret aneurisme dannelse angiver at VV blod flyde ind i abdominal aorta væggen spiller en rolle i patogenesen af AAA dannelse.
Specifikt, en aorta aneurisme model skal opfylde følgende betingelser: en 1.5-fold stigning i det vaskulære diameter i forhold til baseline, degeneration af tunica media, og betændelse i aorta væggen. De mest populære dyremodeller har været konstrueret ved at inducere inflammatoriske respons ved hjælp af stoffer som CaCl211, elastase12og angiotensin II13. Disse modeller kan have en høj reproducerbarhed og naturligvis medføre patologiske forandring, og de har været almindeligt anvendt i forskningsundersøgelser. Vi vurderede i vores model, aorta diameteren bruger ultralyd hver 7 dage fra før proceduren blev udført indtil dag 28 efter procedure (figur 3). Resultaterne viste, at aorta diameteren moderat øget over 28 dagene, der angiver, at denne ændring i diameter er lig den i tidligere gnavere modeller. Brutto observation vaskulære formularens angivet en glat fusiform figur (figur 2). Dag 28, vi ofrede rotter og udføres histopatologisk analyse af aorta væv, der blev inddrevet. Rive og forsvinden af elastisk og kollagen fibre af tunica media og adventitia blev observeret (figur 4). Derudover var inflammatoriske celler, såsom makrofager, til stede fra tunica adventitia til tunica media.
I øjeblikket er tilgængelige behandlingsmuligheder for AAAs begrænset til kirurgisk reparation og endovaskulære stent podning, med dødeligheden af 30-50% hos patienter med AAA brud14. Dog er ingen narkotika blevet godkendt til klinisk brug at behandle AAAs. Der er debat at der er forskelle i de patologiske fund mellem mennesker og etablerede dyremodeller anvendes i AAA forskning. Ligheder i patogenesen mellem menneskelige AAA og AAA dyremodeller er afgørende for udviklingen af farmakologiske behandlinger. Med hensyn til effektiviteten af gnavere modeller er vores rotte model morfologisk ligner mennesker i form af intraluminal Trombe5 og adipogenesis8. Desuden omkring 20% af rotter i denne undersøgelse havde AAA brud og døde inden for 28 dage efter indgrebet. Selvom aorta aneurisme brud er den mest kritiske hændelse for denne sygdom, brud er ualmindeligt med etablerede eksperimentelle AAA modeller, og mekanismen er endnu ikke blevet belyst. Derfor, denne model er nyttige for at forstå mekanismen af dilatation af aorta diameteren og ruptur af aneurismet.
Oprettelsen af denne model kræves for nogle kirurgiske procedurer. Forskere skal derfor praksis, at skabe denne model, som er en begrænsning af denne model. I fremtiden, vil vi gerne oprette en gnaver model, hvor vi kan mindske blodtilførslen ved gradvist fortykkelse VV vægge, hvilket resulterede i spontan aorta aneurisme.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Grants-in-Aid for videnskabelig forskning (B) (20291958) til N.U.; Grants-in-Aid for unge forskere (en) (25713024) til NZ
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| rat | Japan SLC.Inc | Slc:SD rat | Sprague–Dawley ratTM |
| povidone-iodine solution | Libatape Pharmaceutical Co., Ltd. | 4987335 111457 | |
| 5-0 silk string | Akiyama Medical MFG. CO.,LTD | JIS No.1 | |
| vascular clips | Natsume Seisakusho Co., Ltd. | C-42-S-2 | |
| polyurethane catheter (24-gauge indwelling needle) | MEDIKIT | 24G | Supercath Z4VTM, 24-gauge indwelling needle |
| polyurethane catheter (18-gauge indwelling needle) | MEDIKIT | 18G | Supercath Z3VTM, 18-gauge indwelling needle |
| 8-0 monofilament string | Ethicon Suture | c-42-S-2 | PROLENE Polypropylene Suture, Repair the incision with the suture |
References
- Wolinsky, H., Glagov, S. Comparison of abdominal and thoracic aortic medial structure in mammals. Deviation of man from the usual pattern. Circ Res. 25 (6), 677-686 (1969).
- Sano, M., et al. Lymphangiogenesis and angiogenesis in abdominal aortic aneurysm. PLoS One. 9 (3), e89830 (2014).
- Vorp, D. A., et al. Association of intraluminal thrombus in abdominal aortic aneurysm with local hypoxia and wall weakening. J Vasc Surg. 34 (2), 291-299 (2001).
- Tanaka, H., et al. Adventitial vasa vasorum arteriosclerosis in abdominal aortic aneurysm. PLoS One. 8 (2), e57398 (2013).
- Tanaka, H., et al. Hypoperfusion of the Adventitial Vasa Vasorum Develops an Abdominal Aortic Aneurysm. PLoS One. 10 (8), e0134386 (2015).
- Tanaka, H., et al. Imaging Mass Spectrometry Reveals a Unique Distribution of Triglycerides in the Abdominal Aortic Aneurysmal Wall. J Vasc Res. 52 (2), 127-135 (2015).
- Kugo, H., et al. The preventive effect of fish oil on abdominal aortic aneurysm development. Biosci Biotechnol Biochem. 80 (6), 1186-1191 (2016).
- Kugo, H., et al. Adipocyte in vascular wall can induce the rupture of abdominal aortic aneurysm. Sci Rep. 6, 31268 (2016).
- Lichtenberg, A., Cebotari, S., Tudorache, I., Hilfiker, A., Haverich, A. Biological scaffolds for heart valve tissue engineering. Methods Mol Med. 140, 309-317 (2007).
- Heistad, D. D., Marcus, M. L., Larsen, G. E., Armstrong, M. L. Role of vasa vasorum in nourishment of the aortic wall. Am J Physiol. 240 (5), H781-H787 (1981).
- Yoshimura, K., et al. Regression of abdominal aortic aneurysm by inhibition of c-Jun N-terminal kinase. Nat Med. 11 (12), 1330-1338 (2005).
- Azuma, J., Asagami, T., Dalman, R., Tsao, P. S. Creation of murine experimental abdominal aortic aneurysms with elastase. J Vis Exp. (29), (2009).
- Lu, H., et al. Subcutaneous Angiotensin II Infusion using Osmotic Pumps Induces Aortic Aneurysms in Mice. J Vis Exp. (103), (2015).
- United Kingdom, E. T. I., et al. Endovascular versus open repair of abdominal aortic aneurysm. N Engl J Med. 362 (20), 1863-1871 (2010).
