Summary
Hier zeigen wir einen neuartigen Ansatz zur Verwendung von hochauflösenden spectral-Domain optische Kohärenztomographie (HR-SD-OCT) Lieferung der Gen-Therapie-Agenten in den subretinalen Raum zu unterstützen, beurteilen seine areal Abdeckung und Photorezeptor Vitalität zu charakterisieren.
Abstract
HR-SD-OCT wird genutzt, um das Fortschreiten der Degeneration der Photorezeptoren in live Mausmodellen überwachen, bewerten die Lieferung von Therapeutika in den subretinalen Raum und Toxizität und Wirksamkeit in Vivozu bewerten. HR-SD-OCT in der Nähe von Infrarot-Licht (800-880 nm) verwendet und hat Optik speziell für die einzigartige Optik des Auges Maus mit Sub-µm-2 axiale Auflösung ausgelegt. Transgenen Mausmodellen der äußeren Netzhaut (Photorezeptoren) Degeneration und Steuerelemente wurden abgebildet, um das Fortschreiten der Erkrankung zu bewerten. Gezogenem Glas Mikronadeln wurden verwendet, um Sub retinalen Injektionen von Adeno-assoziierte Virus (AAV) oder Nanopartikeln (NP) über einen Trans-skleralen und Trans-choroidale Ansatz liefern. Sorgfältige Positionierung der Nadel in den subretinalen Raum bedurfte es vor einem kalibrierten Druck Injektion, die Flüssigkeit in den Sub-Netzhaut-Raum liefert. Real-Time subretinalen Chirurgie wurde auf unserer Netzhaut imaging-System (RIS) durchgeführt. HR-SD-OCT demonstriert schrittweise einheitliche Netzhautdegeneration durch Ausdruck einer toxischen mutierten menschlichen mutierten Rhodopsin (P347S) (RHOP347S) Transgene Mäuse. HR-SD-OCT ermöglicht konsequente Quantifizierung der Netzhaut Schichten. Nukleare Außenschicht (ONL) Dicke und Photorezeptor äußere Segment Länge (OSL) Messungen korrelieren mit Photorezeptor Vitalität, Degeneration oder Rettung. Die RIS-Delivery-System ermöglicht Echtzeit-Visualisierung von subretinalen Injektionen bei Neugeborenen (~ P10-14) oder erwachsener Mäuse und HR-SD-OCT sofort Karten areal Umfang und entscheidet über den Erfolg der Lieferung. HR-SD-OCT ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das den Erfolg der subretinalen Chirurgie bei Mäusen, zusätzlich zur Vitalität der Photorezeptoren in VivoMessung auswerten können. HR-SD-OCT kann auch verwendet werden, um einheitliche Tier Kohorten um das Ausmaß der Degeneration der Netzhaut, Toxizität und therapeutische Rettung in präklinischen Forschung Gentherapiestudien bewerten zu identifizieren.
Introduction
Forscher entwickeln Gentherapien für eine Vielzahl von Netzhaut und Netzhaut degenerativen Erkrankungen mit der Hoffnung der Übersetzung neuen Therapeutika in Behandlungen für menschliche Krankheit1,2,,3,4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11. Zeitbereich oder spectral-Domain optische Kohärenztomographie (SD-OCT) verwendet wurde, um die Aspekte der äußeren Netzhautdegeneration bei bestimmten Mausmodellen Krankheit12,13,14 untersuchen . HR-SD-OCT wurde nicht jedoch ausgiebig im Zusammenhang mit der Optimierung der Bewertung von Mausmodellen verwendet, um festzustellen, die Rate und räumliche Homogenität der Netzhautdegeneration oder im Rahmen der präklinischen Bewertung des Gens basierten Therapeutika, z. B. zu bewerten Sie Rettung, Toxizität oder der räumlichen Ausdehnung der Vektor Lieferung8,15,16. Sobald ein Maus-Modell vollständig charakterisiert ist, können die HR-SD-OCT Daten als eine informative und zuverlässige Ressource, um die Auswirkungen der Therapeutika Rettungs- oder Toxizität in Mausmodellen der Netzhautdegeneration17ausüben zu dienen. Viele Gruppen nutzen subretinale Injektion als eine Methode der Vektor Lieferung aufgrund seiner Effizienz bei transducing Photorezeptoren und retinalen Pigmentepithels (RPE) Pigmentzellen. Dies bleibt jedoch eine schwierige Methode zu meistern, angesichts der Tatsache, dass es in der Regel durch frei-Hand-Chirurgie von der Hornhautoberfläche erfolgt und oft mit Katarakt ist, Blutungen und unbeabsichtigte Netzhautablösungen auftritt, einfach durch Manipulation der hinteren Glaskörper. Viele Gruppen noch versuchen subretinale Injektionen blind und liefern das Virus mit manuellen Injektionen mit relativ großem Durchmesser Edelstahl Nadeln (34G)8,17,18,19 ,20,21,22und ein paar nutzt optische Kohärenztomographie (OCT) Bildgebung zur Bestätigung der ordnungsgemäßen Auslieferung des Vektors auf die Netzhaut8,17, 20 , 22. einige Verbesserungen in der Methode haben vor kurzem mit Microscale Nadeln, angetrieben von einem Mikromanipulator22beschrieben.
Wir präsentieren einen integrierten Ansatz hilft bei der Positionierung der Nadel und die Injektionen werden erleichtert durch eine benutzerdefinierte gerichtete Stereo-Ophthalmoskop entwickelt im Labor speziell für die Visualisierung im Inneren des kleinen Auges der Maus17, 23. die Verwendung von gezogenem Glas Mikronadeln in Verbindung mit der stereotaktischen Mikromanipulator bieten bessere Kontrolle der Nadelplatzierung mit keine chirurgischen Schnitt nach unten erforderlich (z. B. durch Bindehautrötung und Bindegewebe) vor dem Injektion. Die Verwendung des Drucks geregelt Mikro Injektor hilft liefern konsistente Einspritzmengen und die Injektion möglich ist, mit wesentlich höherer Stabilität, Präzision und viel langsamer als manuelle Injektionen durchgeführt durch eine handgeführte Spritze, dadurch verringert die Auftreten von Blase Injektion in das Auge. Die kleinere Nadel verhindert Leckage nach Nadel Rückzug, da der Pfad selbstdichtend ist. Um das Ausmaß der Injektion/Lieferung bewerten, verlassen viele Ermittlungsgruppen zu finden und zu beurteilen, inwieweit der erweiterten grün fluoreszieren (EGFP) Proteinexpression in der Netzhaut (Ausdruck Konstrukt geliefert durch den Vektor) areal am experimentellen Ende Punkt (Euthanasie) zur Bestätigung der erfolgreichen Injektionen11,19,20,24. Diesen Ansatz (OCT nicht nutzen), um sicherzustellen, dass chirurgische Erfolg verschwendet eine enorme Menge an Ressourcen chirurgische Verfahren Zeit-und Tiere, da alle Tiere mit (unbekannten) chirurgische Fehler werden, gefolgt mit sich wiederholenden Maßnahmen bis gepflegt müssen Euthanasie und Auge zu ernten (wenn EGFP gemessen wird). Bestätigung des Standortes der Injektion in der Netzhaut kann mit HR-SD-OCT um zu zeigen, dass die Injektion befindet sich zwischen der korrekten Schichten der Netzhaut (d. h. den subretinalen Raum) verbessert werden. HR-SD-OCT kann auch verwendet werden, sofort erfolglose versuchen (chirurgische Fehler) relevante Variablen in realen chirurgischen Zeit Verbesserung auf dem Ansatz identifizieren abzugrenzen. Wir fanden, dass HR-SD-OCT zahlreiche Vorteile im präklinischen gen Therapiestudien stellt ermöglicht schnelle quantitative Bewertung der äußeren Netzhautdegeneration ermöglicht Identifikation/Keulung von Versuchstieren die experimentelle Kriterien ( nicht entsprechen z. B. falsche subretinale Injektion), und auf direkte Follow-up-Bildgebung in der Region des Auges, wo Vektor geliefert wurde (wobei präklinische Wirkung am wahrscheinlichsten ist) sowie die Steuern Regionen wo Vektor wurde nicht übermittelt. Seit seiner Entwicklung, die Verwendung von SD-OCT hat weiterhin akzeptiert und von Augenheilkunde Forschern genutzt werden und gilt heute als den Standard der retinale Bildgebung in der Netzhaut wissenschaftliche Studien in der Maus oder Nagetier Modelle13,25. HR-SD-OCT und seine Software-Funktionen wurden in einzigartigen integrierten Möglichkeiten, um das Ziel der erfolgreichen Quantitative Gentherapie in Mausmodellen bei jedem Schritt in diesem Prozess, einschließlich Tiermodell Auswahl, Charakterisierung der Degeneration in gewählten weiter genutzt. Krankheitsmodelle, therapeutische Lieferung, Zuordnung von Vektor-Lieferung und Beurteilung der Toxizität/Wirksamkeit. Die Verwendung von HR-SD-OCT ermöglicht eine effizientere Wirkstoffforschung auf allen Ebenen des Prozesses. Hier beschreiben wir diese Ansätze, mit denen in unserem RNA Drug Discovery-Programm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tier-Protokolle wurden überprüft und genehmigt durch die institutionelle Animal Care und Nutzung Ausschüsse des VA WNY HCS und der University at Buffalo-SUNY. Tiere wurden nach den Vorgaben des Vereins for Research in Vision und Ophthalmology (ARVO) und der Deklaration von Helsinki eingesetzt.
(1) Maus-Modellen
- Identifizieren Sie Maus-Modellen einschließlich Kontrollen ausgewertet werden.
Hinweis: Bildgebung erfolgte für eine C57BL/6(J), hC1/hC1 / / mWT/mWT, ein teilweise vermenschlichten Netzhautdegeneration Mausmodell homozygot für menschlichen mutierten RHOP347S hC1 Allele auf dem Wildtyp (WT) Maus RHO+ / + Genotyp26 , 27, hC1 x BL/6(J), ein teilweise vermenschlichten Modell mit einer einzigen Kopie des mutierten menschlichen RHOP347S hC1 Allels auf der WT-Maus RHO+ / + Genotyp (hC1 /-/ / mWT/mWT) (erhält man durch Kreuzung hC1/hC1 / / mWT/mWT mit C57BL/6 () J) Mäuse). Die oben autosomal dominant Retinitis Pigmentosa (AdRP) Modelle sind auf dem C57BL/6(J) Hintergrund. Ein Maus-Modell, die homozygot für zwei Kopien des Gens menschlichen WT RHO des Mausrads RHO Ko Hintergrund war auch gebrauchte28,29. Diese Linie ist auf dem 129Sv Hintergrund. Wenn diese Linie auf dem 129Sv Hintergrund mit einem Maus- RHO -Ko überschritten wurde, tritt eine Einzeldosis von menschlichen RHO des Mausrads RHO Hintergrund. - Pflegen Sie die Tiere nach den Bedingungen für das experimentelle Design.
Hinweis: Die Tiere wurden in tierärztlichen Einheit (VMU) an der VA WNY HCS beibehalten. Mäuse wurden gefüttert, standard-Lab-Chow und angebaut unter 12 H:12 h Licht: dunkle Zyklen mit weichen fluoreszierende Overhead weiße Lichter mit etwa 300 Lux auf Käfig auf etwa 72 ˚.
(2) Maus-Augengel
- Bereiten Sie das optische Gel für retinale Bildgebung30 und chirurgischen Eingriffen verwendet.
- Kombinieren Sie 2 mg/mL w/V hohes Molekulargewicht (4 x 106 g/Mol Carbomer in sterilen 1 x Phosphat Buffered Saline (PBS).
- Mischen Sie bei Raumtemperatur, bis das Gel ein zähflüssiges optisch transparentes Gel bildet.
- Übertragen Sie das Gel in sterile Fläschchen und Zentrifuge in einer schwingenden Eimer Tabletop Zentrifuge bei 350 X g, eingeschlossene Luftblasen zu entfernen.
- Tragen Sie das Gel direkt auf die Hornhaut eine Schnittstelle zwischen der Maus Hornhaut und ein Premium-Deckglas (18 x 18 mm) erstellen.
(3) HR-SD-OCT-Bildgebung
- Sehen Sie das HR-SD-OCT-Gerät (Abbildung 1).
- Wiegen Sie das Tier um die richtige Dosis Betäubungsmittel zu bestimmen. Dann betäuben Sie die Maus über 25 µL/g Körpergewicht von 2,5 % Lösung von gepufferten 2,2,2-Tribromoethyl Alkohol (Avertin) Lösung über intraperitoneale Injektion (IP) zu, und fügen Sie die Augentropfen, um die Schüler zu erweitern, nachdem das Tier unbeweglich ist.
- Bestätigen Sie, dass das Tier vollständig durch eine Prise Zehe betäubt ist, und stellen Sie sicher, dass das Tier nicht reagiert.
- Schneiden Sie die Schnurrhaare und platzieren Sie den Mauszeiger auf den HR-SD-OCT-Schlitten.
- Positionieren Sie die Maus Auge direkt vor der Linse Kopfbedeckung und manipulieren Sie die Bühne Steuerelemente zu, bis die Hornhaut und Iris befinden. Halten Sie die Hornhaut, die durch die Anwendung von künstlicher Tränen hydratisiert.
Hinweis: Die Feineinstellung Mikromanipulatoren auf dem HR-SD-OCT-Schlitten werden verwendet, um die Maus so positionieren, dass die Schüler Blende zentriert und ausgerichtet ist. Die optische Kopfbedeckung ist dann fortgeschritten, bis die Netzhaut sichtbar wird und das Tier weiter angepasst wird, um das bestmögliche Bild erhalten. - Zunächst öffnen Sie das Softwareprogramm "Maus" und klicken Sie auf "Patient/Prüfung". Zweitens, klicken Sie "Patient" und geben Sie die relevante Informationen zur Identifizierung des Tieres im neuen Fenster "Patienten" und "speichern und beenden". Drittens: Klicken Sie "Prüfung" gefolgt von "Prüfung starten". Viertens: Klicken Sie "benutzerdefinierten Scan" und wählen Sie "rechteckige Volumen", wählen Sie OD oder OS für das Auge abgebildet werden, dann klicken Sie "Prüfung". Endlich, mit dem Ziel des Instruments und die Positionierung des Tieres um die Region von Interesse zu erhalten. Nach der Suche nach der richtigen Region entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit aus der Augenoberfläche mit einer sterilen Baumwolle Applikator kurz vor Bildaufnahme kippte um Bildqualität zu verbessern, dann klicken Sie auf "start Snapshot", und falls Sie ein gutes Bild erhalten, klicken Sie auf "Speichern" "Scan".
Hinweis: Typische Kennwerte für rechteckige HR-SD-OCT Bilder sind 900 a-Scans/b-Scan und 90 b-Scans/Bild. Aufgenommenen Bilder sind 1,4 x 1,4 mm. Die Region der Netzhaut abgebildet hängt von der spezifischen Experiment, aber die meisten Bilder sind mittig auf dem Sehnerv Kopf (ONH).
4. Beurteilung der Präsenz, die Rate und die Einheitlichkeit der äußeren Netzhaut-Degenerationen Modell
- Äußeren Netzhautdegeneration Modellevaluierung von HR-SD-OCT
- Erhalten Sie Tiere mit einem breiten Spektrum von Alter für die Kontrolle und die Versuchspersonen die Präsenz, die Rate und die Einheitlichkeit der äußeren Netzhautdegeneration Bewertung.
- Führen Sie HR-SD-OCT-Bildgebung auf mehrere Tiere in jedem Alter von beiden Kohorten (Krankheit und Normal). Verwenden Sie die Methode in 3.1.6 beschrieben, um die OCT-Bilder zu erhalten.
Hinweis: Daten können aus einer großen Kohorte von Tieren auf einmal die Geburtstage, die über einen großen Zeitraum (1 Jahr) verteilt haben, oder eine kleinen Kohorte von Tier kann verwendet werden, um mehrere Bilder zu sammeln, über eine längere Zeit (1 Jahr), um ähnliche Ergebnisse zu erzielen. - Öffnen Sie ein aufgezeichnetes Bild der HR-SD-OCT rechteckige Volumen und identifizieren die ersten b-Scan gemessen werden (idealerweise enthalten die ONH oder andere erkennbare Wahrzeichen) aus dem Ensemble von Bildern. Vergrößern Sie das Bild, um den Bildschirm mit der Zoomfunktion in die Software zu füllen.
- Öffnen Sie die gewünschte Anzahl der Bremssättel durch Rechtsklick auf das Bild des b-Scan und klicken Sie dann auf "Bremssättel" und klicken Sie schließlich auf soviele Bremssättel wie gewünscht (sie sind nummeriert von 1 bis 10). Stellen Sie sicher, dass die Bremssättel in der unteren rechten Ecke des Bildes auftauchen. Mit der Funktion "Konfigurieren Bremssattel" ordnen sie alle als "vertikale" im Winkel Block Spalte und schalten Sie die "Bremssattel Anzeigeort" erleichtern die gleichmäßige Platzierung über der Netzhaut und schließlich klicken Sie auf anwenden.
Hinweis: 1St Bremssattel auf der linken Seite des Bildes platziert werden soll, bei der Verarbeitung von Oculus dexter (OD) rechten Auges und 1St Bremssattel auf der rechten Seite des Bildes platziert werden soll, bei der Verarbeitung von Oculus sinister (OS) linkes Augenbilder. Dies führt zu einen nasalen zeitliche Orientierung aller Daten für das linke und das rechte Auge beim Plotten. - Mit der Computermaus bewegen jeden Bremssattel an die gewünschte Position (im Abstand von 2,0 mm) über die b-Bild, dass auf jeden Fall ein Bremssattel in der Mitte des Sehnervenkopfes, b-Scan-Bilder setzen, die es enthalten (diese Bremssattel auf Null gesetzt). Dann verwenden Sie die Maus zu klicken und ziehen den Bremssattel auf Länge des Interessenbereichs Span. Willkürlich gesetzt Bremssättel, die nicht messbare Regionen des b-Scan auf maximale Länge zu überlagern, und während der Datenanalyse zu ignorieren.
- Messen Sie die ONL Dicke mit den Bremssattel-Tools, indem Sie die Spitze des Sattels an die externe begrenzende Membran (ELM) und der Unterseite des Sattels an der Unterseite der äußeren plexiformen Schicht (OPL). Wiederholen Sie diesen Vorgang für jeden Bremssattel über die Netzhaut in Schritten von 0,2 mm. Speichern Sie die Messungen.
- Nachdem alle Bremssättel platziert und an Größe angepasst wurden, klicken Sie rechts auf das Bild und klicken Sie auf "Save Bremssattel Data".
- Wiederholungsmessungen Sie auf nachfolgenden b-Scans (jede 10th scan funktioniert gut) aus der gleichen rechteckigen Menge OCT Bild überspannt die gesamte Netzhaut von überlegenen Regionen unterlegen. Bremssättel sollte offen und an der gleichen Stelle auf der X-Achse bleiben. Passen Sie die Länge der Bremssättel, ohne sie in X-Richtung bewegen.
- Öffnen Sie die speichern Dateien durch Klicken auf das kleine Datei-Symbol neben der verarbeiteten b-Scan Bild und klicken Sie auf "Gehe zu Daten". Klicken Sie auf "Datum geändert um ordnen Sie die Dateien in Reihenfolge basierend auf Zeitersparnis, und öffnen Sie die Dateien für jeden b-Scan gemessen.
- Kompilieren Sie die raw-Daten von jedem b-Scan in einer einzigen Datei in Reihenfolge von der niedrigsten zur höchsten basierend auf Frame-Nummer. Wählen Sie die Spalten von Daten, einschließlich "Bremssattel Name", "Länge" und "Center-X".
- Sicherstellen Sie, dass die Mitte X das gleiche für alle b-Scans gemessen für jedes rechteckige Volumen-OCT-Bild verarbeitet. Löschen Sie alle Daten aus Bremssättel, die nicht verwendet wurden, um Messungen aufzeichnen, und den Bremssattel befindet sich in der Mitte des Sehnervenkopfes auf Null gesetzt.
- Die Daten für X vs. mehrere Y-Datensätze zu einer 3D Plot-Funktion die Gesamtdicke der ONL Plotten Plot oder anderen gemessen retinalen Schicht.
- Vergleichen Sie ONL Messungen zwischen Kontrolle und Versuchstiere mit entsprechenden Alters zu bestimmen, die Rate und die Einheitlichkeit der jede mögliche Degeneration der Netzhaut.
- Wiederholen Sie den Vorgang für OSL-Messungen mit dem gleichen b-Scan-Bilder. Folgen Sie die gleiche Methode zur Messung der ONL, außer die Bremssättel zwischen ELM und Bruch Membran (BM) platzieren.
Hinweis: Vertreter Ergebnisteil (Abbildung 3B) zeigt ein Beispiel dafür, wie um den Bremssattel zu platzieren. Dies sollte in einem vergrößerten Bild Fehler zu verringern. - Wiederholen Sie die Datenanalyse für mehrere Tiere für jeden Geburtstag für beide experimentelle und Kontrolle Kohorten.
- Umfassende Messung und 3D Mapping der ONL oder OSL Dicke mit dem Softwaretool Bremssättel
- Überprüfen Sie die Post-Injektion-OCT-Bilder und notieren Sie sich alle identifizierbaren Sehenswürdigkeiten, wie die ONH oder Blutgefäße in der Netzhaut. Dann positionieren Sie den Mauszeiger um zu erhalten eine Follow-up-SD-OCT aus derselben Region, und achten Sie darauf, die gleichen erkennbaren Sehenswürdigkeiten gehören.
Hinweis: Sicherstellen Sie, dass die Region der Netzhaut abgebildet und beteiligt die Netzhautablösung in den Post-Injektion SD-OCT-Bildern identifiziert wird. Eine rechteckige SD-OCT-Volumeabbild aufzeichnen und speichern. - Die aufgenommenen Bilder zu verarbeiten, wie oben beschrieben 4.1.3. , 4.1.14. Sichern Sie der Bremssattel Daten und Handlung wie oben beschrieben.
Hinweis: Das resultierende Array von ONL Messungen wird verwendet, um einen 3D Plot zeigt die ONL Dicke erstellen. Die Position der Bremssättel entlang der X-Achse erlauben es, das Diagramm platzieren des Sehnervs am Ursprung (0) entlang der X-Achse replot. Die Y-Achse wird geplottet mit der b-Scan-Nummer und der Sehnerv wird verwendet, um den Ausgangspunkt zu definieren, der es erlaubt, den Sehnerv am Ursprung auf der Y-Achse richtig zu positionieren. Ermittlung des Sehnervs in jedem Datensatz kann Follow-up-Bilder zuverlässig ausgerichtet werden.
- Überprüfen Sie die Post-Injektion-OCT-Bilder und notieren Sie sich alle identifizierbaren Sehenswürdigkeiten, wie die ONH oder Blutgefäße in der Netzhaut. Dann positionieren Sie den Mauszeiger um zu erhalten eine Follow-up-SD-OCT aus derselben Region, und achten Sie darauf, die gleichen erkennbaren Sehenswürdigkeiten gehören.
- Das Ausmaß der Injektionsstelle auf das Fundus-Bild zuordnen
- Durchführen Sie Post-Injektion rechteckige Volumen OCT bestätigen den Erfolg der Injektion. Folgen Sie das beschriebenen Verfahren 3.6.
- Verwenden Sie die Bremssattel-Funktion in der Software, um den Wendepunkt an der Grenze von der abgelösten Netzhaut aus einer Reihe von b-Scans überspannt das gesamte OCT-Bild zu identifizieren. Verwenden Sie die Methode, um Bremssättel in beschrieben zu öffnen 4.1.4.
- Zeichnen Sie die Fundus-Bilder mit dem zugeordneten Standort der OCT b-Scan und entsprechenden Bremssattel Position auf dem Fundus-Bild, das seine Lage entspricht.
- Kompilieren Sie alle Fundus Bilder in ein zusammengesetztes Bild, einschließlich der Bremssattel-Positionen, die Ergebnisse in eine genaue Karte der Injektionsstelle auf das Bild des Augenhintergrundes (Beispiel im Abschnitt "Vertreter Ergebnisse", Abbildung 5A).
(5) intraokulare Injektionen
Hinweis: Details zur Verwendung von RIS sind in einer jüngsten Studie23ausgearbeitet.
- Vorbereitung Glas Injektionsnadeln
- Autoklaven Röhren die Kapillare mit Fäden in kleinen Chargen mit dem trocken-Zyklus.
- Verwenden Sie eine Pipette Puller und Set-up ein Programm, das einen Glas-Tipp mit den schärfsten Winkel und einem Durchmesser im Bereich von 2 bis 5 µm produzieren wird.
Hinweis: Eine Probe 5-Schritte-Programm produziert wirksame Nadeln auf unsere Pipette Puller ist in Tabelle 1dargestellt. - Lagern Sie die gezogenem Glas Nadeln in einem sterilen Pipette Nadel Glas bei Raumtemperatur.
- Füllen Sie die Spritze mit der gewünschten Lösung zur Injektion
- Montieren Sie die Nadel in den Nadelhalter, verlassen ca. 5/8" ragt über das Ende des Inhabers.
Hinweis: A Abstand weniger als 5/8" sie schwer erreichen lässt Injektionslösung, die Nadel zu füllen, weil die Nadelhalter nicht ohne weiteres in die Öffnung von 0,2 mL Röhrchen passt. Auch, dass die Nadel ragen mehr als 5/8" führt zu deutlich größeren Oszillation oder Präzession der Spitze, was Echtzeit imaging erschwert, da die Spitze der Brennebene oder das Sichtfeld (FOV), beim Versuch hinterlässt, das Auge zu durchbohren. - Bereiten Sie die Injektionslösung in einer sterilen 0,2 mL-Tube. Hinzufügen einer 01:10 Verdünnung von sterilen Fluorescein-Sulfat (10 mg/mL in 1 X PBS), die Injektionslösung, eine Endkonzentration von Fluorescein bei 1 mg/mL zu erhalten.
Hinweis: Die genaue Färbung verwendete kann ist spezifisch für den Benutzer und alles, was ist ungiftig und für das bloße Auge unter weißen Beleuchtung zu erleichtern die präzise Platzierung von der Spitze der Nadel auf der Ebene der RPE und subretinalen Raum sichtbar. - Visualisieren Sie die Nadel durch das Stereo-Mikroskop, während der Verwendung der Regler von der 3-Achsen-Mikromanipulator, um die Nadel zu positionieren, so dass es mit der Mitte des Rohres mit der Injektionslösung verwendet werden, für die Füllung der Nadelöhrs ausgerichtet ist.
- Fahren Sie vorsichtig die Nadelspitze in der 0,2 mL Tube, bis die Spitze der Nadel in die Flüssigkeit eingetaucht ist. Zeichnen Sie die gewünschte Lautstärke des Injektionsflüssigkeit (z. B. 1 µL) in die Nadel für eine einmalige Injektion erforderlich. Pflegen Sie die restliche Lösung in die Röhre im Eis.
- Montieren Sie die Nadel in den Nadelhalter, verlassen ca. 5/8" ragt über das Ende des Inhabers.
- Das Tier vorbereitet für die Injektion
Hinweis: die RIS-Mikroskop ist sauber und ist ein berührungsloses System. Die Heizplatte ist mit einem sauberen Adsorbens Pad bedeckt und Nadeln sind autoklaviert vor gezogen. Nachdem sie von einem selbst sterilisieren beheizten Metallstreifen gezogen werden, bleiben sie in einer geschlossenen sterilisierte Kammer gezogenem Glas Nadeln halten soll. Die Nadeln werden nur behandelt mit behandschuhten Händen und Pflege wird verwendet, um zu verhindern, dass die Spitze der Nadel berührt, während es in die Halterung zu montieren. Die injizierten Lösungen werden mit steriler Technik zubereitet und sind für die Kontamination von Schlieren eine Probe des Virus Vorbereitungen auf LB-Agar-Platten und brüten sie über Nacht bei 37 ° c getestet.- Wiegen Sie das Tier (g) um die entsprechende Dosis Betäubungsmittel Schmerzmittel zu bestimmen.
- Narkose (2,5 % ige Lösung von gepufferten 2,2,2-Tribromoethyl Alkohol (Avertin)) über intraperitoneale Injektion (IP) zu verwalten.
- Unmittelbar gelten Sie Anticholinergika (z. B. Cyclopentylate) für beide Augen, die Schülerinnen und Schüler zu erweitern.
- Trimmen des Tieres Schnurrhaare und die Nummer des Tieres mit Ohr Punch oder andere Methode.
- Waschen Sie das Auge und Umgebung mit verdünnter Betadine.
Hinweis: Vermeiden Sie jede Lösung um die Nase, wie unbeabsichtigte Ertrinken führen kann. - Platzieren Sie den Mauszeiger auf das Heizkissen auf 39 ° c, in der vor-geformten Modellierer Ton Maus Halter mit dem Auge in Richtung der Nadel injiziert werden gehalten.
- Stellen Sie sicher, dass die Maus nicht reagiert mit einer Prise Test des hinteren Fußes ist.
- Subretinale Injektion durchführen
- Verwenden Sie ein paar sterile stumpfen Iris Zange sanft Proptose der Globe induzieren, indem man die Spitzen der Zange auf 7 und 10:00-Positionen auf den Augenlidern drücken Sie offen und nach unten zur gleichen Zeit.
- Verwenden Sie die Zange, um die Augenlider unter des Augapfels zu halten während des Einspritzvorgangs aus der Steckdose zu hieven.
Hinweis: Tiere 10 bis 14 Tage alt werden oft das Auge aus der Steckdose leichter als ältere Tiere zu halten. - Richten Sie die Spitze der Nadel etwa 1-1,5 mm unter dem Rand der Hornhaut Limbus und fahren Sie es vorsichtig in das Auge durch die Bindehaut zu, bis es eine skleralen Depression schafft, wie die Nadel in das Gewebe der Lederhaut dringt und ermöglicht eine Bearbeitung des Auges.
- Drehen Sie das Auge nach unten mit dem Mikromanipulator, die skleralen Depression durch die Dilatierte Pupille mit dem RIS Stereo-Mikroskop zu visualisieren.
- Geben Sie einen Tropfen des sterilen Augengel oder 1 x PBS-Lösung und mit einem sterilen Deckgläschen abdecken.
- Im Mittelpunkt der skleralen Depression, erstellt von der Spitze der Nadel (2 bis 5 µm) und fahren die Nadel vor, bis eine scharfe Spitze der Netzhaut Formen an der Injektionsstelle.
- Drehen Sie die Nadel mit dem Halter, bis die Spitze bohrt sich durch die Sklera und Fluorescein in die Nadel unter die Netzhaut in unmittelbarer Nähe des RPE Zellen Monolage sichtbar ist.
- Fahren Sie die Spitze der Nadel zu, so ist es tangential an die Kugel, und aktivieren Sie die Einspritzpumpe mit Pedal Fußschalter.
- Nachdem die gewünschte Lautstärke geliefert wurde (0,5-1 µL) auf den subretinalen Raum ziehen Sie die Nadel heraus und prüfen Sie, ob die Blase stabil ist und die Flüssigkeit aus der Injektionsstelle, die die ersten Kriterien für eine erfolgreiche Injektion ist nicht auslaufen.
Hinweis: Eine ordnungsgemäße Spitzendurchmesser ist (2 bis 5 µm Durchmesser) entscheidend zum Auslaufen von Injektionsstelle zu vermeiden. - Legen Sie das Tier auf die imaging Plattform des Instruments OCT. Folgen Sie den Anweisungen für HR-SD-OCT-Bildgebung ein rechteckiger Volume Image aufzeichnen.
- Bestätigen Sie, dass die eingespritzte Flüssigkeit in den subretinalen Raum, und speichern Sie die Bilder für die Festsetzung des Umfangs der Blase befindet.
- Das Tier aus der Halterung zu entfernen und eine reichliche Menge an antibiotische Salbe auf die injizierten Augen anwenden.
- Legen Sie das Tier auf ein Heizkissen, bis es vollständig erholt, dann legen Sie sie wieder in den ursprünglichen Käfig, wo es herkommt.
Hinweis: Unsere Tiere in der Regel vor dem Absetzen injiziert werden, daher müssen die Tiere in den Käfig mit der Mutter zurückgegeben werden.
- Das Ausmaß der subretinalen Lungenblase OCT Instrument Software Werkzeugen zuordnen.
- Erhalten Sie eine rechteckige Volumen OCT-Bild, mit Methoden, die zuvor beschriebenen, von der Blase, und positionieren Sie es um ein erkennbares Wahrzeichen im Auge wie die ONH erweitert.
Hinweis: Aufnahme 90 b-Scans funktioniert gut für die Zuordnung der Blase, aber könnte verwendet werden, abhängig von der gewünschten Auflösung. - Die Abbildung einer einzigen Bremssattel hinzu und legen Sie sie an den Wendepunkt, wo die Netzhaut vom RPE und Aderhaut löst.
Hinweis: Die Software ordnet automatisch einen entsprechenden Punkt eine Linie auf dem Fundus aus dem Bremssattel und der b-Scan, die ausgewertet. - Erfassen Sie den Bildschirm nach Platzierung der Bremssättel, und kompilieren Sie die Bilder, um effektiv die Grenze von der Injektion auf auf das Bild des Augenhintergrundes, ordnen Sie die genau die Injektionsstelle zuordnet. Speichern Sie das kompilierte Bild als Referenz zu helfen bei der Suche nach den Regionen von Interesse während der Follow-up-Bildgebung.
Hinweis: Alternativ die Bremssattel-Daten eingespart werden erfüllt und mit einer ähnlichen Methode für Plotten 3D Datensätze ONL Dicke aufgetragen.
- Erhalten Sie eine rechteckige Volumen OCT-Bild, mit Methoden, die zuvor beschriebenen, von der Blase, und positionieren Sie es um ein erkennbares Wahrzeichen im Auge wie die ONH erweitert.
- Intravitreale Injektion
- Setzen Sie die Spitze der Nadel mit einem ähnlichen chirurgische Ansatz als Sub retinalen Injektion, außer dass die Nadel an der Pars Plana ca. 0,25 mm hinter der Hornhaut Limbus und in den Glaskörper vollständig durch die Sklera angetrieben wird.
- Gelten Sie nach Nadelplatzierung die Injektion Puls mit dem Fußpedal.
Hinweis: Eine schnelle Verbreitung des Farbstoffes in den Glaskörper die Augenmuschel Fluorescein wird beobachtet, die erweiterten Pupille Blende mit Fluoreszenz zu füllen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bewertung der Anwesenheit, Rate und Einheitlichkeit der äußeren Netzhautdegeneration Modell
Messungen der ONL waren ELM, definieren die Grenzen der ONL mit dem Bremssattel-Werkzeug in der Gerätesoftware zur Verfügung gestellt von der OPL aufgezeichnet. Ziel war es, das Fortschreiten der äußeren Netzhautdegeneration in einem Mausmodell teilweise vermenschlichten AdRP zuordnen. Vergleichbare Bilder aus einer Kontrolle C57BL/6(J) Maus und ein hC1/hC1 / / mWT/mWT-Maus-Modell, mit dem Ausdruck zwei Kopien des mutierten menschlichen Stab Opsin (RHOP347S) Gene, zeigten sich die Kontrolle retinalen Erkenntnisse und derjenigen einer schweren auszustellen und schnell fortschreitende Netzhaut degenerative Erkrankung. Die 3-Woche-alten AdRP (hC1 x BL/6(J)) Tier, dass nur eine einzige Kopie des mutierten Gens für menschliche RHOP347S und zwei Kopien der Maus WT RHO Gene, hatte in der Nähe von normalen ONL Dicke. Allerdings scannt die Follow-up-HR-SD-OCT bei 10 und 37 Wochen demonstrierten zeitlich progressive und räumlich gleichmäßige Netzhautdegeneration, die ca. 60 % Verlust von Photorezeptoren als ONL Ausdünnung über diesen Zeitraum hinaus geführt. In die hC1 x BL/6(J) AdRP Modell hat die Degeneration der Netzhaut eine ungefähre Zeitkonstante (1/e) von 13 Wochen. Homozygot hC1 Tiere mit zwei Dosen des giftigen mutierten menschlichen Transgens des Mausrads WT RHO Hintergrund leiden eine viel schnellere Degeneration wie umfangreiche Netzhaut Ausdünnung und den im wesentlichen vollständigen Verlust der Photorezeptoren durch 3 zeigen Wochen alt (Abbildung 2).
Die ONL Maßnahme ist nur eine Komponente der äußeren Netzhaut Normalität als Index der Photorezeptor Vitalität. Die OSL der Photorezeptoren und das innere Segment/äußere Segment (IS / OS) oder Ellipsoid Linie Beweise zur Unterstützung der Photorezeptor Vitalität und Funktion. Vergleiche mit Tieren gezüchtet werden, um einen (N129R - x 129R-) oder zwei (2HRho 1T1T) Kopien (Dosen) menschlicher WT RHO -Gene auf die Maus WT RHO Ko Hintergrund enthalten waren für die Dicke der äußeren Netzhaut gemessen. Ein statistisch signifikanter Anstieg von ca. 8 µm in der ONL wurde bei Mäusen mit zwei Kopien des menschlichen WT RHO -Gens im Vergleich zu Mäusen mit nur eine Kopie des menschlichen Gens beobachtet. Ein statistisch signifikanter Anstieg von ca. 5 µm in der OSL wurde bei Mäusen mit zwei vs. eine Kopie des menschlichen WT RHO -Gens auf die Maus WT RHO Ko Hintergrund beobachtet. Abbildung 3zeigt ein Beispiel des wie ONL und OSL-Messungen vorgenommen wurden. Die hohe Auflösung der Bilder aufgenommen mit dem HR-SD-OCT-System ermöglichen genaue Messungen der ONL oder OSL Diskriminierung von Kleindifferenzen mit solide statistische Zuverlässigkeit in den humanisierten WT RHO -Maus-Modellen ermöglicht.
Bereich der chirurgischen Ergebnisse von detailliert OCT beim Versuch subretinalen Injektion
HR-SD-OCT Bewertung der versuchten subretinalen Injektionen ergab eine Vielzahl von Ergebnissen. Erstens war die häufigste Erfahrung Bestätigung, dass die eingespritzte Flüssigkeit innerhalb der subretinalen Raum erfolgreich zugestellt wurde. Die Eröffnung der impliziten subretinalen Raum (die während der Entwicklung schließt) erstellt eine Blase, die übersichtlich visualisiert werden könnte En Gesicht nach Ansicht des HR-SD-OCT und in den b-Scan-Bildern. Die Hypo-reflektierende Flüssigkeit wurde grenzt die neuronale Netzhaut oben und die hyper-RPE Zellen Reflexionsschicht weiterhin gegen BM, unten (Abbildung 4). Das Ausmaß der subretinalen Injektion konnte ermittelt werden, wenn das Tier sofort nach der Injektion (siehe unten) HR-SD-OCT abgebildet war. Zweitens kann die Injektion in der Aderhaut Raum (unter BM) auftreten und nicht in den subretinalen Raum. Dies führte zu einer hyper-Reflexionsschicht (RPE) begrenzen die Kuppel der Flüssigkeit verdrängt Region der Netzhaut, und kein hyper-Reflexion an der hinteren Grenze des Auges im Office-Anpassungstool b-Scans. Drittens, eine weitere potenzielle Ergebnisse, die auftreten könnten, beim Versuch subretinale Injektion war eine retinale Schisis (splitting) in der Nervenfaserschicht. Dieses Ergebnis ergab eine normale Netzhaut äußere Anatomie, aber die innere Schicht der Netzhaut gekapselt, die Blase, die möglicherweise oder möglicherweise nicht den Glaskörper eingedrungen. Im Prinzip eine solches Schisis Muster mit Einspritzung überall innerhalb der Lamellen der ordnungsgemäße neurale Netzhaut auftreten könnte, aber wir haben nur Nervenfaser Schicht Schisis bisher gesehen. Viertens, eine intravitreale Injektion kann auch auftreten, hat das keine Auswirkungen auf das Office-Anpassungstool. Alle diese Fehler ergeben sich aus der anfänglichen Abhandenkommen Glas Nadelspitze oder vielleicht einige kleine Bewegung der Nadel beim Einspritzen, aufgrund der Förderhöhe der geschaltete Strömung Injektionsvorrichtung.
Charakterisierung den Speicherort der subretinalen Injektion
Ein kritischer Faktor bei der Bestimmung der Wirksamkeit und Toxizität der Kandidat Therapien ist die Fähigkeit, retinale Regionen, die Vektor gegen jene empfangen haben, die nicht vergleichen. Wir richten erhebliche Anstrengungen in die Entwicklung ein Mittel, um die Region der Netzhaut beteiligt die subretinalen Injektionen kennzeichnen, so dass während der Nachuntersuchungen, wir das areal Ausmaß der Netzhaut identifizieren konnte, wo Therapien angewandt wurden, und somit dem Transduktion war machbar. Gold NPs erlaubt ein hohes Maß an Vertrauen bei der Identifizierung von Regionen der Netzhaut, die waren oder wurden nicht injiziert. Allerdings schien die bestimmte Partikel oder ihrer Formulierung giftig und führte zu einer schweren lokalisierte Netzhautdegeneration am Standort der subretinalen Injektion durch 24 Stunden Post Injektion (Daten nicht gezeigt). Daher haben wir eine alternative Methode der Zuordnung der Injektionsstelle direkt aus der HR-SD-OCT Bilddaten entwickelt. Eine Methode zur Identifizierung genau der Injektion Website Grenzen wurde entwickelt mit den Messwerkzeugen (Bremssättel) in das Software-Paket des Instruments (Abbildung 5). Wir können den Rand der Blase identifizieren, gerade durch die Untersuchung einzelner b-Scans (von schlechter als überlegene Netzhaut) verwendet, um das Bild des Augenhintergrundes zu erstellen. Beim einem Bremssattel an der Stelle platzieren, wo die auf die beigefügte Netzhaut schneidet, ist die Position des Sattels automatisch auf den entsprechenden b-Scan des Augenhintergrundes En Gesicht auf die genaue Position auf der x-Achse abgebildet wo der Bremssattel war auf der b-Scan gelegt. Wiederholen dieses Prozesses kann man den Rand der Blase auf einen Fundus de Gesicht zu verfolgen. Der Alignment-Prozess erfordert, dass ähnliche Regionen der Netzhaut abgebildet werden, jedes Mal, im Verhältnis zu den konstanten Sehnerv Kopf und die Bilder können gedreht werden, um die Netzhautgefäße aus mehreren Bildern vor der Trennung der Daten richten. Anschluss an die Ausrichtung des Post-Injektion-Image und anschließende Follow-up-Bilder war die Injektion Region über das Datenraster Punkt zu identifizieren, die Position der Messungen innerhalb der Region beteiligt die Netzhautablösung überlagert. Diese Daten könnten als eine Oberflächenkarte geplottet werden vorsah ein visuelles Werkzeug um Datenpunkte inklusive der Injektionsstelle im Vergleich zu Regionen außerhalb der Injektionsstelle zu identifizieren.
Zuordnung der ONL Dicke in 3D
Endlich, wir zeichnen Messungen die ONL, OSL oder anderen Netzhaut Schichten aus in der gesamten abgebildeten Region der Netzhaut, und zeichnen dann die Daten mit einem Oberflächendiagramm (Abbildung 5). Überlagerung der Grenze Karte der Injektionsstelle ermöglicht die Trennung der beiden Datensätze, einschließlich der injizierten Region und der Region, die nicht während des Einspritzvorgangs abgelöst wurde. Verarbeitung und Datenanalyse konnte weiter dann ausgeführt werden, auf diese beiden Datensätzen, Hypothesen zu testen, dass spezifische Therapeutika Netzhautdegeneration zu retten oder Toxizität zu induzieren können. Dieser Ansatz ermöglicht experimentelle potenziell und Steuern zu sammelnden Daten aus einem einzigen Auge injiziert Vs nicht injiziert Regionen des gleichen Auges zu vergleichen.
Abbildung 1 : UHR-SD-OCT Gerät. Die HR-SD-OCT-Gerät verwendet wird angezeigt. Das Instrument Rack (A) enthält, dem Computer-Monitor (ein), die Tastatur und Maus (b), der Sonde Interfacebox (c), OCT-Motor (d), Computer (e), die Steuereinrichtung für die super leuchtende Lichtemittierende Dioden (Infrarot) (f) und die unterbrechungsfreie Stromversorgung liefern (g). Die optische Bank (B) enthält die bildgebende optische Messkopf (für Maus Netzhaut) (h), der Multi-Achsen (lineare und rotatorische) Manipulator (ich) und ein Maus-Thema (j). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : Progressive Outer Retinal Degeneration in teilweise vermenschlichten AdRP Modell HR-SD-OCT gemessen (A) HR-SD-OCT Bilder der Netzhaut erhielten für das AdRP Modell (hC1 x BL/6 (J)) auf unterschiedlichen Alters, die C57BL/6(J)-Kontrolle bei 14 Wochen und die homozygot hC1 mutierte Linie bei 3 Wochen. Die äußeren Netzhaut hatte eine normale Erscheinung bei 3 Wochen im AdRP Modell, aber es gab Hinweise auf progressive ONL Ausdünnung und Desorganisation an und darüber hinaus 10 Wochen alt. Von 37 Wochen (hC1 x umfangreiche äußeren Netzhautdegeneration BL/6(J)) gezeigt. Alle OCT Scans wurden in der Nähe des Sehnervs. (B) die ONL Dicke (in mm) entlang der horizontalen Achse durch den Sehnerv wurde aufgetragen zur Steuerung (C57BL/6(J)), hC1 und AdRP Tiere unterschiedlichen Alters. Es gab fortschreitenden Verlust von ONL Dicke im teilweise vermenschlichten AdRP Modell. ONL Verlust war mehr als 60 % von 37 Wochen alt. Fehlerbalken = Standardfehler des Mittelwerts. Roten Skala Bar = 200 µm und die Bilder sind der gleichen Größenordnung. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 : Quantitative Maßnahmen der nuklearen Außenschicht und äußeren Segmentlänge mit HR-SD-OCT (A) Maus Linien verwendet, um ONL und OSL Maßnahmen zu demonstrieren. Vertreter OCT Bilder von 2HRho1T/1 t (2 Dosen HRho) auf Maus RHO Ko-Hintergrund) (linke Panel) und N129R - x 129R-(eine Dosis menschlichen RHO auf Maus RHO Ko-Hintergrund) (Rechts Fenster). (B) ist ein Beispiel wie Bremssättel platziert wurden, um die ONL (rot) und OSL (blau) zu messen. (C) die Daten von drei Tieren jeder Zeile für ONL Dicke im Balkendiagramm Format zeigt der Vergleich der 2HRho1T/1 t-Linie und N129R - x 129R-aufgetragen wurde gewonnen (linken). Die 2HRho1T/1 t-Linie hat ~ 8 µm dicker ONL. Um Unterschiede in der OSL zu demonstrieren, wurden mehrere Messungen (sieben) aus einem b-Bild aus jeder Zeile der Maus aus der ELM mit dem BM wie in B (blaue Linie) in 9 Wochen alten Tiere (Rechts Fenster). Dies demonstriert einen ~ 5 µm Unterschied in der OSL zwischen Tieren mit 1 Vs 2 Kopien des Gens HRho. ONL und OSL-Maßnahmen waren statistisch signifikant, ONL p-Wert = 1.7e-5 und OSL p-Wert = 6.4e-5. Fehlerbalken = Standardfehler des Mittelwerts. Roten Skala Bar = 100 µm beide b-Scans in 3A haben den gleichen Maßstab, 3 b wird vergrößert, um Klarheit der Netzhaut Schichten zu verbessern und bieten eine qualitative Demonstration, wie die Messungen erworben wurden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4 : Arten von intraokulare Injektionen bei Mäusen durch HR-SD-Okt. identifiziert (A). A (hC1xBL/6(J)) Maus mit ~ 1 µL Flüssigkeit über Inferonasal Transcleral transchoroidale Injektion injiziert wurde. Die daraus resultierende Netzhautablösung gilt als grüne unteren rechten Bereich des En Gesichts Bild, erstellen eine scharfe Grenze an der Vorderkante der Blase auf der rechten Seite des Bildes. Das OCT Fundus Bild von der Injektionsstelle Exponate nur feine Unterschiede je nach Position der Flüssigkeit gefüllten Hohlraum, weil das Bild eine Zusammenstellung aller b-Scans aus der gesamten Netzhautdicke ist. Darüber hinaus ändert die Injektion auf den Abstand der retinalen Oberfläche aus den OCT-Überträger, Herstellung einer unkonzentrierten Region an der Injektionsstelle. (B) der OCT b-Scan nicht injiziert Netzhaut wird demonstriert. Die ONH ist beschriftet. (C) A subretinale Injektion wird demonstriert. Die ONH beschriftet, und Pfeile in de Gesichts Bild (richtigen Platten) zeigen die hintere Grenze der Ablösung. (D) eine choroidale Injektion wird mit einer klaren Höhe (aufwärts Verschiebung) der RPE-Schicht (hyper-reflektierende Kurve) den unteren Rand der Netzhaut (Pfeile) und erheblichen Verlust der hyper-Reflexion des RPE und choroid darunterliegenden demonstriert die eingespritzte Flüssigkeit. Vergleichen Sie Pfeile in den Bildern (C und D). (E) A retinalen Schisis zeigt sich in der Nähe der Nervenfaserschicht. Beachten Sie die sehr dünne hyper-reflektierende Membran Kapseln die eingespritzte Flüssigkeit während der Netzhaut bleibt die RPE befestigt. Feine Unterschiede zwischen den drei verschiedenen Abteilungen können auch in der En Gesichtsbilder (C, D und E) visualisiert werden. Subretinale Ablösung hat eine Grenze, die ist schwierig (Pfeile in C), zu visualisieren, während die Aderhaut Injektion einen unscharfen hyper reflektierenden Rand an der Vorderkante der Blase schafft und der retinalen Schisis ist durch die scharfe Abgrenzung der offensichtlich seine Vorderkante (E). Beide rote Skala Balken = 200 µm in 4 b. Alle Bilder 4 b bis 4E werden gleichmäßig skaliert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5 : Zuordnung und Quantifizierung der äußeren Netzhaut Veränderungen nach subretinale Injektion. Eine Methode wurde entwickelt, um Regionen des Interesses während der Follow-up-Untersuchung von Mäusen zu identifizieren, die subretinale des Vektors, mit 3D Plotten von ONL Messungen von mehreren OCT b-Scans Injektion. Eine 2HRho1T/1 t Tier wurde mit einem selbst-ergänzende Adeno-assoziierten Virus Ausdruck GFP und Blei Kandidat Hammerhai Ribozyme (ScAAV-GFP ad6 HhRz 725) injiziert (OS Auge) in einem Bildschirm Toxizität. (A) abgebildeten unmittelbar nach, wurde das areal Ausmaß der Injektion indem Bremssättel an der Vorderkante der Blase an der Stelle, wo die äußeren Segmente trennen die RPE in den b-Scans (linken (roten Bremssattel)) zugeordnet. Die Position des Werkzeugs Bremssattel automatisch in das Bild des Augenhintergrundes zugeordnet ist, und dies wiederholt und für so viele b-Scans zusammengestellt, nach Bedarf, die abhängig von der gewünschten Auflösung (alle 5th -Scan (A) (rechte Abbildung)). Nachfolgende OCT-Untersuchungen (alle 2 Wochen) abgebildet die gleiche Region der Netzhaut, Überlagerung zu ermöglichen; ONH und Netzhautgefäße sind Sehenswürdigkeiten, die kartesischen oder rotatorischen Anpassungen zu erleichtern. Die gesamte Region der Netzhaut wurde für ONL Dicke gemessen, sofern die erforderlichen Grenzen (OPL und ELM) zu sehen waren. (B) ONL Länge über die injizierten Fläche zugeordnet, die Bremssattel-Positionen (farbcodiert) sind wieder auf das Bild des Augenhintergrundes kartiert und in ein zusammengesetztes Bild zusammengestellt. Alle 5th b-Scan aus den OCT-Bildern war mit eingebauten Bremssättel an bis zu zehn Punkten über die Netzhaut gemessen. (C) Pre- und Post-kompilierte Bilder sind gedreht, mit imaging-Software, retinale Gefäßsystem, richten Sie die Datenpunkte innerhalb der Netzhaut freistehende retinalen Region von Bild-Overlay identifiziert werden und getrennt. (D) die Daten-Set ist in einem Tabellenformat, identisch mit dem Fundus Bild Array zugeordnet und aufgeteilt in zwei Gruppen (Messungen innerhalb der Blase (rote Lichter) und diejenigen, die nicht). (E) Daten werden dargestellt mit einer 3D Oberfläche Plotten-Funktion, die ermöglicht die Visualisierung von ONL Dicke über die gesamte Region abgebildet. Dies ermöglicht die Beurteilung der quantitativen Unterschiede zwischen Regionen des Auges injiziert und nicht gespritzt. Der Spalt im 3D Plot (E) bietet eine komfortable Möglichkeit, das Dataset ONL Messungen innerhalb der Region der abgelösten Netzhaut aus der Region zu trennen, die sofort nach der Injektion verbunden blieb. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Tabelle 1: Programm verwendet, um die Glas-Nadeln ziehen. Programmparameter Glas Nadeln nützlich für subretinalen durch Trans-skleralen, transchoroidale Ansatz zu erreichen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
HR-SD-OCT bietet eine einfache Methode zur Charakterisierung von potenziellen Tiermodellen der Krankheit beim Menschen zu bestimmen, ihre Nützlichkeit bei der Prüfung möglicher Therapeutika. Die Fähigkeit, schnell und zuverlässig eine potenzielle Tiermodell für menschliche Krankheiten zu charakterisieren ist entscheidend für den Prozess der therapeutischen Arzneimittelforschung (z.B.gen-Ersatz-Therapie, Ribozyme oder ShRNA Knockdown Gentherapie, kombinierte Gentherapie). HR-SD-OCT bietet eine einfache, schnelle und nichtinvasive Methode für die Bewertung der Netzhaut Gesundheit, die verwendet werden kann, zu charakterisieren und das Fortschreiten der Degeneration der Netzhaut in fast jedes Mausmodell zu überwachen. Die OCT-Bilder können verwendet werden, zu Messungen der einige oder alle der verschiedenen Schichten der Netzhaut, die eine detaillierte Bewertung der äußeren (Photorezeptoren) der Netzhaut-Degeneration im Laufe der Zeit oder die Auswirkungen der therapeutischen Rettungsversuche auf die Degeneration vorsehen Umfang oder kinetische Timeline. HR-SD-OCT kann auch zur Toxizität von gelieferten Vektor oder Materialien zu bewerten. Der größten Einfluss auf ein Photorezeptor-Degeneration der Netzhaut-Forschungsprogramm ist die Fähigkeit, raffinierte Messungen der ONL im Laufe der Zeit mit lebenden Tieren zu machen. Eine kann eine Netzhautdegeneration Timeline darstellen, um eine Zeitkonstante zu extrahieren, ist ein wichtiger erster Schritt, die Wirksamkeit und Toxizität der Kandidat Therapeutika in die gleichen Modelle über einen zeitlichen therapeutischen Zeitfenster zu bewerten. Diese Technologie ermöglicht auch erhebliche Einsparungen von wertvollen Ressourcen (Tiere und Zeit) im Vergleich zu klassischen Endpunkt Histologie dadurch, dass des Forschers, Anomalien in der Tier-Kohorte vor Eintritt in eine Studie und Beseitigung der Tiere zu identifizieren, die experimentelle Kriterien (z.B. erfolgreiche subretinalen Lieferung) nicht erfüllt.
Die Notwendigkeit für präzise Lieferung bestimmter Therapeutika in den subretinalen Raum des Auges Maus ist anspruchsvoll, und HR-SD-OCT ermöglicht eine präzise visuelle Bestätigung des erfolgreichen subretinalen Injektionen als Kriterium für die laufende Aufnahme von Tieren in der vorklinische Studiendesign. Großen Aufwand ist erforderlich, um Tiere, die im Laufe der Zeit in Gentherapiestudien injiziert, da diese Modelle oft menschlichen degenerative Netzhauterkrankungen simulieren wo Krankheit Timelines in Jahrzehnten entstehen häufig folgen. Zahlreiche Nachuntersuchungen sind erforderlich, um therapeutische Wirksamkeit bestimmen oder Toxizität zu bewerten. Eine Lösung für diese kritische Herausforderung ist die Fähigkeit zum erkennen und Entfernen von Tieren von Studiendesigns, die chirurgische Fehler für die Lieferung des therapeutischen Vektors sind. Die Fähigkeit, eine erfolgreiche Injektion für eine gut ausgebildete Techniker mit jahrelanger Erfahrung hat 90 % genähert, wenn ein Auge pro Tier und ca. 80 % Erfolg zu injizieren, wenn beide Augen zu injizieren. Mit dieser Wirkungsgrad ist Entfernung aus der Design-Studie von Tieren mit erfolglosen Injektionen vorteilhaft, Testen von Hypothesen. Diese kritische Zeit spart nicht nur, sondern ermöglicht auch die konsistente und vorhersagbare Ergebnisse. Darüber hinaus HR-SD-OCT erlaubt es, verringern Sie die Anzahl der Tiere für jedes ein Experiment dadurch, dass die gleichen Tiere im Laufe der Zeit folgen werden, die die Variabilität von Tier zu Tier in beiden experimentellen verringert und Gruppen zu kontrollieren und ermöglicht mehr robuste statistische Auswertung von Hypothesen über die möglichen Wirksamkeit und Toxizität der Kandidat Therapeutika.
Das Ausmaß der Netzhaut Abdeckung durch eine subretinale Injektion ist in der Regel nicht 100 %, die möglicherweise selbst giftige31,32,33,34. Daher ist die Fähigkeit zur Unterscheidung zwischen Regionen ausgestrahlt und nicht ausgestrahlt entscheidend für die ordnungsgemäße Prüfung der Hypothesen der Rettungs- und Toxizität für einen bestimmten Kandidaten therapeutische. Die kreative Nutzung der verfügbaren Software-Tools ermöglicht genaue Kartierung der subretinalen Injektionen in den Augen der Maus. Die unmittelbare Bildgebung des injizierten Auges bietet Richtung für das Follow-up-Imaging in Regionen von Interesse und die Fähigkeit, Regionen zu vergleichen, die in Regionen ausgestrahlt wurden, die nicht innerhalb der gleichen Kugel behandelt worden sind. Abhängig von der Zuordnung Genauigkeit gewünscht dieser Vorgang kann für jeden b-Scan durchgeführt werden oder in regelmäßigen Abständen Probenahme aus dem Ensemble des b-Scans erfasst sofort Post Injektion und kompilieren die Fundus-Bilder zu einem einzigen Bild mit Grafik-Software so dass die stückweise kontinuierliche Grenze ist sorgfältig auf das Bild des Augenhintergrundes abgebildet. Vergleicht man die Bilder sofort nach Injektion, Follow-up-Bilder erfordert, dass die Bilder ausgerichtet werden, so dass Messpositionen können auf den Fundus Bild abgebildet werden, und die Datenpunkte können in die Injektionsstelle und nicht gespritzt Regionen getrennt werden die Netzhaut. Die Zuordnung des Sehnervenkopfes und der Netzhautgefäße kann auch erreicht werden, mit dieser gleichen Methodik, die in der Orientierung des Auges Beihilfen, wenn Sie versuchen, die Bilder nach der Injektion mit anschließenden Follow-up-Bilder ausrichten. Diese Informationen können verwendet werden in nachfolgenden imaging, um die Region der Netzhaut zu identifizieren, wo die Injektion stattgefunden hatte. Natürlich wenn die Tiere eingeschläfert werden, kann die Position des EGFP Ausdruck, geliefert durch eine AAV-Vektor auch mit einem Kandidaten therapeutische gen (z.B. Ribozyme), auch verwendet werden, den Speicherort der Transduktion mit dem festgelegten Bereich zu vergleichen Bild zuordnen, stützt sich auf die Lage der Blutgefäße. Dies ermöglicht die Identifizierung der Diffusion des Vektors im später geschlossenen subretinalen Raum außerhalb der anatomischen Loslösung.
Unser Erfolg mit dem Einsatz von Gold NPs subretinalen Lungenblase beschriften beschränkte sich wegen der Giftigkeit induziert durch die verwendeten Materialien. Wir möchten weiteren Untersuchungen solcher Materialien kennzeichnen das Ausmaß der subretinalen Blebs ermutigen, wenn alternative Präparate (unterschiedliche Dimensionen, Oberflächenmodifikationen) gefunden werden können, dass das nicht dazu veranlassen, Toxizität.
Die HR-SD-OCT bietet eine enorme Menge an Informationen deutlich weniger Zeit und Ressourcen und kann quantitated werden, um weitere Informationen über Wirksamkeit und Toxizität der potenziellen Therapeutika im Vergleich zu traditionellen Methoden wie Histologie bereitzustellen. Die Verwendung dieser Technologie ermöglicht den Forscher eines der schweren Engpässe in präklinischen retinalen Droge-Entdeckung-35zu lindern. Die Maus RIS und HR-SD-OCT sind leistungsstarke Tools zur präklinischen retinalen Gentherapiestudien als Bestandteil unserer RNA Drug Discovery-Programm zu unterstützen. Diese Tools können breit angewendet werden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geschäftliche Beziehungen: MCB: keine; JMS: keiner. Das Retinal imaging System (RIS)23 in dieser Studie verwendeten ist ein neuartiges Gerät umfangreiche Verwendung keiner Gruppe Lieferung Gentherapiestudien in Mäuse, Nagetiere oder kleine Tiere durchführen wollen. Während die Autoren keine Konflikte in Bezug auf dieses Gerät zu diesem Zeitpunkt zu deklarieren haben, der University at Buffalo - SUNY und der Veterans Administration haben Rechte am geistigen Eigentum und kann versuchen, dieses Instrument in Zukunft zu vermarkten.
Acknowledgments
Dieses Material basiert auf der Arbeit unterstützt, unter anderem durch das Department of Veterans Affairs (VA), Veterans Health Administration, Office of Research und Development (biomedizinische Forschung im Labor und Entwicklung) (VA Verdienst Grant 1I01BX000669). JMS ist, teilweise als Arzt-Mitarbeiterin, Augenheilkunde, VA WNY angestellt; MCB wird teilweise von VA WNY beschäftigt. Die Studie wurde an durchgeführt und teilweise von der Veterans Administration Western New York Healthcare System (Buffalo, NY) unterstützt. Inhalt repräsentieren nicht die Ansichten des Department of Veterans Affairs oder Regierung der Vereinigten Staaten. Auch unterstützt, im großen Teil durch NIH/NEI R01 gewähren EY013433 (PI: JMS), NIH/NEI R24 gewähren EY016662 (UB Vision Center Infrastruktur, PI: M Schlachtung, Generaldirektor der Biophotonik-Modul: JMS), einen uneingeschränkten Stipendiums an der Abteilung Ophthalmologie/Universität in Büffel aus der Forschung zu verhindern, dass Blindheit (New York, NY), und ein Stipendium der Oishei Stiftung (Buffalo, NY). Wir anerkennen die Gabe der hC1 transgenen RHOP347S Linie und die Exon 1 Maus RHO Knockout von Dr. Janis Lem (Tufts-New England Medical Center, Boston, MA) und das Geschenk des Modells NHR-E Transgen im heterozygoten Zustand auf die Maus Exon 2 RHO Ko-Hintergrund von DRS. G. Jane Farrar und Peter Humphries (Trinity College, Dublin, IRE).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL6 (J) | Jackson Laboratories | 664 | |
| N129R- | N/A | N/A | |
| 2HRho 1T/1T | N/A | N/A | |
| Envisu R-2200 Ocular Coherence Tomography Instrument (OCT) | Bioptigen | 90-R2200-U1-120. | |
| Retinal Imaging System (RIS) | In-house | N/A | |
| Stemi 2000C Microscope | Zeiss | 000000-1106-133 | |
| P-97 Flaming/Brown micropipette puller | Sutter Instrument Co | p-97 | |
| MMN-33 micro manipulator | Narishige USA | MMN-33 | |
| PLI-100 micro injector | Harvard Apparatus | 64-1736 | |
| Micropipette Holder (Rotating) | In-house | N/A | |
| Micropipette Storage Receptacle | World Precision Instruments Inc. | E210 | |
| Borosilicate glass capillary tubes 1.5-1.8 X 100mm, | Harvard Apparatus | 30-0053 | |
| 2,2,2-Tribromoethanol | SIGMA Aldrich | T48402-25G | |
| Tert-amyl Alcohol | SIGMA Aldrich | 240486-100ML | |
| Atropine Sulfate Ophthalmic Solution, USP 1% | Akorn Inc. | NDC 17478-215-05 | |
| Goniovisc | BioVision Limited | NDC 17238-610-15 | |
| Cyclopentolate Hydrochloride Ophthalmic Solution, USP 2% | Akorn Inc. | NDC 17478-097-10 | |
| Gentamicin Sulfate Ointment USP, 0.1% | Perigo | NDC 45802-046-35 | |
| Systane Ultra | Alcon Laboratories, Inc. | 9006619-1013 | |
| Tetracaine Hydrochloride | Bausch and Lomb | NDC 24208-920-64 | |
| Ophthalmic Solution, USP 0.5% | Bausch and Lomb | NDC 24208-920-64 | |
| DPBS | Gibco Life Technologies | 14190-136 | |
| Virus Preparations | ViGene /UNC | N/A | |
| Gold nanorods | NANOPARTz | D12M-850-1.75 | |
| Fluorescein Sulfate AK-FLUOR 25% | Akorn Inc. | NDC 17478-250-20 | |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12-548-A | |
| Forceps | Milton | 18-825 | |
| Needles 30 guage | Beckton Dickenson | W11604 | |
| Syringes | Beckton Dickenson | 309659 | |
| Bioptigen software Package | Bioptigen | N/A | |
| Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution, USP 0.5% | Akorn Inc. | NDC 17478-263-12 | |
| Windows Excel | Microsoft | N/A | |
| Adobe Illustrator | Adobe | ||
| Scale | Mettler | ||
| Scissors | World Precision Instruments | ||
| Ear punch | Nat’l band | ||
| CL 100 Light source | Welch Allyn | CL100 | |
| Nitrogen Gas | Jackson Welding Supply | N/A | |
| Heated Water bath | Neslab | RTE-140 | |
| Heating plate | In House | N/A | |
| Heating mat | Cincinnatti Sub Zero | 273 | |
| Clay mouse holder | Plast.i.clay American Art Clay Co. | N/A | |
| Betadine | MedLine | NDC53329-938-06 | |
| Cotton Tip Applicators | American Health Service | Ctag | |
| EtOH 70% | Fisher Scientific | BP2818-100 | |
| Gloves Nitrile | VWR | 89038-272 | |
| Diagnosys ERG Color Dome instrument | Diagnosys Inc. | D125 | |
| Contact lenses | In-house | N/A | |
| Diagnosys Software | Diagnosys Inc. | N/A | |
| Origin 6.1 software | OriginLab Corp. | N/A | |
| Reference electrodes | Ocuscience | F-Thread Electrode (DTL) 24” |
References
- Regus-Leidig, H., et al. In-vivo knockdown of Piccolino disrupts presynaptic ribbon morphology in mouse photoreceptor synapses. Front Cell Neurosci. 8 (259), 1-13 (2014).
- Jiang, L., Frederick, J. M., Baehr, W. RNA interference gene therapy in dominant retinitis pigmentosa and cone-rod dystrophy mouse models caused by GCAP1 mutations. Front Mol Neurosci. 7 (25), 1-8 (2014).
- Seo, S., et al. Subretinal gene therapy of mice with Bardet-Beidl Syndrome Type-1. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 54 (9), 6118-6132 (2013).
- Molday, L. L., et al. RD3 gene delivery restores guanylate cyclase localization and rescues photoreceptors in the RD3 mouse model of Leber congenital amaurosis 12. Hum. Mol. Genet. 22 (19), 3894-3905 (2014).
- Pang, J. J., et al. AAV-mediated gene therapy in mouse models of recessive retinal degeneration. Curr. Mol. Med. (3), 316-330 (2012).
- Vandenberghe, L. H., Auricchio, A. Novel adeno-associated viral vectors for retinal gene therapies. Gene Ther. 19 (2), 162-168 (2012).
- Tenenbaum, L., Lehtonen, E., Monahan, P. E. Evaluation of risks related to the use of adeno-associated virus-based vectors. Curr. Gene Ther. 3 (6), 545-565 (2003).
- Parikh, S., Le, A., Davenport, J., Gorin, M. B., Nusinowitz, S., Matynia, A. An alternative and validated injection method for accessing the subretinal space via a transcleral posterior approach. J. Vis. Exp. (118), e54808 (2016).
- Bainbridge, J. W. B., Mistry, A. R., Thrasher, A. J., Ali, R. R. Gene therapy for ocular angiogenesis. Clinical Science. 104, 561-575 (2003).
- Igarashi, T., Miyake, K., Asakawa, N., Miyake, N., Shimada, T., Takahashi, H. Direct comparison of administration routes for AAV-8 mediated ocular gene therapy. Curr. Eye Res. 38 (5), 569-577 (2013).
- Bennett, J., Duan, D., Engelhardt, J. F., Maguire, A. M. Real-time noninvasive in vivo.assessment of adeno-associated virus-mediated retinal transduction. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 38, 2857-2863 (1997).
- Ruggeri, M., et al. In vivo three-dimensional high-resolution imaging of the rodent retinal with spectral-domain optical coherence tomography. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 48 (4), 1808-1814 (2007).
- Berger, A., et al. Spectral domain optical coherence tomography of the rodent eye: highlighting layers of the outer retina using signal averaging and comparison with histology. PLoS One. 9 (5), 96494 (2014).
- Dysli, C., Enzmann, V., Sznitman, R., Zinkernagel, M. S. Quantitative analysis of mouse retinal layers using automated segmentation of spectral domain optical coherence tomography images. TVST. 4 (4), 9 (2015).
- Bhootada, Y., Choudhury, S., Gully, C., Gorbatyuk, M. Targeting caspase-12 to preserve vision in mice with inherited retinal degeneration. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 56, 4725-4733 (2015).
- Wert, K. J., Skeie, J. M., Davis, R. J., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. Subretinal injection of gene therapy vectors and stem cells in the perinatal mouse eye. J. Vis. Exp. (69), e4286 (2012).
- Berger, A., al,, et al. Spectral-domain optical coherence tomography of the rodent eye: highlighting layers of the outer retina using signal averaging and comparison with histology. PLoSOne. 9 (5), 96494 (2014).
- Muhlfriedel, R., Michalakis, S., Garrido, M. G., Biel, M., Seeliger, M. W. Optimized technique for subretinal injections in mice. Methods in Molecular Biology. , Clifton, NJ. (2013).
- Sarra, G. M., et al. Kinetics of transgene expression in mouse retina following subretinal injection of recombinant adeno-associated virus. Vision Res. 42, 541-549 (2002).
- Yan, Q. I., et al. Trans-corneal subretinal injection in mice and its effect on the function and morphology of the retina. PLoS One. 10 (8), 0136523 (2015).
- Park, S. W., Kim, J. H., Park, W. J., Kim, J. H. Limbal approach-subretinal injection of viral vectors for gene therapy in mice retinal pigment epithelium. J. Vis. Exp. (102), e53030 (2015).
- Westenskow, P. D., et al. Performing subretinal injections in rodents to deliver retinal pigment epithelium cells in suspension. J. Vis. Exp. (95), e52247 (2015).
- Butler, M. C., Sullivan, J. M. A novel, real-time, in vivo mouse retinal imaging system. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 56 (12), 7159-7168 (2015).
- Rolling, F., et al. Evaluation of adeno-associated virus-mediated gene transfer into the rat retina by clinical fluorescence photography. Hum. Gene Ther. 10, 641-648 (1999).
- Ferguson, L. R., Grover, S., Dominguez, J. M., Balaiya, S., Chalam, K. V. Retinal thickness measurement obtained with spectral domain optical coherence tomography assisted optical biopsy accurately correlates with ex vivo histology. PLoS One. 9 (10), 111203 (2014).
- Li, T., Snyder, W. K., Olsson, J. E., Dryja, T. P. Transgenic mice carrying the dominant rhodopsin mutation P347S: evidence for defective vectorial transport of rhodopsin to the outer segments. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93, 14176-14181 (1996).
- Brill, E., et al. A novel form of transducin-dependent retinal degeneration: accelerated retinal degeneration in the absence of rod transducing. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 48, 5445-5453 (2007).
- Olsson, J. E., et al. Transgenic mice with a rhodopsin mutation (Pro23His): a mouse model of autosomal dominant retinitis pigmentosa. Neuron. 9, 815-830 (1992).
- Humphries, M. M., et al. Retinopathy induced in mice by targeted disruption of the rhodopsin gene. Nat. Genet. 15, 216-219 (1997).
- Hruby, K. Clinical examination of the vitreous body. Proc. Roy. Soc. Med. 47, 163-170 (1953).
- Kolniak, T. A., Sullivan, J. M. cell-based toxicity screen of potentially therapeutic post-transcriptional gene silencing agents. Experimental Eye Research. 92, 328-337 (2011).
- Qi, Y., et al. Trans-corneal subretinal injection in mice and its effect on the function and morphology of the retina. PLoS One. 10 (8), 0136523 (2015).
- Timmers, A. M., Zhang, H., Squitieri, A., Gonzalez-Pola, C. Subretinal injections in rodent eyes: effects on electrophysiology and histology of rat retina. Mol. Vis. 7, 131-137 (2000).
- Johnson, C. J., Berglin, L., Chrenek, M. A., Redmond, T. M., Boatright, J. H., Nickerson, J. M. Technical brief: subretinal injection and electroporation into adult mouse eyes. Mol. Vis. 14, 2211-2226 (2008).
- Sullivan, J. M., Yau, E. H., Taggart, R. T., Butler, M. C., Kolniak, T. A. Bottlenecks in development of therapeutic post-transcriptional gene silencing agents. Vision Res. 48, 453-469 (2008).
