Summary
والهدف من هذا البروتوكول تقييم أثر العوامل برو ومكافحة ميجراتوري على الهجرة الخلية داخل مصفوفة فيبرينوجين ثلاثي الأبعاد.
Abstract
حاليا، معظم نماذج في المختبر لالتئام الجروح، مثل فحوصات الصفر الراسخة، تشمل دراسة إغلاق الخلية الهجرة والجرح على السطوح ثنائية الأبعاد. ومع ذلك، البيئة الفسيولوجية في الجرح الذي في فيفو الشفاء يأخذ مكان ثلاثي الأبعاد بدلاً من الأبعاد. أصبح من الواضح بشكل متزايد أن سلوك الخلية يختلف إلى حد كبير في الأبعاد مقابل بيئات ثلاثية الأبعاد؛ ولذلك، هناك حاجة للنماذج ذات الصلة أكثر فسيولوجيا في المختبر لدراسة سلوك الهجرة الخلية في إغلاق الجرح. الأسلوب الموصوفة هنا يسمح لدراسة الهجرة الخلية في نموذج ثلاثي الأبعاد التي تعكس بصورة أفضل الظروف الفسيولوجية من فحوصات الصفر ثنائي الأبعاد المحددة سابقا. والغرض من هذا النموذج تقييم ثمرة الخلية عن طريق فحص الهجرة الخلية بعيداً عن جسم كروي مضمنة داخل مصفوفة فيبرينوجين حضور عوامل برو أو مكافحة ميجراتوري. باستخدام هذا الأسلوب، ثمرة خلية من جسم كروي في مصفوفة ثلاثية الأبعاد يمكن ملاحظتها وهي قابلة للقياس بسهولة مع مرور الوقت عن طريق الفحص المجهري برايتفيلد وتحليل لمنطقة جسم كروي. يمكن أيضا تقييم تأثير العوامل الكثيرة الارتحال برو و/أو المثبطة على الهجرة الخلية في هذا النظام. يوفر هذا الأسلوب الباحثين مع طريقة بسيطة لتحليل الهجرة الخلية في الجرح ثلاثي الأبعاد المرتبطة المصفوفات في المختبر، مما يزيد من أهمية المختبر في الخلية دراسات مسبقة لاستخدام الحيوانات في فيفو نماذج.
Introduction
التئام الجروح هو عملية معقدة مما يؤدي إلى استعادة سلامة الأنسجة بعد الإصابة. يتم تقسيم هذه العملية إلى أربع مراحل متداخلة يشملها الأرقاء والتهاب والانتشار ويعيد البناء، التي يتم تنظيمها بكل بمزيج معقد من الرموز القابلة للذوبان والخلية-مصفوفة التفاعلات والاتصالات خلية. 1 , 2 تزامن هذه الرموز يتحكم العديد من الاستجابات الخلوية في التئام الجروح بما في ذلك، الأهم من ذلك، الهجرة الخلية. 3 , 4 الهجرة الخلية عملية ديناميكية للغاية تعتمد على تعمل الخلوية والخصائص البيوكيميائية والفيزيائية للوسط المصفوفة خارج الخلية. 5 الخلايا باستمرار التحقيق بيئتهم المصفوفة خارج الخلية من خلال مسارات إنتغرين بوساطة؛ تسمح هذه العملية الخلايا بمعنى مجموعة واسعة من خصائص المصفوفة بما في ذلك التضاريس والصلابة، والحبس. ثنائي الأبعاد (2D) تحليل الهجرة خلية يوضح أن الهجرة هو القوة الدافعة وراء تشكيل لاميليبوديا في طليعة من خلال توليد حزم خيوط الأكتين. اللاحقة تشكيل الالتصاقات المحورية في طليعة، في تركيبة مع أكتوميوسين مدفوعة انكماش وتراجع في الحافة، محركات أقراص الخلية إلى الأمام. 6 الهجرة الخلوية "ثلاثي الأبعاد" (3D) حاليا ليست مفهومة جيدا، إلا أن الدراسات الأخيرة تبين بأن الهجرة 3D اختلافاً مما ضوئها وصف الآلية في 2D، والمرجح أن تحركها آليات بديلة. على سبيل المثال، الدراسات الحديثة من بيتري وآخرون. أظهرت أن الخلايا في مصفوفات ثلاثية الأبعاد يمكنك التبديل اعتماداً على خصائص إدارة المحتوى في المؤسسة، بين لاميليبوديوم ولوبوبوديوم مدفوعة آليات الهجرة. 7 نظراً للهجرة الخلية عنصر حاسم للجرح شفاء استجابة، نماذج ثلاثية الأبعاد للهجرة الخلية ذات أهمية حاسمة لفهم الاستجابات الفسيولوجية للمنبهات المختلفة أثناء التئام الجروح. على الرغم من أن سلوك الخلية المهاجرة على الأسطح 2D ثبت أن تختلف اختلافاً كبيرا من الهجرة في مصفوفات ثلاثية الأبعاد، الأكثر حداثة في المختبر نماذج الهجرة الخلية خلال الجرح شفاء العملية، بما في ذلك الفحص الصفر الراسخة، الاستفادة من 2D أحادي الطبقة الثقافات. 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 فحوصات أكثر وضعت مؤخرا استخدمت مصفوفة ثلاثية الأبعاد، ولكن لا تزال الثقافة الخلايا في أحادي الطبقة على رأس المصفوفة، مما يحد من القدرة على الخص حقاً ثريديمينسيوناليتي البيئة خلية المجراة في. 15
وغرض الأسلوب الموصوفة هنا دراسة الهجرة الخلية في نموذج ثلاثي الأبعاد ذات صلة الفيزيولوجية، وليس على سطح ثنائي الأبعاد، بغية التوصل إلى فهم أكثر قوة للردود الهجرة المرتبطة بالمنبهات التطبيقية. يسمح هذا الأسلوب للتقييم للهجرة الخلية داخل مصفوفة 3D فيبرينوجين جلطة حضور عوامل تنشيط أو تمنع المسارات المرتبطة بالهجرة الخلية. مصفوفة فيبرينوجين تم اختياره لهذا الأسلوب بسبب اللعب فيبرينوجين دوراً حاسما في المراحل المبكرة من التئام الجروح؛ الإصابات التالية، جلطة فيبرينوجين تتشكل داخل بيئات الجرح لوقف فقدان الدم ويعمل سقالة لتسلل خلية أولية أثناء إصلاح الأنسجة وإعادة عرض. 2 , 16 , 17 , 18 , 19 , بالإضافة إلى ذلك، 20 فيبرينوجين يستخدم سريرياً كتسرب جراحية وتكوين السدود قد تم مرتبطة بالهجرة الخلية، وفي نهاية المطاف نتائج الشفاء. دراسة سابقة أجرتها كوكس وآخرون. التحقيق الهجرة تنتجها الخلايا الليفية بجلطات فيبرينوجين تتألف من فيبرينوجين متفاوتة وتركيزات ثرومبين غرض الاستفادة المثلى من تسرب فيبرينوجين. في هذه الدراسات، وكان كمياً هجرة الخلايا من جلطات فيبرينوجين على الأطباق البلاستيكية. 20 هنا نقدم أسلوب يسمح للتحديد الكمي لهجرة خلايا داخل بيئة فيبرينوجين 3D. بينما يستخدم الأسلوب الموصوفة في هذا البروتوكول تحديداً فيبرينوجين، يمكن تعديل هذا النموذج بسهولة استخدام مواد بديلة المصفوفة كما هو مطلوب، مثل الكولاجين أو المصفوفات الأخرى 3D. بالإضافة إلى ذلك، نقدم استخدام تنتجها الخلايا الليفية الماغنيسيوم في هذا التحليل لأن الهجرة تنتجها الخلايا الليفية في السرير الجرح أمر بالغ الأهمية لتوليف المصفوفة خارج الخلية والأنسجة إصلاح/إعادة عرض. ومع ذلك، هي العَدلات العملية خلال الإصلاح نوع الخلية الأولى ترحيل إلى السرير الجرح، وتليها الضامة. ثم تبدأ الليفية للتسلل البيئة الجرح حوالي 48 ساعة بعد الإصابة الأولية، في بداية المرحلة التكاثري للجرح شفاء العملية. 19 هذا التحليل يمكن تعديلها بسهولة لتضمين العَدلات، الضامة، أو أنواع الخلايا الأخرى لتقييم كيف تؤثر التغييرات في هيكل فيبرينوجين جلطة الهجرة أنواع هذه الخلية. 21
لتنفيذ هذا التحليل، أولاً، تتشكل كروي تنتجها الخلايا الليفية استخدام تعديل التقنيات الموضحة سابقا لزراعة الخلايا الجذعية. 22 كروي تنتجها الخلايا الليفية بعد ذلك نقل إلى مصفوفة فيبرينوجين 3D، وثمرة يمكن ثم بسهولة رصدها وقياسها كمياً على مدى عدة أيام. يأخذ هذا البروتوكول في حساب 3D النظم الفسيولوجية عن طريق تضمين الماغنيسيوم خلية ثلاثية الأبعاد داخل مصفوفة فيبرينوجين، وبالتالي تجنب أوجه القصور في الأهمية الناجمة عن استخدام سطح نمو 2D مع أحادي الطبقة خلية للسلوك النموذجي المهاجرة، في حين لا يزال يسمح لتقييم سلوك الخلية في بيئة عالية التي تسيطر عليها في المختبر .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-يوم 1: الخلية وإعداد كاشف
ملاحظة: ينبغي أن يقوم جميع إعداد الخلية وكاشف في سلامة بيولوجية مجلس الوزراء لمنع تلوث العينات.
- بتصفية الحار دولبيكو ' s النسر التعديل ' s المتوسطة (دميم)، المصل البقري الجنين (FBS)، ل الجلوتامين، والبنسلين/ستربتوميسين في حمام مائي 37 درجة مئوية.
- إعداد المواليد البشرية عن طريق الجلد تنتجها الخلايا الليفية (هدفن) وسائط الإعلام باستكمال استعد دميم مع 10% FBS والبنسلين/ستربتوميسين 1% 1% لتر-الجلوتامين.
- ذوبان قنينة مجمدة هدفنس والطرد المركزي لمدة 8 دقائق في 200 x ز لإزالة المتوسطة للواسمات. ريسوسبيند الخلايا في استعداد هدفن الوسائط في كثافة 1 × 10 6 خلايا/مل والبذور في قارورة ثقافة T-75.
- قارورة مكان في حاضنة (37 درجة مئوية، 5% CO 2) للسماح بانتشار الخلايا.
- "هدفن تخزين" الوسائط في 4 ° C.
- إعداد الكواشف للمحترفين ومكافحة migratory حسب الحاجة.
2. يوم 3: إعداد كروي
- القيام بما يلي في غطاء ثقافة لمنع تلوث العينات.
- عندما تصل الخلايا إلى 80% كونفلوينسي، نضح وسائط الإعلام، وإضافة 5 مل من 0.25% يدتا التربسين. قارورة مخزن في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لفصل الخلايا من سطح قارورة كاملة-
- إضافة 5 مل من وسائل الإعلام المعالجون بقارورة لتحييد التربسين.
- في أنبوب ميكروسينتريفوجي، خلط 10 ميكروليتر تريبان الأزرق و 10 ميكروليتر من تعليق خلية.
- أجهزة الطرد المركزي من تعليق خلية الأصلي لمدة 8 دقائق في 200 غ. س
- بينما هو يجري فصل تعليق خلية، إضافة 10 ميكروليتر من تعليق خلية تريبان الأزرق إلى هيموسيتوميتير وإجراء حساب خلية.
- عقب الطرد المركزي، نضح وسائل الإعلام دون إزاحة بيليه الخلية. ريسوسبيند بيليه الخلية بتركيز 1.25 × 10 5 خلايا/مل.
- إضافة 5 مل من الفوسفات العقيمة مخزنة المالحة (PBS) إلى الجزء السفلي من 10 سم طبق بيتري الحفاظ على بيئة المائية خلال النمو كروي.
- عكس غطاء طبق بيتري. إضافة عدة قطرات ميكروليتر 20 من تعليق خلية على السطح الداخلي للغطاء طبق بيتري.
- بسرعة عكس الغطاء مرة أخرى ووضعه مرة أخرى على الجزء السفلي من الطبق، مع الحرص على عدم إزاحة قطرات معلقة. ويبين الشكل 1 معلقة بنجاح تشكيل قطرات.
- بعناية وضع الطبق في حاضنة 37 درجة مئوية وتسمح الماغنيسيوم تنمو في شنقاً إسقاط ثقافة لمدة 72 h.
3. يوم 6: تضمين الماغنيسيوم في مصفوفة 3D
- القيام بما يلي في غطاء ثقافة لمنع تلوث العينات.
- لتشكيل أول طبقة فيبرينوجين، إنشاء حل جلطة من حجم كاف لإضافة 100 ميكروليتر الحل تجلط الواحد جيدا للعديد من الآبار كالمطلوبة (كروي 1 كل بئر). وتتألف من 10% 10 X HEPES المخزن المؤقت جلطات بحجم (250 ملم حبيس، 1500 ملم كلوريد الصوديوم، كاكل 50 مم 2، الرقم الهيدروجيني 7.4) والفيبرينوجين البشرية 2 مغ/مل U/mL 0.1 البشرية ثرومبين ألفا. ما تبقى حجم جلطة تتكون من الماء عالي النقاوة.
- ثرومبين إضافة آخر وبسرعة إضافة الحل إلى الآبار المرغوبة في لوحة 48-جيدا من أجل منع الجلطات مبلمرة قبل إضافتها إلى الآبار.
- بلطف يهز/والاستفادة من لوحة جيدا لضمان أن فيبرينوجين جلطة الخليط هو دهان الكامل جيدا، ثم ضع لوحة جيدا في الحاضنة ح 1 للسماح للطبقة السفلي تجلط بلمرة. لا تهز لوحة جيدا ما يكفي من الثابت للحث على تشكيل فقاعة؛ لوحة الصخور ببساطة حسب الضرورة حتى يتم المغلفة بأكملها شكل جيد. إذا استخدمت وحدات تخزين أكبر من جلطة، قد لا تكون هذه الخطوة ضرورية.
- نقل الماغنيسيوم إلى طبقة فيبرينوجين-
لوحة
- إزالة جيدا وطبق بتري يحتوي على الماغنيسيوم في الشنق إسقاط ثقافة من الحاضنة ودراسة الماغنيسيوم تحت مجهر. ثم ضع الطبق إلى هود الثقافة-
- بعناية عكس غطاء صحن بيتري للسماح بالوصول إلى الشنق إسقاط الثقافات.
- بعناية باستخدام إبرة ز 21 المرفقة بحقنه 1 مل، نقل قطره واحدة من غطاء مقلوب داخل المركز من كل جيدا، مع الحرص على عدم ثقب طبقة فيبرينوجين مبلمرة طلاء أسفل البئر. فعالية نقل القطرة، سحب ببطء الانخفاض في الإبرة. وقف سحب المكبس مرة أخرى في أقرب وقت إسقاط كامل داخل الإبرة؛ سحب القطرة بعيداً جداً قد يعرض فقاعات الهواء، والتي يمكن أن تعطل نقل كروي فعالة أو تصوير اللاحقة-
- دراسة لوحة جيدا تحت مجهر للتأكد من أن الماغنيسيوم قد تحول بشكل صحيح في آبار كل المطلوب.
- لتشكيل الطبقة الثانية فيبرينوجين، إنشاء حل جلطة آخر باستخدام إعداد نفس النحو الوارد أعلاه لإنشاء طبقة فيبرينوجين الأولى (الخطوة 3، 2). "الماصة؛" 100 ميكروليتر إلى كل قطره المحتوية على كروي بعناية ودراسة تحت مجهر مرة أخرى للتأكد من أن الماغنيسيوم لا تزال على حالها، ولا تم دفعها على حواف الآبار-
- إرجاع لوحة جيدا للحاضنة والسماح للطبقة الثانية بلمرة حاء – 1
4. يوم 6: إضافة برو المهاجرة أو العوامل المثبطة
- وسائل الإعلام "هدفن الحارة" إلى 37 درجة مئوية.
- الخطوات التالية في غطاء لمنع التلوث.
- إعداد الوسائط لكل مجموعة بما في ذلك تركيزات ملائمة لوكلاء برو-migratory المضادة تقييم-
- إزالة لوحة جيدا من الحاضنة ومكان في غطاء ثقافة-
- ميكروليتر 500 إضافة وسائط القياسية لكل بئر من السيطرة على المجموعة كروي و 500 ميكروليتر من وسائل الإعلام المثبطة لكل بئر فريق كروي تثبيط الهجرة 500 ميكروليتر من وسائل الإعلام الموالية المهاجرة لكل بئر فريق كروي تعزيز الهجرة-
- إرجاع لوحة جيدا للحاضنة.
- تغير وسائل الإعلام كل حاء 48
5. 6-9 أيام: التقييم للهجرة الخلية وانتشار
الماغنيسيوم- الصورة باستخدام الفحص المجهري برايتفيلد فورا بعد إضافة الوسائط (ح 0) وبعد ذلك كل 24 ساعة ل h. 72 اختياري: عند كل نقطة من الزمن، تأخذ صورة z-كومة من أجل تحديد ما إذا كان يتم حدوث الهجرة في الطائرات خارج مجال التركيز الرئيسي. في تجربتنا لا يحدث هذا؛ ومع ذلك، أنها مفيدة لضمان هذا هو الحال في كل تجربة.
- "استخدام إيماجيج" لتحديد الخلية ثمرة في كل بئر من خلال تحليل الزيادة المئوية في المجال لكل كروي بتتبع الحدود خلية لكل كروي عند كل نقطة الزمنية المتعاقبة واستخدام " التدبير " الدالة للحصول على المجال.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ثقافة كروي يمكن أن تستخدم لتقييم أثر العوامل المؤيدة والمناهضة الهجرة على الهجرة تنتجها الخلايا الليفية في المختبر بنجاح
يمكن أن تتكون الماغنيسيوم 3D تنتجها الخلايا الليفية عبر الشنق ثقافة الإفلات على مدى فترة 72 ساعة (الشكل 1). وعقب فترة الثقافة، الماغنيسيوم المضمنة داخل المصفوفة تجلط وتصويرها باستخدام مجهر برايتفيلد (الشكل 2). المناطق الأولية من الماغنيسيوم (المبينة في الشكل كمجالات محدودة بحدود بيضاء) مصممة باستخدام إيماجيج وتستخدم كنقطة مرجعية لتحديد درجة ثمرة الخلية اللاحقة من الهيئات كروي. تم تحديد القياسات الأولى متوسط المساحة الماغنيسيوم لتكون 4.3 × 104 ميكرومترات2 ± 1.1 x 104 ميكرومترات2 للتحكم الماغنيسيوم، 4.4 × 104 ميكرومترات2 ± 1.1 x 104 ميكرومترات2 للمحترفين المهاجرة الماغنيسيوم، و 4.5 × 104 ± 7.7 × 103 ميكرومتر2 الماغنيسيوم المناهضة الهجرة. الوسائط التي تحتوي على عوامل برو أو مكافحة migratory أضيفت إلى جلطات المحتوية على كروي، وثمرة خلية من جسم كروي الأولى تم تصويرها كل 24 ساعة، مع الصور النهائية المتخذة ح 72 بعد أن تمت إضافة الوسائط الأصلية (الشكل 3).
عند الانتهاء من هذه التجربة، وقد تم تحليل نمو كروي على مر الزمن باستخدام إيماجيج لحساب التغيرات في مجال كروي لكل عينة. كما هو موضح في الشكل 3، استخدمت الحافة الأبعد من الكتلة الخلية عند كل نقطة الوقت لتحديد درجة محددة من ثمرة الخلية. ونحن نتوقع أن بقع خارج نطاق التركيز هو موضح في الشكل 3 خلية الحطام، ولم نعتمد هذا في أعمالنا الكمي. وتظهر الصور كاملة الحجم حد خلية واضحة ومستمرة الخارجة من جسم كروي؛ فمن هذه الحدود التي يتم إرجاعها عند تحديد ثمرة. كان كمياً ثمرة الخلية بتطبيع المنطقة ثمرة الخلية بالنسبة لمنطقة جسم كروي الأصلي في t = 0 ح، وثم تعرب عن النمو كنسبة مئوية من منطقة كروي الأصلي. التحديد الكمي لثمرة الخلية على مدى فترة 72 ح يكشف أن الماغنيسيوم يتعرض لعامل برو المهاجرة يحمل درجة زيادة كبيرة من الهجرة بعيداً عن جسم كروي الأصلي بالمقارنة مع الماغنيسيوم يتعرضون عامل الهجرة المثبطة والماغنيسيوم التحكم يتعرضون لوسائل الإعلام القياسية (ف < 0.0001، الرقم 4). على العكس من ذلك، أظهرت الماغنيسيوم يتعرض إلى عامل هجرة المضادة درجة انخفاض كبير للهجرة بعيداً عن جسم كروي الأصلي عند مقارنتها بمراقبة الماغنيسيوم (ف < 0.0001).
للمقارنة، قدمنا مثالاً مقايسة الصفر (الشكل 5). أجرى هذا التحليل من قبل البذر الليفية في 500,000 الخلايا/سم2 في بئر 24-لوحات المطلي مع الفيبرينوجين 2 ملغ/مل. وسمح الليفية تنمو بين عشية وضحاها. ثم تم خدش السطح جيدا مع تلميح ماصة، والهجرة الخلية إلى منطقة التسويد تم تصويرها على مدار 24 ساعة. كما هو موضح في الصور الممثل في الشكل 5ألف، هناك حدود لهذا التحليل؛ لا خدوش استنساخه جداً وفي بعض الحالات، الحدود هي عدم وضوح. بيد اتجاهات الهجرة عموما حضور عوامل برو ومكافحة migratory هي نفسها كتلك موجودة في مقايسة كروي ثلاثي الأبعاد، على الرغم من تقلب السالفة الذكر، والاختلافات في أنماط الهجرة. تجدر الإشارة إلى أن معدلات الهجرة أسرع في مقايسة الصفر 2D، مقارنة بمقايسة كروي ثلاثي الأبعاد. الإغلاق كان أسرع حضور الوكيل برو-الهجرة وأغلقت جميع العينات مثقف حضور الوكيل برو المهاجرة تماما خلال 24 ساعة.
الشكل 1 : الليفية الجلدية البشرية في شنقاً إسقاط الثقافة- يتم ترك الخلايا في شنقاً إسقاط ثقافة ح 72 للحث على تشكيل كروي. الأعلى (A) ومنظر جانبي (ب) معلقة إسقاط ثقافة ترد. (ج) التخطيطي يصور منظر جانبي لتشكيل كروي في قطره معلقة. الخط الأسود يمثل الجزء العلوي من اللوحة ومجال الوردي يمثل وسائل الإعلام ومجالات الأرجواني تمثل الخلايا داخل كروي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : مظهر كروي بعد تضمين الأولية في مصفوفة فيبرينوجين (t = 0 ح بعد إضافة وسائل الإعلام) تصويرها باستخدام المجهر برايتفيلد في 10 X التكبير. (أ، د) كروي التحكم؛ (باء، هاء) كروي يتعرض لعامل المناهضة الهجرة في وسائل الإعلام؛ (ج، و) كروي يتعرضون لوكيل هجرة المحترفين في وسائل الإعلام. يتم عرض الصور مع (د-و) ودون (أ-ج) الخطوط البيضاء التي تشير إلى الحدود المستخدمة لتحديد منطقة ثمرة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : مظهر كروي بعد 72 ساعة تصويرها باستخدام المجهر برايتفيلد في التكبير X 10- (أ، د) كروي التحكم؛ (باء، هاء) كروي يتعرض لعامل المناهضة الهجرة في وسائل الإعلام؛ (ج، و) كروي يتعرضون لوكيل هجرة المحترفين في وسائل الإعلام. يتم عرض الصور مع (د-و) ودون (أ-ج) الخطوط البيضاء التي تشير إلى الحدود المستخدمة لتحديد منطقة ثمرة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 : كروي النمو ما يزيد على 72 h. وكلاء برو-الهجرة والهجرة المضادة في وسائل الإعلام تظهر أن يؤثر بشكل ملحوظالهجرة تنتجها الخلايا الليفية والانتشار في بيئات 3D. N = 3/المجموعة؛ * يمثل ف < 0.0001. أشرطة الخطأ تمثل الانحرافات المعيارية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 5 : مقارنة للمقايسة الصفر 2D القياسية. (أ) صور الممثل للهجرة الخلية في مقايسة الصفر معيار أكثر من 24 ساعة. كانت تزرع الليفية في وسائل الإعلام مكيفة مع عوامل برو أو مكافحة migratory، وتم قياس كمية الاختلافات في إغلاق الصفر على مر الزمن. (ب) النسبة المئوية الإغلاق على مر الزمن للخلايا الليفية التي نمت في السيطرة، المهاجرة برو، أو وسائل الإعلام المناهضة الهجرة. على الرغم من أن هناك اختلافات في أنماط الهجرة الحالية في هذا التحليل 2D مقابل المقايسة كروي ثلاثي الأبعاد، الاتجاهات العامة للهجرة تبقى ثابتة. N = 3/المجموعة؛ * يمثل ف < 0.05. أشرطة الخطأ تمثل الانحرافات المعيارية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يسمح هذا البروتوكول لدراسة الهجرة الخلية في التئام المرتبطة ECMs من خلال في المختبر نموذج الثلاثي الأبعاد. خطوة حاسمة في التنفيذ السليم لهذا الإجراء هو التنمية السليمة الماغنيسيوم تنتجها الخلايا الليفية؛ تركيز خلية أثناء إعداد الأمثل لتعطي بتركيز أولية من الخلايا 2,500 والإفلات، مما يسمح الماغنيسيوم بشكل موثوق على مدى فترة حضانة المرض من ح 72. إذا كان يتم استخدام عدد كاف من الخلايا، لا يجوز تجميع فعالية الماغنيسيوم وقد التفكك عند يتم نقلها وجزءاً لا يتجزأ في طبقات فيبرينوجين. إذا كان يتم استخدام أنواع مختلفة من الخلايا، قد يكون تركيز الخلية الأولى و/أو كروي إنضاج الوقت الواجب تعديلها بغية الحصول على تشكيل كروي متسقة ومستقرة. لأنواع الخلايا التي تتكاثر ببطء أكثر من الخلايا الليفية، قد تكون أعلى كثيرا تركيز خلية أولية اللازمة لضمان تشكيل كروي السليم خلال 72 ساعة الزمنية. لا ينبغي أن تظل الخلايا في شنقاً إسقاط ثقافة أطول من 72 ح بسبب عدم القدرة على تغيير وسائل الإعلام على الماغنيسيوم بينما في الثقافة. الاختلافات في حجم كروي الأولية المتوقع بسبب التقلبات البيولوجية المتأصلة؛ علينا معالجة هذا التغير بدءاً بتشكيل كروي عدد ثابتاً من الخلايا تقليل حجم الخلافات بقدر الإمكان، وتطبيع النمو مع مرور الوقت للسماح بإجراء مقارنات البيانات.
أن التحدي الأساسي لتنفيذ هذا الأسلوب هو نقل الماغنيسيوم من شنقاً إسقاط الثقافة في المصفوفة جلطة. يستخدم هذا البروتوكول الإبر والمحاقن لنضح الحبرية المحتوية على كروي من غطاء صحن بيتري مقلوب، ولكن يمكن أيضا أن تطبق أساليب أخرى، مثل استخدام الملقط أو ميكروبيبيتيس تعلق على نصائح المشذبة، فعالية نقل إسقاط الماغنيسيوم من معلق للمصفوفة. يمكن نقل الماغنيسيوم موثوق بها عن طريق سحب المكبس للمحاقن الخلف قليلاً قبل نقل الحبرية، وضمان أن الحبرية توضع في الإبرة ببطء حيث أن عدم إدخال فقاعات الغاز في الحبرية. المكبس حقنه ينبغي إلا تكون انسحبت ما يكفي لتحقيق كامل الحبرية الإبرة؛ سحب أي زيادة سوف أيضا إدخال فقاعات وتتداخل مع نقل الماغنيسيوم موثوقة إلى الآبار التي بليت جيدا. معلقة المتخصصة إسقاط ثقافة لوحات يمكن أيضا أن تستخدم من أجل تبسيط ثقافة كروي، ولكن أقل تكلفة وسيلة فعالة للقيام بذلك من استخدام ببساطة طبق قياسية.
خلال الجرح الشفاء في فيفو، إنتاج الخلايا الليفية التي تغزو منطقة الجرح البروتياز سيرين واسعة النطاق التي تسفر عن تدهور مصفوفة فيبرينوجين. وفي وقت لاحق توليف هذه الخلايا المصفوفة خارج الخلية الجديدة، تتألف أساسا من الكولاجين، بغية إصلاح الأنسجة التالفة. 23 هذه الآلية للهجرة يسمح لغزو الخاضعة للرقابة التي لم يتم التقاطها بواسطة أسلوبنا ويمثل قيداً للنظام. تجدر الإشارة أيضا إلى أن الخلايا الليفية المستخدمة في هذا الأسلوب سوف تفرز البروتياز التي سيكون على مر الزمن تتحلل بشبكة فيبرينوجين؛ ولذلك، إذا كان الأجل الطويل (> 72 ساعة) المرغوب فيها دراسات الهجرة، مثبطات البروتياز، مثل أبروتينين، ينبغي أن تضاف إلى وسائل الإعلام ثقافة الخلية.
وعلى الرغم من هذه القيود، يوفر هذا الأسلوب طريقة بسيطة وفعالة من حيث التكلفة، واستنساخه لدراسة الخلية 3D الهجرة في المختبر. بينما تحتفظ توفير بيئة ذات صلة أكثر فسيولوجيا من نماذج 2D استخداماً، وتحليل النمو في النموذج الثلاثي الأبعاد المبينة في هذا التقرير تحليل مستقيمة توفرها نماذج ثنائية الأبعاد. الماغنيسيوم من السهل تصور استخدام الفحص المجهري برايتفيلد أو مرحلة بسيطة، وإذا رغبت في ذلك، يمكن بسهولة تعديل هذا الأسلوب لاستخدامه في الفحص المجهري الأسفار بوسم فلوريسسينتلي أغشية الخلية والبروتينات مصفوفة. هذا البروتوكول استخدام الخلايا الليفية الجلدية البشرية الأطفال حديثي الولادة بسبب دور الهجرة تنتجها الخلايا الليفية في الأنسجة إصلاح/إعادة عرض. إذا رغبت في ذلك، العَدلات، الضامة، والخلايا الكيراتينيه أو أنواع الخلايا الأخرى يمكن استخدام في هذا التحليل لتقييم كيف تؤثر التعديلات في هيكل فيبرينوجين جلطة على هجرة أنواع الخلايا الأخرى المعنية في التئام الجروح. مواد ثلاثية الأبعاد كما يمكن تعديلها حسب الحاجة؛ اعتماداً على التطبيق المطلوب، قد تستخدم الكولاجين أو غيرها من المواد مصفوفة ثلاثية الأبعاد بدلاً من مصفوفة فيبرينوجين بغية تقديم نموذج فسيولوجيا ذات صلة. يمكن الحصول على نموذج مفيد لدراسة الهجرة الخلية الأطول أجلاً في بيئة شبيهة بالجرح بهذا البروتوكول باستخدام الخلايا الكيراتينيه والكولاجين بدلاً من الخلايا الليفية وفيبرينوجين. الأساليب الموصوفة أيضا السماح بقدر أكبر من المرونة والفعالية من حيث التكلفة في الهجرة الخلية والجرح الشفاء الدراسات من خلال تنفيذ نموذج فسيولوجيا ذات الصلة في المختبر بدلاً من طلب العمل الفوري في فيفو وبعد الدراسات الكلاسيكية ثنائي الأبعاد في المختبر .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
وقدم التمويل لهذا العمل من خلال جمعية القلب الأمريكية (16SDG29870005) وولاية كارولينا الشمالية الدولة الجامعة للبحث والابتكار التمويل الأولى.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium, 4.5 g/L Glucose, w/ Sodium Pyruvate, w/out L-Glutamine | VWR | VWRL0148-0500 | DMEM already containing L-glutamine can also be used |
| 100mm Tissue Culture Dish, Non-Treated, Sterilized, Non-Pyrogenic | VWR | 10861-594 | Dishes of any size can be used for hanging drop culture |
| Fetal Bovine Serum from USDA approved countries, heat inactivated, sterile-filtered, cell culture tested | Sigma-Aldrich | 12306C-500ML | |
| L-glutamine | Fisher Scientific | ICN1680149 | Not needed if using DMEM that already contains L-glutamine |
| Penicillin-Streptomycin Solution stabilized, sterile-filtered, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL | Sigma-Aldrich | P4333-100ML | |
| Human Dermal Fibroblasts, neonatal | Thermo Fisher | C0045C | Can be replaced with other cell type of interest |
| 21 G x 1 1/2' needle | BD | 305167 | 22 G x 1 1/2 needles will also work |
| 1 mL syringe | VWR | 89174-491 | Syringes of any volume can be used |
| Cell Culture Multiwell Plates, Polystyrene, Greiner Bio-One (Individially Wrapped) (48 wells) | VWR | 82051-004 | |
| Human Fibrinogen - Plasminogen, von Willebrand Factor and Fibronectin Depleted | Enzyme Research Laboratories | FIB 3 | Can be replaced with matrix protein of interest |
| Human Alpha Thrombin | Enzyme Research Laboratories | HT 1002a | May not be necessary depending on matrix protein of interest |
| Equipment | |||
| BSL2 cell culture hood | |||
| Cell culture incubator | |||
| Inverted microscope with 10X objective | |||
| Centrifuge compatibile with 15 mL tubes |
References
- Chester, D., Brown, A. C. The role of biophysical properties of provisional matrix proteins in wound repair. Matrix Biol. , (2016).
- Martin, P., Leibovich, S. J. Inflammatory cells during wound repair: the good, the bad and the ugly. Trends in Cell Biology. 15 (11), 599-607 (2005).
- Lin, B., Yin, T., Wu, Y. I., Inoue, T., Levchenko, A. Interplay between chemotaxis and contact inhibition of locomotion determines exploratory cell migration. Nat Commun. 6, 6619 (2015).
- Ngalim, S. H., et al. Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy. J Vis Exp. (74), (2013).
- Charras, G., Sahai, E. Physical influences of the extracellular environment on cell migration. Nat Rev. Mol Cell Biol. 15 (12), 813-824 (2014).
- Petrie, R. J., Yamada, K. M. Fibroblasts Lead the Way: A Unified View of 3D Cell Motility. Trends Cell Biol. 25 (11), 666-674 (2015).
- Petrie, R. J., Gavara, N., Chadwick, R. S., Yamada, K. M. Nonpolarized signaling reveals two distinct modes of 3D cell migration. J Cell Biol. 197 (3), 439-455 (2012).
- Carlson, M. W., Dong, S., Garlick, J. A., Egles, C. Tissue-Engineered Models for the Study of Cutaneous Wound-Healing. Bioengineering Research of Chronic Wounds. , http://link.springer.com/chapter/10.1007/978-3-642-00534-3_12 263-280 (2009).
- Doyle, A. D., Wang, F. W., Matsumoto, K., Yamada, K. M. One-dimensional topography underlies three-dimensional fibrillar cell migration. J Cell Bio. 184 (4), 481-490 (2009).
- Fraley, S. I., et al. A distinctive role for focal adhesion proteins in three-dimensional cell motility. Nat Cell Biol. 12 (6), 598-604 (2010).
- Petrie, R. J., Doyle, A. D., Yamada, K. M. Random versus directionally persistent cell migration. Nat Rev. Mol Cell Biol. 10 (8), 538-549 (2009).
- Rommerswinkel, N., Niggemann, B., Keil, S., Zänker, K. S., Dittmar, T. Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix. J Vis Exp. (92), (2014).
- Jonkman, J. E. N., et al. An introduction to the wound healing assay using live-cell microscopy. Cell Adh Migr. 8 (5), 440-451 (2014).
- Lämmermann, T., et al. Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing. Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).
- Chen, Z., Yang, J., Wu, B., Tawil, B. A Novel Three-Dimensional Wound Healing Model. J Dev Biol. 2 (4), 198-209 (2014).
- Ross, R., Benditt, E. P. Wound healing and collagen formation. The J Cell Biol. 12 (3), 533-551 (1962).
- Sproul, E. P., Argraves, W. S. A cytokine axis regulates elastin formation and degradation. Matrix Biol. 32 (2), 86-94 (2013).
- Almine, J. F., Wise, S. G., Weiss, A. S.
- Tracy, L. E., Minasian, R. A., Caterson, E. J. Extracellular Matrix and Dermal Fibroblast Function in the Healing Wound. Adv Wound Care. 5 (3), 119-136 (2016).
- Cox, S., Cole, M., Tawil, B. Behavior of Human Dermal Fibroblasts in Three-Dimensional Fibrin Clots: Dependence on Fibrinogen and Thrombin Concentration. Tissue Eng. 10 (5-6), 942-954 (2004).
- Brown, A. C., Barker, T. H. Fibrin-based biomaterials: Modulation of macroscopic properties through rational design at the molecular level. Acta Biomaterialia. 10 (4), 1502-1514 (2014).
- Bartosh, T. J., Ylostalo, J. H. Preparation of anti-inflammatory mesenchymal stem/precursor cells (MSCs) through sphere formation using hanging drop culture technique. Curr Protoc Stem Cell Biol. 28, Unit-2B.6 (2014).
- Bainbridge, P. Wound healing and the role of fibroblasts. J Wound Care. 22 (8), 410-412 (2013).
