Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

אפיון נדידת תאים בתוך תלת מימדי במבחנה פצע סביבות

Published: August 16, 2017 doi: 10.3791/56099
Automatic Translation
1,2, 1,2
1Joint Department of Biomedical Engineering, North Carolina State University and The University of North Carolina - Chapel Hill, 2Comparative Medicine Institute, North Carolina State University

Summary

המטרה של פרוטוקול זה היא להעריך את ההשפעה של גורמים פרו - ו אנטי - migratory על נדידת תאים בתוך מטריצה תלת מימדי פיברין.

Abstract

כיום, רוב במבחנה מודלים של פצע ריפוי, כגון מבחני מאפס ומבוססת, לערב לומד תא העברה וגמר הסגר על משטחים דו-ממדית. עם זאת, הסביבה פיזיולוגיות אשר ויוו ריפוי הפצע מתקיים הוא תלת מימדי ולא דו מימדי. כעת ברור יותר ויותר בהתנהגות התא משתנה במידה רבה בין מימדי לעומת סביבות תלת-מימדי; לכן, אין צורך יותר מבחינה פיזיולוגית הרלוונטיים במבחנה מודלים עבור לומד התנהגויות ההעברה תא לסגירת הפצע. השיטה המתוארת במסמך זה מאפשר לחקר נדידת תאים במודל תלת-ממדי שמשקף טוב יותר בתנאים פיזיולוגיים מאשר שנקבעו קודם מימדי מבחני מאפס. מטרת מודל זה היא להעריך תא תוצר באמצעות הבחינה של נדידת תאים מהגוף ספרואיד מוטבע בתוך מטריצה פיברין בנוכחות גורמים פרו - או אנטי - migratory. באמצעות שיטה זו, תוצר תא מהגוף ספרואיד במטריצה תלת מימדי יכול להיות שנצפו והוא לכימות בקלות לאורך זמן באמצעות מיקרוסקופ brightfield וניתוח של ספרואיד הגוף באזור. גם ניתן להעריך את ההשפעה של גורמים פרו-נודדים ו/או מעכבות על נדידת תאים במערכת זו. שיטה זו מספקת חוקרים שיטה פשוטה של ניתוח נדידת תאים הפצע תלת ממדי משויכות מטריצות במבחנה, ובכך מגדילים את הרלוונטיות של חוץ גופית בתוך התא מחקרים לפני השימוש ב- vivo חיה מודלים.

Introduction

ריפוי הפצע הוא תהליך מורכב אשר התוצאות השיקום של רקמות תקינות בעקבות פגיעה. תהליך זה מחולק לארבעה שלבים חופפים הקיף על ידי hemostasis, דלקת, התפשטות, שיפוץ, שמווסתים אחד על ידי שילוב מורכב של רמזים מסיסים, תא-מטריקס אינטראקציות ותקשורת תא-תא. 1 , 2 העיבוד התזמורתי של רמזים אלה שולט שפע של תגובות הסלולר ב ריפוי הפצע כולל, חשוב, נדידת תאים. 3 , 4 נדידת תאים הוא תהליך דינמי מאוד תלויה פנוטיפים הסלולר והן את המאפיינים הביוכימי ו ביופיזיקלי של הסביבה שבה התרחשה מטריצה חוץ-תאית. 5 תאים ללא הרף לחקור את סביבתם מטריצה חוץ-תאית בתיווך אינטגרין מסלולים; תהליך זה מאפשר תאים לחוש מגוון רחב של נכסים מטריקס כולל הטופוגרפיה, קשיחות של כליאה. ניתוח דו מימדי (2D) של נדידת תאים מדגים כי ההעברה הוא מונע על ידי היווצרות lamellipodia בחוד דרך הדור של אקטין פילמנט חבילות. לאחר מכן היווצרות הידבקויות מוקד בחוד, בשילוב עם actomyosin מונע הכחשה להתכווצות בקצה נגרר, כונני התא קדימה. 6 ההעברה סלולרית תלת מימדי (3D) כיום אינה מובנת היטב, אולם מחקרים אחרונים מדגימים כי ההעברה 3D הוא שונה במידה ניכרת מאשר שצויינו תיאר מנגנון בדו מימד, והוא ככל הנראה מונע על ידי מנגנונים alterative. לדוגמה, מחקרים שנעשו לאחרונה על ידי פיטרי ואח. הפגינו, בהתאם, את המאפיינים של ה-ECM תאים ב- 3D מטריצות באפשרותך לעבור בין lamellipodium לבין lobopodium מונע מנגנונים של הגירה. 7 כיוון נדידת תאים הוא מרכיב קריטי של הפצע ריפוי התגובה, דגמי תלת-ממד של נדידת תאים הם קריטיים להבנת תגובות פיזיולוגיות לגירויים שונים במהלך ריפוי הפצע. למרות בהתנהגות התא נודדים על משטחים 2D הוכח שפתרון של ההעברה ב- 3D מטריצות, ביותר במבחנה המודלים הנוכחיים של נדידת תאים במהלך תהליך, כולל assay מאפס, ומבוססת על ריפוי הפצע לנצל 2D טפט תרבויות. 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 יותר לאחרונה פיתח מבחני נעזרו מטריצה תלת-ממד, אך עדיין התרבות תאים חד שכבתי על גבי המטריצה, ובכך יגביל את היכולת באמת לסכם את אתמהא של הסביבה תא ויוו. 15

מטרת השיטה המתוארת כאן היא ללמוד נדידת תאים דגם תלת-ממד רלוונטי מבחינה פיזיולוגית, ולא על משטח דו-מימדית, על מנת להשיג הבנה עמידים יותר של תגובות ההעברה המשויך הגירויים יישומית. שיטה זו מאפשרת על ההערכה של נדידת תאים בתוך מטריצה קריש פיברין 3D בנוכחות גורמים להפעיל או לעכב מסלולים הקשורים עם נדידת תאים. מטריצה פיברין נבחרה עבור שיטה זו עקב הפעלת פיברין תפקיד קריטי בשלבים המוקדמים של ריפוי הפצע; פגיעה הבאים, קריש פיברין נוצר בתוך הפצע סביבות לבלום את אובדן הדם ומשמש לפיגום חדירה לתא ההתחלתי במהלך שיפוץ ותיקון רקמות. 2 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 . בנוסף, פיברין משמש קלינית כמו איטום כירורגי, ההרכב של אוטמים היתה קשורה נדידת תאים ו- ultimate ריפוי תוצאות. מחקר קודמות מאת קוקס ואח. חקר פיברובלסט הגירה עם קרישי פיברין מורכבת פיברין משתנות ובתמצית תרומבין לצורך מיטוב של פיברין. במחקרים אלה, נדידה של תאים מחוץ קרישי פיברין על גבי כלים פלסטיק הייתה לכמת. 20 . אנו מציגים שיטה המאפשרת על כימות של נדידה של תאים בתוך הסביבה פיברין תלת-ממד. בעוד השיטה המתוארת ב פרוטוקול זה באופן ספציפי משתמשת פיברין, מודל זה יכול בקלות להיות שונה להשתמש בחומרים אלטרנטיביים מטריקס כרצונכם, כגון קולגן או אחרים מטריצות תלת-ממד. בנוסף, אנו מציגים את השימוש פיברובלסט spheroids assay הזה כי ההעברה פיברובלסט. לתוך המיטה הפצע היא בעלת חשיבות עליונה סינתזה מטריצה חוץ-תאית, רקמות תיקון/שיפוץ. עם זאת, במהלך התיקון תהליך נויטרופילים הם סוג התא הראשון להעביר לתוך המיטה הפצע, ואחריו מקרופאגים. Fibroblasts אז מתחיל לחדור את הסביבה הפצע כ- 48 שעות לאחר הפגיעה, בתחילת השלב המקדימות תהליך ריפוי הפצע. 19 assay הזה יכול בקלות לשנות כדי לכלול נויטרופילים, מקרופאגים או סוגי תאים אחרים כדי להעריך כיצד שינויים במבנה קריש פיברין משפיעים על ההעברה אחד מסוגי התאים. 21

כדי ליישם את assay, ראשית, ספרואיד פיברובלסט נוצר באמצעות שינוי של טכניקות שתואר קודם לכן לתרבות תאי גזע. 22 ספרואיד פיברובלסט לאחר מכן מועבר לתוך מטריצה פיברין 3D ואז תוצר יכול להיות בקלות תחת פיקוח לכמת על פני מספר ימים. פרוטוקול זה לוקח בחשבון את מימד של מערכות פיזיולוגיות על-ידי הטבעת תא 3D spheroids בתוך מטריצה פיברין, וכך להימנע המגבלות ב רלוונטיות הביא על ידי באמצעות משטח צמיחה דו-מימדית טפט תא מודל להתנהגות הנדידה, בזמן מתן אפשרות להערכת בהתנהגות התא בסביבה מבוקרת מאוד במבחנה .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1-יום 1: תא והכנות ריאגנט

הערה: הכנה התא ואת ריאגנט יש לבצעו בבטיחות הביולוגי הקבינט למניעת זיהום של דגימות.

  1. חמים מסונן Dulbecco ' s נשר שונה ' s בינוני (DMEM), סרום שור עוברית (FBS),-גלוטמין ו פניצילין/סטרפטומיצין באמבט מים 37 ° C.
  2. הכן מדיה neonatal פיברובלסט עורי אנושי (HDFn) על ידי שכשהם חימם DMEM עם 10% FBS, 1% פניצילין/סטרפטומיצין, 1%-גלוטמין.
  3. להפשיר בקבוקון של מוקפאים HDFns ולא צנטריפוגה במשך 8 דקות ב- 200 גרם x כדי להסיר הקפאה קריוגנית בינוני. Resuspend תאים בתקשורת HDFn מוכן-צפיפות של עונה 1 פרק 10 6 תאים למ"ל ו זרע לתוך בקבוקון התרבות T-75.
  4. המקום את הבקבוק בתוך אינקובטור (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2) כדי לאפשר התפשטות תא.
  5. HDFn חנות המדיה ב- 4 מעלות צלזיוס
  6. להכין ריאגנטים pro - ו אנטי - migratory לפי הצורך.

2. יום 3: ספרואיד הכנה

  1. לבצע את הפעולות הבאות בברדס תרבות למניעת זיהום של דגימות.
  2. כאשר תאים להגיע 80% confluency, תשאף מדיה ולהוסיף 5 מ של 0.25% טריפסין-EDTA. חנות את הבקבוק בתוך חממה 37 ° C עבור 5 דקות להתנתק באופן מלא תאים מפני השטח את הבקבוק.
  3. הוסף 5 מ של מדיה ומחוממת הבקבוק כדי לנטרל את טריפסין.
  4. בשפופרת microcentrifuge, לערבב μL 10 של Trypan Blue μL 10 של התליה תא.
  5. צנטריפוגה ההשעיה תא המקורית במשך 8 דקות ב- 200 g. x
  6. בעוד הוא להיות centrifuged התליה תא, להוסיף 10 μL של התליה תא Trypan Blue hemocytometer ולבצע ספירת תא.
  7. בעקבות צנטריפוגה, תשאף מדיה ללא הם מוציאים בגדר התא. Resuspend בגדר תא-ריכוז של 1.25 x 10 5 תאים למ"ל.
  8. הוסף 5 מ ל תמיסת סטרילית פוספט buffered (PBS) לתחתית של 10 ס מ פטרי כדי לשמור על סביבה רטוב במהלך צמיחה ספרואיד.
  9. היפוך את מכסה צלחת פטרי. הוסף מספר טיפות μL 20 של התליה תא אל השטח הפנימי של מכסה פטרי.
  10. במהירות להפוך שוב את המכסה ומניחים אותו בתחתית של המנה, נזהר לא לנתק את הטיפות לתלייה. איור 1 מדגימה תלוי בהצלחה בנוי טיפות.
  11. בקפידה למקם את המנה חממה 37 ° C ולאפשר spheroids לגדול תלייה טיפה תרבות לתקופה של ה 72

3. יום 6: הטבעה Spheroids לתוך מטריצה תלת-ממד

  1. לבצע את הפעולות הבאות בברדס תרבות למניעת זיהום של דגימות.
  2. על היווצרות שכבת פיברין הראשון, ליצור פתרון קריש הדם של נפח מספיק כדי להוסיף 100 μL של קריש דם פתרון לכל טוב של בארות רבות ככל הנדרש (1 ספרואיד לאדם טוב). קרישי דם מורכבות של 10% 10 X HEPES מאגר נפח (250 מ מ HEPES, 1500 מ"מ. NaCl, CaCl 50 מ מ 2, pH 7.4), פיברינוגן האנושי 2 מ"ג/מ"ל ו 0.1 U/mL תרומבין אלפא אנושי. השארית של אמצעי האחסון קריש הדם מורכבת מים אלקטרופורזה.
    1. תרומבין הוספה אחרונה ובמהירות להוסיף פתרון וולס הרצוי לתוך צלחת 48-טוב כדי למנוע קרישי דם polymerizing לפני להתווסף וולס.
  3. בעדינות לנער/ברז צלחת טוב על מנת להבטיח כי תערובת קריש פיברין ציפוי כולו טוב, ולאחר מכן מקם טוב צלחת בחממה עבור h 1 כדי לאפשר התחתון קריש לשכבה פולימריזציה. אל תלחץ חזק מספיק לגרום היווצרות בועה; טוב צלחת פשוט רוק צלחת לפי הצורך עד מצופה מכלול של הבאר. אם נעשה שימוש אחסון קריש דם גדולים יותר, צעד זה לא יהיה נחוץ.
  4. העברת spheroids על שכבת פיברין.
    1. הסר הבאר צלחת הפטרי המכיל spheroids ב התליה ירידה תרבות מן החממה, לבחון spheroids תחת מיקרוסקופ. ואז למקם את המנה וחטף תרבות.
    2. להפוך בזהירות את מכסה הפטרי כדי לאפשר גישה כדי התליה שחרר תרבויות.
    3. בזהירות באמצעות מחט 21 G המצורפת מזרק 1 מ"ל, להעביר טיפה אחת מן המכסה הפוך לתוך המרכז של כל טוב, מקפיד לא לנקב את שכבת פיברין polymerized ציפוי בתחתית הבאר. להעביר ביעילות את המסירה, לאט לאט למשוך את הירידה לתוך המחט. תפסיק למשוך את הבוכנה בחזרה ברגע הירידה כולו נמצא בתוך המחט; מושך את הירידה בחזרה לכת עשוי להציג בועות אוויר, אשר יכול לשבש העברה ספרואיד יעיל או על יצירת תמונות עוקבות.
    4. לבחון את הצלחת היטב תחת מיקרוסקופ כדי להבטיח כי spheroids העבירו כראוי לתוך וולס הרצוי כל.
  5. להיווצרות שכבת פיברין השני, ליצור פתרון קריש דם אחר באמצעות הכנת אותו לעיל עבור יצירה של השכבה הראשונה פיברין (שלב 3.2). פיפטה 100 μL על גבי כל טיפה המכילות ספרואיד ובזהירות לבדוק תחת מיקרוסקופ שוב כדי לוודא spheroids עדיין לא נדחקו על הקצוות של הבארות.
  6. להחזיר את הצלחת היטב את החממה, לאפשר לשכבה השנייה פולימריזציה עבור ה 1

4. יום 6: תוספת של Pro-נודדים או גורמים מעכבים

  1. HDFn חמים למדיה-37 מעלות צלזיוס.
  2. לבצע את הפעולות הבאות בברדס למניעת זיהום.
  3. להכין מדיה עבור כל קבוצה כולל המתאים ריכוזי pro/אנטי-migratory סוכנים להערכה.
  4. הסר את לוחית טוב של חממה ומקום בשכונה תרבות.
  5. ΜL להוסיף 500 של מדיה סטנדרטי בכל טוב של קבוצת הביקורת ספרואיד μL 500 של מדיה מעכבות כל טוב של הקבוצה ספרואיד עכבות ההעברה, μL 500 של מדיה פרו-נודדת כל טוב של הקבוצה ספרואיד משופרת ההעברה.
  6. להחזיר את הצלחת היטב החממה.
  7. שינוי מדיה בכל ה 48

5. ימים 6-9: הערכה של נדידת תאים והתפשטות

spheroids
  1. התמונה באמצעות מיקרוסקופ brightfield מיד לאחר תוספת של תקשורת (0 h), ואז כל 24 שעות עבור ה 72 אופציונלי: בכל נקודה בזמן, לקחת תמונה z-מחסנית כדי לקבוע אם ההעברה מתרחש במישורים מחוץ לאזור הראשי של המוקד. מניסיוננו זה אינו מתרחש; עם זאת, זה שימושי להבטיח זה המקרה בבכל ניסוי.
  2. שימוש ImageJ כדי לקבוע תא תוצר כל היטב על-ידי ניתוח הגדלת אחוז באזור עבור כל ספרואיד על ידי מעקב גבול התא עבור כל ספרואיד בכל נקודה בזמן רצופים באמצעות " מידה " פונקציה כדי להשיג את האזור.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ספרואיד תרבות יכול להיות מנוצל כדי להעריך את ההשפעה של סוכנים pro אנטי הנדידה על ההעברה פיברובלסט במבחנה בהצלחה
Spheroids פיברובלסט 3D יכול להיווצר באמצעות תלוי תרבות טיפה על פני תקופה של 72 h (איור 1). בעקבות תקופת תרבות, spheroids מוטמעים בתוך המטריצה קריש דם, עם תמונה באמצעות מיקרוסקופ brightfield (איור 2). האזורים הראשונית של spheroids (מתואר באיור כמו האזורים ותחום על-ידי גבולות לבן) היו נחושים באמצעות ImageJ ומשמשת כנקודת התייחסות כדי לקבוע את מידת תא עוקבות תוצר של הגופים ספרואיד. מידות שטח ממוצע הראשוני עבור spheroids נקבעו להיות 4.3 x 104 μm2 ± 1.1 x 104 μm2 עבור spheroids שליטה, 4.4 x 104 μm2 ± 1.1 x 104 μm2 עבור נודדות-pro spheroids, 4.5 x 104 ± 7.7 x 103 μm2 עבור spheroids אנטי-הנדידה. המדיה המכילה גורמים פרו - או אנטי - migratory נוספה הקרישים המכילות ספרואיד, תוצר תא מהגוף ספרואיד הראשוני היה עם תמונה כל 24 שעות, עם סופי תמונות שצולמו 72 h אחרי התקשורת המקורית נוספה (איור 3).

עם סיום הניסוי, ספרואיד צמיחה לאורך זמן נותחו באמצעות ImageJ כדי לחשב את השינויים באזור ספרואיד עבור כל דגימה. כפי שמוצג באיור3, הקצה החיצוני של האשכול תא בכל נקודה בזמן שימש כדי לקבוע את מידת הזמן ספציפי תא תוצר. אנו מצפים כי המקומות out-of-להתמקד בתרשים 3 הם שאריות תאים, אנחנו. לא להחשיב את זה בכימות שלנו. תמונות בגודל מלא להראות גבול ברור, רציף תא העולה מן הגוף ספרואיד; . זה גבול זה זה נמצא במעקב כאשר קביעת תוצר... תא תוצר הייתה לכמת על ידי נרמול האזור תוצר תא יחסית באזור הגוף ספרואיד המקורי ב- t = 0 h ולאחר מכן לבטא את הצמיחה כאחוז באזור ספרואיד המקורי. כימות של תוצר התא על התקופה 72 h מגלה spheroids נחשף סוכן pro-נודדת התערוכה תואר ולעלייה משמעותית של הגירה, והגוף ספרואיד המקורי לעומת spheroids חשוף סוכן הגירה-מעכבות וכדי spheroids שליטה נחשפים סטנדרטיים מדיה (p < 0.0001, איור 4). לעומת זאת, spheroids נחשף סוכן אנטי-הנדידה הציג ירד משמעותית מעלות הגירה, והגוף ספרואיד המקורי בהשוואה לשלוט spheroids (p < 0.0001).

לשם השוואה, סיפקנו דוגמה assay מאפס (איור 5). Assay זה בוצע על ידי זריעה fibroblasts תאים/cm 500,0002 -24 באר-צלחות מצופה פיברינוגן 2 מ"ג/מ"ל. Fibroblasts הותר לגדל בן לילה. השטח טוב אז היתה שרוטה. עם טיפ פיפטה, נדידת תאים לתוך אזור האחסון הזמני צולמה מעל 24 שעות. כפי שמוצג להחליפן בתמונות שהוצגו איור 5א, קיימות מגבלות כדי assay הזה; שריטות אינם מאוד לשחזור, במקרים מסוימים, הגבולות לא ברור מפורטים. עם זאת, המגמות ההעברה הכוללת בנוכחות גורמים פרו - ו אנטי - migratory הם זהים לאלה נוכח וזמינותו ספרואיד תלת-ממד, למרות השונות הנ ל ואת ההבדלים מצבים של ההעברה. יצוין, כי מחירי העברה מהירים ב- 2D וזמינותו מאפס, בהשוואה וזמינותו ספרואיד תלת-ממד. הסגר המהירה בנוכחות הסוכן pro-הנדידה, כל דוגמאות תרבותי בנוכחות הסוכן pro-הנדידה נסגרו לחלוטין בתוך 24 שעות.

Figure 1
איור 1 : האדם fibroblasts עורי בתלייה טיפה תרבות. תאים נותרו בתלייה טיפה תרבות 72 h לזירוז ספרואיד היווצרות. העליון (A) עם נוף צדדי (B) של התליה טיפה תרבות מוצגים. (ג) מפרטים טכניים המתארים נוף צדדי היווצרות ספרואיד בטיפה לתלייה. הקו השחור מייצג את החלק העליון של הצלחת, לספרה ורוד מייצג את המדיה, ולייצג הכדורים הסגולים התאים בתוך ספרואיד. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2 : ספרואיד המראה לאחר ההטמעה הראשונית במטריצת פיברין (t = 0 h אחרי תוספת של מדיה) עם תמונה באמצעות מיקרוסקופ brightfield בהגדלה X 10- (א, ד) ספרואיד שליטה; (B, E) ספרואיד נחשף סוכן אנטי-הנדידה בתקשורת; (ג, F) ספרואיד נחשף סוכן pro-הנדידה בתקשורת. ללא (A-C) לבן והקווים זה של תמונות מוצגות עם (D-F) מצביעים על גבולות לקביעת אזור תוצר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3 : המראה ספרואיד לאחר 72 h עם תמונה באמצעות מיקרוסקופ brightfield בהגדלה X 10- (א, ד) ספרואיד שליטה; (B, E) ספרואיד נחשף סוכן אנטי-הנדידה בתקשורת; (ג, F) ספרואיד נחשף סוכן pro-הנדידה בתקשורת. ללא (A-C) לבן והקווים זה של תמונות מוצגות עם (D-F) מצביעים על גבולות לקביעת אזור תוצר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4 : צמיחה ספרואיד מעל 72 ה' סוכנים pro-הנדידה נודדת אנטי בתקשורת מוצגים כדי להשפיע באופן משמעותיפיברובלסט ההגירה והתפשטות בתוך סביבות תלת-ממד. N = 3/קבוצה; * מייצג p < 0.0001. קווי שגיאה מייצגים סטיות תקן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5 : השוואה עם תקן 2D assay מאפס. (א) להחליפן בתמונות של נדידת תאים ב- assay מאפס סטנדרטי מעל 24 שעות. Fibroblasts גדלו בתקשורת ממוזגים עם גורמים פרו - או אנטי - migratory, הבדלים הסגר מאפס היו לכמת לאורך זמן. (B) הסגר אחוז לאורך זמן fibroblasts גדל שליטה, pro-ציפורים נודדות, או מדיה אנטי הנדידה. למרות שיש הבדלים בין דרכי ההעברה נוכח זה וזמינותו 2D לעומת וזמינותו ספרואיד תלת-ממד, מגמות ההעברה הכוללת נשאר עקבי. N = 3/קבוצה; * מייצג p < 0.05. קווי שגיאה מייצגים סטיות תקן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פרוטוקול זה מאפשר הבחינה של נדידת תאים בריפוי הפצע הקשורים ECMs באמצעות מודל במבחנה תלת-ממד. צעד מכריע בביצוע תקין של ההליך הוא התפתחות נאותה של פיברובלסט spheroids; תא ריכוז במהלך ההכנה היה אופטימיזציה לתת של ריכוז הראשונית של תאים 2,500/שחרור, ומאפשר spheroids לטופס באופן אמין על תקופת דגירה של 72 h. אם מספר לא מספיק של תאים משמשים, spheroids ולא צבורים ביעילות, ייתכן נשברים ברגע להיות מועברים ומוטבעים לתוך שכבות פיברין. אם סוגי תאים שונים משמשים, הריכוז ההתחלתי תא ו/או ספרואיד הבשלה הזמן ייתכן יותאם על מנת לקבל צורה ספרואיד עקבית, יציב. עבור סוגי התאים להתרבות בקצב איטי יותר מאשר fibroblasts, ריכוז גבוה יותר תא הראשונית ייתכן שיהיה צורך להבטיח היווצרות ספרואיד נאותה בתוך טווח זמן של 72 שעות. התאים לא יישאר בבית תלייה טיפה תרבות יותר מאשר 72 h בשל חוסר היכולת לשנות את אמצעי התקשורת על spheroids בעוד בתרבות. הבדלים בגודל ספרואיד הראשונית צפויים עקב השתנות ביולוגי הגלום; אנו הכתובת ההשתנות החל ספרואיד היווצרות מספר עקבית של תאים כדי למזער את גודל ההבדלים ככל האפשר ועל ידי נרמול צמיחה לאורך זמן כדי לאפשר להשוואות נתונים.

האתגר העיקרי ליישום של שיטה זו הוא העברת spheroids של תלייה ולשחרר תרבות לתוך המטריקס קריש דם. פרוטוקול זה משתמש מחט מזרק לרוקן את ה-droplet המכילות ספרואיד מ המכסה הפוך פטרי, אך שיטות אחרות, כגון השימוש של פינצטה או של micropipettes קשורה טיפים החתוך, ויכול להיות מיושם גם להעביר ביעילות spheroids על הדמויות ירידה מטריקס. Spheroids יועבר באופן אמין על ידי משיכת הבוכנה של המזרק אחורה מעט לפני העברת ה-droplet, ועל -ידי הבטחת כי ה-droplet הוא נשאב המחט לאט כך בועות גז לא הציג לתוך ה-droplet. הבוכנה מזרק צריך רק להיות התרחקה מספיק כדי להביא את ה-droplet כולו לתוך המחט; מושך בחזרה כל עוד יותר גם להציג בועות ומשבשים את העברת אמין spheroids לתוך הבארות של צלחת היטב. תלוי מיוחדים ירידה תרבות צלחות עשוי לשמש גם כדי לפשט את התרבות ספרואיד, אבל הם פחות עלות יעיל אמצעי לעשות זאת מאשר פשוט באמצעות צלחת רגילה.

במהלך ריפוי ויווהפצע, fibroblasts זה לפלוש לאזור הפצע לייצר נרחב סרין פרוטאזות שתוצאתה פיברין מטריקס השפלה. תאים אלה לאחר מכן לסנתז חדש מטריצה חוץ-תאית, המורכב ברובו קולגן, לתיקון רקמות פגועות. 23 מנגנון ההעברה מאפשר פלישה מבוקרת, דבר לא נתפס על ידי השיטה שלנו ומייצג מגבלה של המערכת. יש גם לציין כי fibroblasts מנוצל בשיטה זו יפרישו פרוטאזות לאורך זמן לבזות את הרשת פיברין; לכן, אם לטווח ארוך (> 72 שעות) העברת מחקרים הם הרצויה, מעכבי פרוטאז, כגון aprotinin, אמור להתווסף למדיה התרבות תאים.

למרות מגבלות אלו, בשיטה זו מספק שיטה פשוטה, חסכונית, לשחזור שבו ללמוד 3D תא העברה במבחנה. בזמן מתן סביבה רלוונטיות יותר מבחינה פיזיולוגית מאשר מודלים 2D נפוץ, ניתוח צמיחה דגם התלת-ממד המתוארים בזאת שומרת על הניתוח ישר קדימה המסופקים על ידי מודלים דו-מימדית. Spheroids קל להמחיש באמצעות מיקרוסקופ brightfield או שלב פשוט, אם רצונך בכך, שיטה זו יכול בקלות לשנות עבור שימוש במיקרוסקופ זריחה fluorescently תיוג קרום התא, מטריקס חלבונים. פרוטוקול זה עשה שימוש neonatal fibroblasts עורי האדם בשל תפקידו של פיברובלסט ההעברה ב רקמות תיקון/שיפוץ. אם רצונך בכך, נויטרופילים, מקרופאגים, keratinocytes או סוגי תאים אחרים יכול לשמש assay הזה כדי להעריך כיצד שינויים במבנה קריש פיברין משפיעים על העברה של סוגי תאים אחרים המעורבים ריפוי הפצע. החומר 3D ניתן לשינוי לפי הצורך; בהתאם ליישום המבוקש, קולגן או חומרים אחרים מטריקס תלת-ממד עשוי לשמש במקום מטריצה פיברין על מנת לספק מודל רלוונטי מבחינה פיזיולוגית. מודל שימושי ללמוד סוגיות נדידת תאים בסביבה, כמו פצע יכולה להיות מושגת עם פרוטוקול זה באמצעות keratinocytes ואת קולגן יותר מאשר fibroblasts פיברין. בשיטות המתוארות גם מאפשרים גמישות רבה יותר וחסכון נדידת תאים, פצע ריפוי מחקרים תוך יישום מודל רלוונטי מבחינה פיזיולוגית במבחנה , במקום לדרוש עבודה מיידית אין ויוו בעקבות מחקרים קלאסי מימדי במבחנה .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

קרנות לעבודה זו סופקה באמצעות איגוד הלב האמריקני (16SDG29870005), מחקר אוניברסיטת מדינת צפון קרוליינה, חדשנות זרע מימון.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials
Dulbecco's Modified Eagle's Medium, 4.5 g/L Glucose, w/ Sodium Pyruvate, w/out L-Glutamine VWR VWRL0148-0500 DMEM already containing L-glutamine can also be used
100mm Tissue Culture Dish, Non-Treated, Sterilized, Non-Pyrogenic VWR 10861-594 Dishes of any size can be used for hanging drop culture 
Fetal Bovine Serum from USDA approved countries, heat inactivated, sterile-filtered, cell culture tested Sigma-Aldrich 12306C-500ML
L-glutamine Fisher Scientific ICN1680149 Not needed if using DMEM that already contains L-glutamine 
Penicillin-Streptomycin Solution stabilized, sterile-filtered, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL Sigma-Aldrich P4333-100ML
Human Dermal Fibroblasts, neonatal Thermo Fisher C0045C Can be replaced with other cell type of interest
21 G x 1 1/2' needle BD  305167 22 G x 1 1/2 needles will also work
1 mL syringe VWR 89174-491 Syringes of any volume can be used
Cell Culture Multiwell Plates, Polystyrene, Greiner Bio-One (Individially Wrapped) (48 wells) VWR 82051-004 
Human Fibrinogen - Plasminogen, von Willebrand Factor and Fibronectin Depleted Enzyme Research Laboratories FIB 3 Can be replaced with matrix protein of interest
Human Alpha Thrombin Enzyme Research Laboratories HT 1002a May not be necessary depending on matrix protein of interest
Equipment
BSL2 cell culture hood
Cell culture incubator
Inverted microscope with 10X objective
Centrifuge compatibile with 15 mL tubes

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chester, D., Brown, A. C. The role of biophysical properties of provisional matrix proteins in wound repair. Matrix Biol. , (2016).
  2. Martin, P., Leibovich, S. J. Inflammatory cells during wound repair: the good, the bad and the ugly. Trends in Cell Biology. 15 (11), 599-607 (2005).
  3. Lin, B., Yin, T., Wu, Y. I., Inoue, T., Levchenko, A. Interplay between chemotaxis and contact inhibition of locomotion determines exploratory cell migration. Nat Commun. 6, 6619 (2015).
  4. Ngalim, S. H., et al. Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy. J Vis Exp. (74), (2013).
  5. Charras, G., Sahai, E. Physical influences of the extracellular environment on cell migration. Nat Rev. Mol Cell Biol. 15 (12), 813-824 (2014).
  6. Petrie, R. J., Yamada, K. M. Fibroblasts Lead the Way: A Unified View of 3D Cell Motility. Trends Cell Biol. 25 (11), 666-674 (2015).
  7. Petrie, R. J., Gavara, N., Chadwick, R. S., Yamada, K. M. Nonpolarized signaling reveals two distinct modes of 3D cell migration. J Cell Biol. 197 (3), 439-455 (2012).
  8. Carlson, M. W., Dong, S., Garlick, J. A., Egles, C. Tissue-Engineered Models for the Study of Cutaneous Wound-Healing. Bioengineering Research of Chronic Wounds. , http://link.springer.com/chapter/10.1007/978-3-642-00534-3_12 263-280 (2009).
  9. Doyle, A. D., Wang, F. W., Matsumoto, K., Yamada, K. M. One-dimensional topography underlies three-dimensional fibrillar cell migration. J Cell Bio. 184 (4), 481-490 (2009).
  10. Fraley, S. I., et al. A distinctive role for focal adhesion proteins in three-dimensional cell motility. Nat Cell Biol. 12 (6), 598-604 (2010).
  11. Petrie, R. J., Doyle, A. D., Yamada, K. M. Random versus directionally persistent cell migration. Nat Rev. Mol Cell Biol. 10 (8), 538-549 (2009).
  12. Rommerswinkel, N., Niggemann, B., Keil, S., Zänker, K. S., Dittmar, T. Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix. J Vis Exp. (92), (2014).
  13. Jonkman, J. E. N., et al. An introduction to the wound healing assay using live-cell microscopy. Cell Adh Migr. 8 (5), 440-451 (2014).
  14. Lämmermann, T., et al. Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing. Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).
  15. Chen, Z., Yang, J., Wu, B., Tawil, B. A Novel Three-Dimensional Wound Healing Model. J Dev Biol. 2 (4), 198-209 (2014).
  16. Ross, R., Benditt, E. P. Wound healing and collagen formation. The J Cell Biol. 12 (3), 533-551 (1962).
  17. Sproul, E. P., Argraves, W. S. A cytokine axis regulates elastin formation and degradation. Matrix Biol. 32 (2), 86-94 (2013).
  18. Almine, J. F., Wise, S. G., Weiss, A. S. Elastin signaling in wound repair. Birth Defects REs C Embryo Today. 96 (3), 248-257 (2012).
  19. Tracy, L. E., Minasian, R. A., Caterson, E. J. Extracellular Matrix and Dermal Fibroblast Function in the Healing Wound. Adv Wound Care. 5 (3), 119-136 (2016).
  20. Cox, S., Cole, M., Tawil, B. Behavior of Human Dermal Fibroblasts in Three-Dimensional Fibrin Clots: Dependence on Fibrinogen and Thrombin Concentration. Tissue Eng. 10 (5-6), 942-954 (2004).
  21. Brown, A. C., Barker, T. H. Fibrin-based biomaterials: Modulation of macroscopic properties through rational design at the molecular level. Acta Biomaterialia. 10 (4), 1502-1514 (2014).
  22. Bartosh, T. J., Ylostalo, J. H. Preparation of anti-inflammatory mesenchymal stem/precursor cells (MSCs) through sphere formation using hanging drop culture technique. Curr Protoc Stem Cell Biol. 28, Unit-2B.6 (2014).
  23. Bainbridge, P. Wound healing and the role of fibroblasts. J Wound Care. 22 (8), 410-412 (2013).

Tags

בביו-הנדסה גיליון 126 נדידת תאים תלת-ממדי פיברין ריפוי פצעים מטריצה חוץ-תאית אינטגרינים ריפוי assay הפצע במבחנה
אפיון נדידת תאים בתוך תלת מימדי <em>במבחנה</em> פצע סביבות
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nandi, S., Brown, A. C.… More

Nandi, S., Brown, A. C. Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments. J. Vis. Exp. (126), e56099, doi:10.3791/56099 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter