환경 상처 3 차원 생체 외에서 내 셀 마이그레이션 특성화

이 절차의 전반적인 목적은 3차원 상처 관련 피브린 스캐폴드 내에서 세포 이동에 대해 관심 있는 특정 처리의 효과를 관찰하는 것입니다. 이 방법은 섬유 네트워크 구조의 변화가 상처 부위의 피브린 응고물로의 세포 이동에 어떻게 영향을 미치는지에 대한 상처 치유 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 3D 피브린 응고물 내의 세포 이동을 분석하기 위한 단순하고 재현 가능한 방법을 제공한다는 점입니다. 일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 사용자는 스페로이드를 옮기는 과정이 어려울 수 있어 고전할 수 있습니다.

먼저 냉동된 신생아 인간 피부 섬유아세포(neo-natal human dermal fibroblast) 바이알을 37 °C 항온수조에서 해동합니다. 세포가 막 해동되면 원심분리를 통해 세포를 회수하고, 펠렛을 새로운 신생아 인간 피부 섬유아세포 배지에 1 x 10⁶ cells/mL 농도로 재현탁합니다. 그 후, 세포를 T75 배양 플라스크에 접종하고 37 °C, 5% CO₂ 조건에서 72시간 동안 배양합니다.

배양이 80% 합류도(confluency)에 도달하면, 5 mL의 trypsin EDTA를 사용하여 세포를 떼어냅니다. 37°C에서 5분 후, 5 mL의 가온된 배지로 trypsin을 중화시키고, 40 µL의 세포를 trypan blue와 1:1 비율로 혼합합니다. 세포 계수를 위해 10 µL의 세포 분량을 따로 보관합니다.

원심분리를 통해 세포를 수집하고, 펠렛을 1.25 x 10⁵ cells/mL 농도로 재현탁합니다. 그다음, 10 cm 페트리 접시 바닥에 5 mL의 멸균 PBS를 분주합니다. 그런 다음 페트리 접시 뚜껑을 뒤집고 뚜껑의 안쪽 표면에 세포 현탁액을 20 µL씩 여러 방울 떨어뜨립니다.

모든 방울을 떨어뜨린 후, 매달린 방울들이 떨어지지 않도록 주의하며 덮개를 다시 접시 위에 덮고, 37 degree celsius 인큐베이터에 접시를 넣고 72시간 동안 배양합니다. 배양이 끝나면, 48-well 플레이트의 well당 스페로이드 하나당 100 microliters의 응고액을 첨가하고, 플레이트를 가볍게 흔들고 두드려 피브린 응고 혼합물이 well 전체를 덮도록 합니다. 플레이트를 인큐베이터에 넣고 1시간 동안 둡니다.

응고층이 중합되면 광학 현미경으로 현탁 배양(hanging drop culture) 내에 스페로이드가 형성되었는지 확인한 후, 48-웰 플레이트와 현탁 배양용 디쉬를 세포 배양 후드 내로 옮깁니다. 페트리 디쉬 뚜껑을 조심스럽게 뒤집어 현탁 배양된 방울에 접근하고, 21 gauge 바늘이 장착된 1 mL 시린지를 사용하여 각 피브린 코팅 웰에 한 방울씩 옮깁니다. 스페로이드를 흡입하고 분주할 때 각별히 주의해야 하는데, 이는 스페로이드를 파괴하지 않고 옮기는 것이 전체 과정에서 가장 어렵고 중요한 단계이기 때문입니다.

현미경으로 플레이트를 관찰하여 스페로이드가 적절한 웰에 제대로 분주되었는지 확인합니다. 신선하게 조제한 응고액 100 microliters를 각 스페로이드가 포함된 드롭 위에 조심스럽게 층을 이루도록 첨가하고, 현미경으로 스페로이드를 다시 관찰하여 여전히 온전한 상태로 각 웰의 중앙에 위치해 있는지 확인합니다. 그 다음 48-웰 플레이트를 인큐베이터로 옮겨 두 번째 피브린 층이 중합되도록 합니다.

1시간 후, 각 웰에 해당 실험 스페로이드 그룹에 적합한 배지 500 microliters를 처리하고 플레이트를 37 degree celsius 인큐베이터로 다시 옮깁니다. 24~72시간마다 명시야 현미경을 사용하여 스페로이드 이미지를 획득하며, z stack을 이용하여 3D 세포 배양의 연속적인 단면을 관찰합니다. 그런 다음, 적절한 이미지 분석 소프트웨어에서 각 시점마다 각 스페로이드의 세포 경계를 추적하고, 측정 기능을 사용하여 각 스페로이드의 면적 증가율을 산출합니다.

관심 대상인 전이 촉진 또는 억제제 내에서 배양한 후, 명시야 현미경 이미징을 통해 스페로이드의 초기 영역을 결정하고, 이를 각 연속적인 시점에서 스페로이드 본체로부터의 후속 세포 성장 정도를 결정하기 위한 기준점으로 사용할 수 있습니다. 이 대표 실험에서, 전이 촉진제에 노출된 스페로이드는 전이 억제제 또는 대조군 약제에 노출된 스페로이드와 비교하여 원래의 스페로이드 본체로부터 멀어지는 전이 정도가 유의하게 증가한 것으로 나타났습니다. 반대로, 전이 억제제에 노출된 스페로이드는 대조군 처리된 스페로이드와 비교하여 원래의 스페로이드 본체로부터 멀어지는 전이 정도가 유의하게 감소하였습니다.

이 기술을 숙달하면, 적절히 수행했을 때 세포 배양 시간을 제외하고 2시간 30분 만에 완료할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 3차원 인비트로(in vitro) 세포 이동 분석을 위해 세포 스페로이드를 배양하고 임베딩하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 절차 이후에 조직학적 분석 및 면역조직화학법과 같은 다른 방법들을 수행하여, 혈전 내의 피브린 네트워크 구조나 스페로이드 세포 내의 액틴 배열이 세포 이동의 증가 또는 감소와 어떻게 연관되는지에 대한 추가적인 의문점들을 해결할 수 있습니다.

세포 배양 및 바늘 작업은 매우 위험할 수 있으므로, 본 절차를 수행하는 동안에는 항상 적절한 보호 장구를 착용하고 무균 배양 후드 내에서 작업하는 등의 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오.