Name: 환경 상처 3 차원 생체 외에서 내 셀 마이그레이션 특성화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 10 s
Description: 배우세요 3D 피브린 매트릭스에서 세포 이동을 분석하는 방법을. 이 기법은 상처 치유 연구에서 섬유 네트워크 구조 변화가 세포 이동에 미치는 영향을 평가하는 재현 가능한 도구를 제공합니다.

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이 작품에 대 한 자금이 미국 심장 협회 (16SDG29870005)와 노스 캐롤라이나 주립 대학 연구 및 혁신 씨앗 자금 통해 제공 되었다.

1. 1 일: 셀 및 시 약 준비 참고: 모든 셀 및 시 약 준비 생물 안전 캐비닛 샘플의 오염을 방지 하기 위해 수행 되어야 합니다.
<ol><li>따뜻한 필터링 Dulbecco &#39; s 수정이 글 &#39; s 매체 (DMEM), 소 태아 혈 청 (FBS), L-글루타민, 고 37 ° C 물 욕조에 페니실린/스.</li>
	<li>보완 하 여 준비 신생아 인간 피부 섬유 아 세포 (HDFn) 미디어와 10 %FBS, 1% 페니실린/스, 1 %DMEM 따뜻하게 L-글루타민.</li>
	<li>녹여 냉동 HDFns 및 x 200g에 8 분 분리기 cryopreservation 매체를 제거 하는 유리병. 준비 HDFn 미디어 T-75 문화 플라스 크에 1 x 10 6 셀/mL과 씨앗의 밀도에 셀 resuspend.</li>
	<li>장소 플라스 크 (37 ° C, 5% CO 2) 세포 증식을 허용 하는 인큐베이터에서.</li>
	<li>저장소 HDFn 미디어 4 ° c.</li>
	<li>필요에 따라 프로 및 안티 migratory 시 약 준비.</li>
</ol> 2. 주 3: 회전 타원 체 준비 <ol><li>다음 샘플의 오염을 방지 하기 위해 문화 후드에서 수행.</li>
	<li>셀 도달 80 %confluency 미디어를 발음 하 고 0.25%의 5 mL을 추가 트립 신-EDTA. 완전 세포를 플라스 크 표면에서 분리 하려면 5 분 동안 37 ° C 배양 기에서 저장소 술병.</li>
	<li>중화는 트립 신을 플라스 크를 따뜻하게 미디어의 5 mL을 추가.</li>
	<li>Microcentrifuge 튜브 믹스 Trypan 파랑의 10 μ와 세포 현 탁 액의 10 μ.</li>
	<li>200 x g.에서 8 분에 대 한 원래의 세포 현 탁 액 분리기</li>
	<li>세포 현 탁 액은 centrifuged 되 고, 하는 동안는 hemocytometer를 Trypan 블루 셀 서 스 펜 션의 10 μ를 추가 하 고 셀 수 수행.</li>
	<li>원심 분리, 다음 셀 펠 릿을 dislodging 없는 미디어 발음. 1.25 x 10 5 셀/mL의 농도에서 세포 펠 릿 resuspend.</li>
	<li>10 cm 배양 접시 회전 타원 체 성장 하는 동안 수산화 유지 하기의 밑에 버퍼링 하는 멸 균 인산 염 (PBS)의 5 mL을 추가.</li>
	<li>반전 페 트리 접시의 뚜껑. Petri 접시 뚜껑의 안쪽 표면에 세포 현 탁 액의 몇 20 μ 방울을 추가.</li>
	<li>빨리 뚜껑을 다시 반전 하 고 다시 제자리에 걸려 방울을 꺼내 려 하지 않도록 주의 되 고, 접시의 바닥. 그림 1에서는 성공적으로 형성 된 거 방울.</li>
	<li>신중 하 게 37 ° C 배양 기에서 접시를 놓고 고 교수형에 성장 spheroids 72 h.의 기간에 대 한 문화를 드롭</li>
</ol> 3. 제 6 일: 3D 매트릭스로 Spheroids 포함 <ol><li>다음 샘플의 오염을 방지 하기 위해 문화 후드에서 수행.</li>
	<li>응고 솔루션으로 많은 우물 잘 당 100 μ를 추가할 충분 한 양의 응고 솔루션을 생성 하는 첫번째 섬유 소 층의 형성에 대 한 (우물 당 1 회전 타원 체) 필요 합니다. 혈전 10 X HEPES 버퍼는 10%의 볼륨 (250 mM HEPES, 1500 mM NaCl, 50mm CaCl 2, pH 7.4), 2 mg/mL 인간의 fibrinogen, 및 0.1 U/mL 인간의 알파 트 롬 빈에 의해 구성 되어 있습니다. 응고 볼륨의 나머지는 초순 구성.
	<ol><li>추가 트 롬 빈 마지막 하 고 신속 하 게 솔루션을 추가 48-잘 접시에 원하는 우물 우물에 추가 되 고 이전 polymerizing에서 혈전을 방지 하기 위해.</li>
	</ol></li> <li>부드럽게 흔들어/탭 섬유 소 혈전 혼합물 전체를 잘, 코팅은 되도록 잘 플레이트 그리고 유해를 응고 레이어 수 있도록 1 h에 대 한 보육에 잘 접시 장소. 잘 플레이트 충분히 거품 형성;을 유발 하드 흔들 하지 마십시오 우물의 전체 코팅까지 간단 하 게 필요한 만큼 접시 바위. 더 큰 응고 볼륨 사용 하는 경우이 단계가 필요 하지 않을지도.</li>
	<li>섬유 소 레이어 spheroids 전송.
	<ol><li>제거 잘 플레이트와 교수형에 spheroids를 포함 하는 페 트리 접시는 인큐베이터에서 문화를 삭제 하 고 spheroids 현미경 검사. 다음 문화 후드에 접시를 놓고.</li>
		<li>신중 하 게 액세스할 수 있도록 페 트리 접시의 뚜껑을 거꾸로 매달려 놓기 문화.</li>
		<li>신중 하 게 우물의 바닥 코팅 섬유 소 생산 층을 찔린 하지 않도록 주의 복용 각 잘 중심으로 거꾸로 뚜껑에서 한 방울을 전송 1 mL 주사기에 부착 된 21 G 바늘을 사용 하 여. 효과적으로 드롭 전송, 바늘에 드롭 천천히 당겨. 다시 마자 전체 드롭 니 들; 내부 플런저를 당겨 중지 후퇴는 드롭 너무 멀리 공기 방울, 효과적인 회전 타원 체 전송 또는 후속 이미징 중단 될 수 있습니다 발생할 수 있습니다.</li>
		<li>Spheroids는 모든 원하는 우물으로 옮겼다 제대로 되도록 현미경 잘 판 검사.</li>
	</ol></li> <li>두 번째 섬유 소 층의 형성에 대 한 첫 번째 섬유 소 레이어 (3.2 단계)의 창조에 대 한 위의 같은 준비를 사용 하 여 다른 응고 솔루션을 만듭니다. 신중 하 게 각 포함 하는 회전 타원 체 드롭에 100 μ 플라스틱 및 spheroids는 그대로 하 고 우물의 가장자리에 밀어 안 되도록 다시 현미경 검사.</li>
	<li>인큐베이터에 잘 접시를 반환 하 고 두 번째 레이어 1 헤에 대 한 유해를 허용합니다</li>
</ol> 4. 주 6: 추가 프로 철새 억제 요인 <ol><li>따뜻한 HDFn 미디어 37 ° c.</li>
	<li>오염을 방지 하기 위해 후드에서 다음 단계를 수행 하십시오.</li>
	<li>미디어 프로/안티 migratory 에이전트를 평가의 적절 한 농도 포함 하 여 각 그룹에 대 한 준비.</li>
	<li>인큐베이터와 문화 후드에 장소에서 잘 플레이트 제거.</li>
	<li>제어 회전 타원 체 그룹의 각 음을 표준 미디어의 추가 500 μ, 마이그레이션 저해 회전 타원 체 그룹의 각 음을 억제 미디어의 500 μ 및 마이그레이션 향상 된 회전 타원 체 그룹의 각 음에 프로 철새 미디어의 500 μ.</li>
	<li>인큐베이터에 잘 접시를 반환.</li>
	<li>변경 미디어 모든 48 헤</li>
</ol> 5. 6-9 일: 평가 셀 이동과 확산 미디어 (0 h)와 24 h에 다음의 추가 직후 72 h. 옵션에 대 한 명시 야 현미경을 사용 하 여 <ol><li>이미지 spheroids: 각 시간 지점에서 경우 확인 하려면 z-스택 이미지 걸릴 마이그레이션 영역 외부에 1 차 초점의 비행기에서 발생 됩니다. 우리의 경험에의 하면이 발생 하지 않습니다; 그러나, 이것은 모든 실험의 경우 되도록 유용 하다.</li>
	<li>사용 ImageJ 셀 파생물에 각 잘 각 연속 시간 시점에서 각 회전 타원 체의 셀 테두리를 추적 하 고 사용 하 여 각 회전 타원 체에 대 한 영역에 백분율 증가 분석 하 여 결정 하는 &#34; 측정 &#34; 영역을 구하는 함수.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

이 프로토콜에는 상처 치유에 세포 이동의 시험 체 외에 3D 모델을 통해 소프트웨어 관련에 대 한 수 있습니다. 프로시저의 적절 한 실행에 중요 한 단계는 섬유 spheroids;의 적절 한 개발 준비 하는 동안 셀 농도 2500 셀/드롭의 초기 농도 주고 최적화 되었다 72 h의 인큐베이션 기간 동안 안정적으로 양식 spheroids을 허용. 셀의 수가 부족 사용 하는 경우 spheroids 효과적으로 집계 하지 있습니다 하 고 전송 하 고 섬유 소 층에 포함 되 고 시 떨어져 휴식 수 있습니다. 다른 세포 유형 사용 하는 경우 초기 세포 농도 및 회전 타원 체 시간 숙성 일관 되 고 안정 된 회전 타원 체 형성을 얻기 위하여 조정 될 수 있을 수 있습니다. 섬유 아 세포 보다는 더 느리게 증식 하는 세포 유형에 대 한 훨씬 높은 초기 세포 농도 72 시간 시간 범위 내에서 적절 한 회전 타원 체 형성을 보장 하기 위해 필요할 수 있습니다. 셀 교수형에 남아 있지 해야 문화 문화에 spheroids에 미디어를 ...

상처 치유 하는 것은 부상 다음 조직의 무결성의 복원에 결과 복잡 한 과정 이다. 이 과정은 깨진 hemostasis, 염증, 확산 및 개장 하 고, 포함 하는 4 개의 겹치는 단계로 각 통제 되는 수용 성 신호, 세포-매트릭스 상호 작용 및 세포 세포 커뮤니케이션의 복잡 한 조합에 의해. 1 , 2 이러한 단서의 오케스트레이션 다양 한 상처 치유를 포함 하 여, 중요 한 것은, 셀 마이그레이션에 세포질 응답을 제어 합니다. 3 , 4 셀 이동 셀룰러 고기 그리고 기질 환경 생화학 및 생물 속성에 매우 역동적인 과정 이다. 5 셀 지속적으로 integrin 중재 경로;를 통해 그들의 기질 환경 조사 이 과정에는 다양 한 지형, 감 금, 강성, 등 행렬 속성을 셀 수 있습니다. 2 차원 (2D) 분석 세포 이동의 마이그레이션 lamellipodia 형성 걸 필 라 멘 트 번들의 세대를 통해 첨단에 의해 구동 됩니다 하는 방법을 보여 줍니다. 후행 가장자리에 수축과 수축 구동 actomyosin 함께에서 첨단에 초점 유착의 후속 대형 셀 앞으로 드라이브. 그러나 6 three-dimensional (3D) 셀룰러 이동은 현재 잘 이해 하지,, 최근 연구 결과 3D 마이그레이션이 보다 뚜렷이 보여는 afore 2d에서 메커니즘을 설명 하 고 가능성이 그렇지 메커니즘에 의해 구동 됩니다. 예를 들어, 피치 외최근 연구. 시연, ECM의 속성에 따라 셀 3D 행렬에 lamellipodium 및 lobopodium 마이그레이션 메커니즘을 구동 간에 전환할 수 있습니다. 7 셀 마이그레이션 응답을 치유 하는 상처의 중요 한 구성 요소 이므로 세포 이동의 3D 모델이 상처 치유 하는 동안 다양 한 자극에 생리 적인 응답을 이해 합니다. 상처 치유 과정, 잘 설립 스크래치 분석 결과 포함 하 여 동안 셀 이동의 최신 체 외에 모델 2D 활용 3D 매트릭스에서 마이그레이션에서 크게 다를 2D 표면에 셀 철새 동작 표시 되었습니다, 비록 단층 문화입니다. 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 더 최근 개발 분석 3 차원 매트릭스를 활용 하지만 여전히 따라서 진정으로 셀 환경 세를 정리 하는 능력을 제한 하는 매트릭스, 위에 단층 셀 문화 vivo에서. 15
여기에 설명 된 방법의 목적은 셀 마이그레이션 2D 표면이 아니라 순수 관련 3D 모델에 적용 된 자극과 관련 된 마이그레이션 응답의 더 강력한 이해를 얻기 위해 공부 하. 이 메서드는 셀 이동 활성화 하거나 연관 셀 마이그레이션 경로 억제 하는 요인의 3 차원 섬유 소 응고 매트릭스 내에서 평가 대 한 수 있습니다. 섬유 소 매트릭스 상처 치유;의 초기 단계에서 중요 한 역할 섬유 소 놀이 때문이 방법에 대 한 선정 다음 상해, 섬유 소 혈전 혈액 손실이 줄기 상처 환경에서 형성 되 고 조직 복구 및 리 모델링 하는 동안 초기 세포 침투에 대 한 비 계 역할. 2 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 또한, 섬유 소 임상 수술 실 란 트로 사용 하 고는 밀봉의 구성 세포 마이그레이션 및 궁극적인 결과 치유에 연결 되었습니다. 콕스 외이전 연구. 다양 한 섬유 소 및 섬유 소 실 란 트를 최적화 하기 위해 트 롬 빈 농도의 구성 하는 섬유 소 혈전과 섬유 마이그레이션을 조사. 이러한 연구에서 플라스틱 접시에 섬유 소 혈전에서 셀의 정량 했다. 20 여기 선물이 셀 3D 섬유 소 환경 내에서 이동의 정량화를 허용 하는 방법. 특히이 프로토콜에서 설명 하는 방법을 섬유 소를 사용 하는 동안이 모델은 원하는 대로, 교원 질 또는 다른 3D 매트릭스 같은 대안 매트릭스 재료를 사용 하 여 쉽게 수정할 수 있습니다. 또한, 선물이 구와 spheroids 사용 하 여가 분석이 결과에서 상처 침대로 구와 마이그레이션 기질 합성 및 조직 복구/리 모델링을 파라마운트 중요성 때문에. 그러나, 복구 하는 동안 프로세스 neutrophils 상처 침대, 대 식 세포에 의해 다음에 마이그레이션할 첫 번째 셀 유형입니다. 섬유 아 세포는 다음 상처 치유 과정의 증식 단계 시작 되는 시점에서 초기 부상 후 약 48 시간 상처 환경에 침투 하기 시작 합니다. 19 이 분석 결과 수 있을 쉽게 포함 하도록 수정 호 중구, 대 식 세포, 또는 다른 세포 유형 섬유 소 혈전 구조 변경 이러한 세포 유형의 마이그레이션에 미치는 영향을 평가 하기 위해. 21
이 분석 결과 구현 하려면 먼저, 섬유 회전 타원 체 형성 된다 줄기 세포 배양에 대 한 이전 설명의 수정을 사용 하 여. 22 섬유 회전 타원 체 이후 3D 섬유 소 매트릭스로 전송 되 고 파생물 수 다음 쉽게 모니터링 하 고 몇 일 동안 계량. 이 프로토콜은 계정에 생리 적 시스템의 3 차원 섬유 소 매트릭스 내에서 3D 셀 spheroids를 포함 하 여 따라서 세포 단층 모델 철새 행동을 함께 사용 하 여 2D 성장 표면에 의해 초래 하는 관련성에 한계를 피하, 동안 아직도 매우 제어 체 외에서 환경에서 셀 동작의 평가 대 한 허용.

<table><tbody><tr><td>Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium, 4.5 g/L 포도당, w/ 나트륨 Pyruvate, w/out L-글루타민</td><td>VWR</td><td>VWRL0148-0500</td><td>DMEM 이미 L-글루타민을 함유하고 있으며</td></tr><tr><td>100mm 조직 배양 접시, 비처리, 멸균, 비발열성</td><td>VWR</td><td>10861-594</td><td>어떤 크기의 접시도 드롭 문화를 걸 수 있습니다&nbsp;</td></tr><tr><td>USDA 승인 국가에서 온 태아 소 세럼, 열 비활성화, 멸균 필터링, 세포 배양 테스트 완료</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12306C-500ML</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>ICN1680149</td><td>이미 L-글루타민을 포함하고 있는 DMEM을 사용하는 경우에는 필요하지 않음;</td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신 용액 안정화, 멸균 필터링, 10,000 단위 페니실린과 10 mg 스트렙토마이신/mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333-100ML</td><td></td></tr><tr><td>인간 피부 섬유아세포, 신생아</td><td>Thermo Fisher</td><td>C0045C</td><td>관심 세포 유형으로 교체 가능</td></tr><tr><td>21 G x 1 1/2' 바늘</td><td>BD&nbsp;</td><td>305167</td><td>22 G x 1 1/2 바늘도 작동합니다</td></tr>. <tr><td>1 mL 주사기</td><td>VWR</td><td>89174-491</td><td>모든 용량의 주사기를 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>. 세포 배양 멀티웰 플레이트, 폴리스티렌, Greiner Bio-One (개별 포장) (48 웰)</td><td>VWR</td><td>82051-004&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Human Fibrinogen - Plasminogen, von Willebrand Factor and Fibronectin Depleted</td><td>Enzyme Research Laboratories</td><td>FIB 3</td> Could be <td>replaced with matrix protein of interest</td></tr><tr><td>Human Alpha Thrombin</td><td>Enzyme Research Laboratories</td><td>HT 1002a</td><td>의 매트릭스 단백질에 따라 필요하지 않을 수</td></tr> 있습니다<tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSL2 세포 배양 후드</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>세포 배양 인큐베이터</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10X 대물</td><td></td><td></td><td></td></tr>렌즈 원심분리기가 있는 도립 현미경 <tr><td>15mL 튜브</td><td></td><td></td><td></td>와 호환</tr></tbody></table> 가능

환경 상처 3 차원 생체 외에서 내 셀 마이그레이션 특성화

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

현재, 대부분 체 외에서 모델의 상처 치유, 잘 설립 스크래치 분석 실험 등, 공부 하는 2 차원 표면에 셀 마이그레이션 및 상처 폐쇄를 포함. 그러나,는 vivo에서 상처 치유 장소에에서 생리 적인 환경을 3 차원 보다는 2 차원 이다. 그것은 셀 동작에 크게 차이가 점점 더 분명 되 고 2 차원 3 차원 환경; 대 따라서, 더 순수 관련 생체 외에서 상처 폐쇄에 셀 마이그레이션 동작을 공부에 대 한 모델에 대 한 필요가 있다. 여기 설명 하는 방법을 더 나은 이전 설립된 2 차원 스크래치 분석 실험 보다 생리 상태를 반영 하는 3 차원 모델에서 셀 이동의 연구에 대 한 수 있습니다. 이 모델의 목적은 셀 프로 또는 안티 migratory 요인 존재 섬유 소 매트릭스 내에 포함 된 회전 타원 체 몸에서 셀 이동의 시험을 통해 결과 평가 하는 것입니다. 이 메서드를 사용 하 여 3 차원 매트릭스에서 회전 타원 체 몸에서 세포 파생물 관찰 될 수 있다 고 명시 야 현미경 검사 법 및 회전 타원 체 본문 영역의 분석을 통해 시간이 지남에 쉽게 정량은. 셀 마이그레이션에 프로 철새 및 억제 요인의 효과 또한이 시스템에 평가할 수 있습니다. 연구원 관련 3 차원 상처 행렬에서 체 외에서세포 마이그레이션 분석의 간단한 방법을 제공 합니다, 그리고 에 체 외 의 관련성 증가 셀 학문 vivo에서 동물의 사용 하기 전에 모델입니다.

회전 타원 체 문화 구와 마이그레이션 체 외에 프로 및 안티 철새 에이전트의 효과 평가에 이용 될 수 있다 3D 구와 spheroids 72 h (그림 1)의 기간에 걸려 드롭 문화를 통해 형성 될 수 있습니다. 문화 기간에 따라 spheroids 응고 매트릭스에 포함 하 고 명시 야 현미경 검사 법 (그림 2)를 사용 하 여 몇 군데. Spheroids (흰색 테두리에 묶여 지역으로는 그림에 표시 된)의 초기 영역 ImageJ를 사용 하 여 결정 되었고, 회전 타원 체 시체에서 후속 셀 파생물의 정도 결정 하는 기준점으로 사용. spheroids에 대 한 초기 평균 지역 측정 104 μ m2 ± 1.1 x 104 μ m2 에 대 한 제어 spheroi...

이 프로토콜의 목표 3 차원 섬유 소 매트릭스 내에서 셀 마이그레이션에 프로 및 안티 migratory 요인의 효과 평가 하는 것입니다.

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on ...

이 절차의 전반적인 목적은 3차원 상처 관련 피브린 스캐폴드 내에서 세포 이동에 대해 관심 있는 특정 처리의 효과를 관찰하는 것입니다. 이 방법은 섬유 네트워크 구조의 변화가 상처 부위의 피브린 응고물로의 세포 이동에 어떻게 영향을 미치는지에 대한 상처 치유 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 3D 피브린 응고물 내의 세포 이동을 분석하기 위한 단순하고 재현 가능한 방법을 제공한다는 점입니다. 일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 사용자는 스페로이드를 옮기는 과정이 어려울 수 있어 고전할 수 있습니다.먼저 냉동된 신생아 인간 피부 섬유아세포(neo-natal human dermal fibroblast) 바이알을 37 °C 항온수조에서 해동합니다. 세포가 막 해동되면 원심분리를 통해 세포를 회수하고, 펠렛을 새로운 신생아 인간 피부 섬유아세포 배지에 1 x 10⁶ cells/mL 농도로 재현탁합니다. 그 후, 세포를 T75 배양 플라스크에 접종하고 37 °C, 5% CO₂ 조건에서 72시간 동안 배양합니다.배양이 80% 합류도(confluency)에 도달하면, 5 mL의 trypsin EDTA를 사용하여 세포를 떼어냅니다. 37°C에서 5분 후, 5 mL의 가온된 배지로 trypsin을 중화시키고, 40 µL의 세포를 trypan blue와 1:1 비율로 혼합합니다. 세포 계수를 위해 10 µL의 세포 분량을 따로 보관합니다.원심분리를 통해 세포를 수집하고, 펠렛을 1.25 x 10⁵ cells/mL 농도로 재현탁합니다. 그다음, 10 cm 페트리 접시 바닥에 5 mL의 멸균 PBS를 분주합니다. 그런 다음 페트리 접시 뚜껑을 뒤집고 뚜껑의 안쪽 표면에 세포 현탁액을 20 µL씩 여러 방울 떨어뜨립니다.모든 방울을 떨어뜨린 후, 매달린 방울들이 떨어지지 않도록 주의하며 덮개를 다시 접시 위에 덮고, 37 degree celsius 인큐베이터에 접시를 넣고 72시간 동안 배양합니다. 배양이 끝나면, 48-well 플레이트의 well당 스페로이드 하나당 100 microliters의 응고액을 첨가하고, 플레이트를 가볍게 흔들고 두드려 피브린 응고 혼합물이 well 전체를 덮도록 합니다. 플레이트를 인큐베이터에 넣고 1시간 동안 둡니다.응고층이 중합되면 광학 현미경으로 현탁 배양(hanging drop culture) 내에 스페로이드가 형성되었는지 확인한 후, 48-웰 플레이트와 현탁 배양용 디쉬를 세포 배양 후드 내로 옮깁니다. 페트리 디쉬 뚜껑을 조심스럽게 뒤집어 현탁 배양된 방울에 접근하고, 21 gauge 바늘이 장착된 1 mL 시린지를 사용하여 각 피브린 코팅 웰에 한 방울씩 옮깁니다. 스페로이드를 흡입하고 분주할 때 각별히 주의해야 하는데, 이는 스페로이드를 파괴하지 않고 옮기는 것이 전체 과정에서 가장 어렵고 중요한 단계이기 때문입니다.현미경으로 플레이트를 관찰하여 스페로이드가 적절한 웰에 제대로 분주되었는지 확인합니다. 신선하게 조제한 응고액 100 microliters를 각 스페로이드가 포함된 드롭 위에 조심스럽게 층을 이루도록 첨가하고, 현미경으로 스페로이드를 다시 관찰하여 여전히 온전한 상태로 각 웰의 중앙에 위치해 있는지 확인합니다. 그 다음 48-웰 플레이트를 인큐베이터로 옮겨 두 번째 피브린 층이 중합되도록 합니다.1시간 후, 각 웰에 해당 실험 스페로이드 그룹에 적합한 배지 500 microliters를 처리하고 플레이트를 37 degree celsius 인큐베이터로 다시 옮깁니다. 24~72시간마다 명시야 현미경을 사용하여 스페로이드 이미지를 획득하며, z stack을 이용하여 3D 세포 배양의 연속적인 단면을 관찰합니다. 그런 다음, 적절한 이미지 분석 소프트웨어에서 각 시점마다 각 스페로이드의 세포 경계를 추적하고, 측정 기능을 사용하여 각 스페로이드의 면적 증가율을 산출합니다.관심 대상인 전이 촉진 또는 억제제 내에서 배양한 후, 명시야 현미경 이미징을 통해 스페로이드의 초기 영역을 결정하고, 이를 각 연속적인 시점에서 스페로이드 본체로부터의 후속 세포 성장 정도를 결정하기 위한 기준점으로 사용할 수 있습니다. 이 대표 실험에서, 전이 촉진제에 노출된 스페로이드는 전이 억제제 또는 대조군 약제에 노출된 스페로이드와 비교하여 원래의 스페로이드 본체로부터 멀어지는 전이 정도가 유의하게 증가한 것으로 나타났습니다. 반대로, 전이 억제제에 노출된 스페로이드는 대조군 처리된 스페로이드와 비교하여 원래의 스페로이드 본체로부터 멀어지는 전이 정도가 유의하게 감소하였습니다.이 기술을 숙달하면, 적절히 수행했을 때 세포 배양 시간을 제외하고 2시간 30분 만에 완료할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 3차원 인비트로(in vitro) 세포 이동 분석을 위해 세포 스페로이드를 배양하고 임베딩하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 절차 이후에 조직학적 분석 및 면역조직화학법과 같은 다른 방법들을 수행하여, 혈전 내의 피브린 네트워크 구조나 스페로이드 세포 내의 액틴 배열이 세포 이동의 증가 또는 감소와 어떻게 연관되는지에 대한 추가적인 의문점들을 해결할 수 있습니다.세포 배양 및 바늘 작업은 매우 위험할 수 있으므로, 본 절차를 수행하는 동안에는 항상 적절한 보호 장구를 착용하고 무균 배양 후드 내에서 작업하는 등의 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오.

characterizing-cell-migration-within-three-dimensional-vitro-wound

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

이 문서는 찬란 추가 수정 및 3D 세포 배양의 라이브 영상 모두에 사용할 수 있습니다 콜라겐 레이블을하는 방법을 제시한다. 우리는 또한 3D 환경에서 배양 세포의 내생 세포 골격 단백질을 시각화하기 위해 최적화 된 프로토콜을 제공합니다.

3D로 침윤성 암 세포의 세포 골격 조직을 공개

일반적으로 사용되는 체외에서 세포의 이동 및 침윤을 조사하기위한 고도의 접근 방법이 설명되어 있습니다. 첫 번째 방법은 세포 운동성을 측정하는 세포 상처 폐쇄 분석이다. 두 번째 방법은 화성과 세포의 침략적인 능력을 평가하는 트랜스 웰 마이그레이션 및 침입 분석이다.

체외 세포 이동 및 내습 분석 실험에서

이 문서는 유방암 세포의 침입을 정량화하는 3 차원 (3D) 분석의 사용에 대한 자세한 방법을 제공합니다. 특히, 우리는 세포가 침입 할 때 발생하는 멤브레인 무결성의 손실을 검사하는 등의 분석을 설정하는 데 필요한 절차, 정량화 및 데이터 분석뿐만 아니라 방법에 대해 설명합니다.

3 차원 (3D) 모델을 사용하여 유방암 세포 침윤의 정량화

세포 이동은 암과 같은 상처 치료 및 면역 반응 및 병태 생리 학적 과정으로, 생리의 과다에 관여하는 생물학적 현상이다. 3D-콜라겐 매트릭스 마이그레이션 분석은 3 차원 형상의 생리적 환경 내에서 다른 세포 유형의 이동성 특성을 분석하는 다용도 공구이다.

세 가지 차원 콜라겐 매트릭스 내에서 세포의 이동 분석

기계적 특성 및 세포 외 매트릭스의 미세 강하게 세포의 3 차원 이동에 영향을 미칩니다. 시험 관내 방법은 개별 세포 집단 수준에서 모두 biophysically 변수 환경에서 시공간 세포 이동 동작을 연구하기 위해, 설명한다.

동심 젤 시스템은 3 차원 세포의 이동에 매트릭스 미세 환경의 생물 물리학 역할을 연구하는

이 연구 보고서의 세포 침입과 마이그레이션 분석에 대 한 두 가지 방법: Boyden 챔버 분석 결과 및 체 외에서 비디오 현미경-기반 상처 치유 분석 결과. 이 두 실험에 대 한 프로토콜 설명, 그리고 그들의 장점과 단점 비교 됩니다.

셀 침공 및 마이그레이션 프로세스의 평가: 비디오 현미경-기반 스크래치의 비교 분석 결과 및 Boyden 챔버 분석 결과 상처

이 프로토콜 셀 셀 microenvironment를 유지 하면서 3 차원 설정의 마이그레이션 및 침입 기능을 계량 하는 데 사용할 수 있는 반전된 세로 침공 분석 결과를 설명 합니다. 이 분석 결과 희소 한 또는 민감한 세포에 적합 합니다.

위쪽으로 이동: 간단 하 고 유연한 생체 외에서 3 차원 침공 분석 실험 프로토콜

이 원고 방법 절 개 같은 병 변 배양된 상피 세포 monolayers에 편리 하 게 모델 치료 생체 외에서이미징 confocal 의해 상처 또는 레이저 스캔 현미경, 고는 높은 품질을 제공할 수 있습니다. 공부 셀 동작 및 마이그레이션에 관련 된 메커니즘에 대 한 양적 및 질적 데이터입니다.

현미경 기반 방법을 생체 외에서 상처 치유 중 상피 세포 이동의 평가 대 한

여기, 선물이 기관지 상피 세포의 마이그레이션에 펩 티 드의 효과 평가 하는 프로토콜. 이 메서드는 셀 마이그레이션 및 상처 폐쇄의 속도에 양적 데이터의 신속 하 고 재현성 높은 획득에 대 한 수 있습니다.

상처 치유 분석 결과 셀 마이그레이션 평가 하는 새로운 체 외에

본 논문은 생체 내에서 고해상도로 상처 치유를 위해 살아있는 Clytia hemisphaerica medusa의 상피에 상처를 만드는 방법을 설명 한다. 또한, 상처 치유 동안 상피 세포 및 세포 외 기질의 신호 전달 과정을 교란시키기 위해 염료 및 약물을 도입하는 기술이 제시됩니다.

Cnidarian 모델 유기체 Clytia hemisphaerica를 사용한 생체 내 상피 상처 치유 특성화

과립 하이드로겔 내부 및 계면으로의 3D 세포 이동에 대한 정량적 평가를 위한 프로토콜이 여기에 제시되어 있습니다.

Quantifying three-dimensional cell migration within and into granulular hydrogel biomaterials(과립 하이드로겔 생체 물질로의 3차원 세포 이동 정량화)

배우세요 3D 피브린 매트릭스에서 세포 이동을 분석하는 방법을. 이 기법은 상처 치유 연구에서 섬유 네트워크 구조 변화가 세포 이동에 미치는 영향을 평가하는 재현 가능한 도구를 제공합니다.

환경 상처 3 차원 생체 외에서 내 셀 마이그레이션 특성화

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