환경 상처 3 차원 생체 외에서 내 셀 마이그레이션 특성화

이 절차의 전반적인 목표는 3차원 상처 관련 섬유소 골격에서 세포 이동에 대한 관심 있는 특정 처리의 효과를 관찰하는 것입니다. 이 방법은 섬유 네트워크 구조의 변화가 세포 이동 및 상처 부위의 피브린 응고에 미치는 영향에 대한 상처 치유 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있으며, 이 기술의 주요 장점은 피브린 혈전 내 세포 이동을 3D로 분석하기 위한 간단하고 재현 가능한 방법을 제공한다는 것입니다. 일반적으로 이 방법을 처음 사용하는 개인은 스페로이드를 이식하는 것이 어려울 수 있기 때문에 어려움을 겪을 것입니다.

섭씨 37도의 수조에서 얼어붙은 신생아 인간 피부 섬유아세포 바이알을 데우는 것으로 시작합니다. 세포가 막 해동되면 원심분리로 세포를 수집하고 펠릿을 1 x 10에서 밀리리터당 6번째 세포 농도로 새로운 신생아 인간 피부 섬유아세포 배지에 다시 현탁시킵니다. 그런 다음 T75 배양 플라스크에 세포를 파종하여 섭씨 37도에서 72시간 배양하고 이산화탄소를 5%씩 배양합니다.

배양액이 80% 포화도에 도달하면 5ml의 트립신 EDTA로 세포를 분리합니다. 섭씨 37도에서 5분 후 5ml의 가온 배지로 트립신을 중화하고 40마이크로리터의 세포와 트리판 블루를 1:1 비율로 혼합합니다. 계수를 위해 10마이크로리터의 세포 분취량을 예약합니다.

원심분리로 세포를 수집하고 펠릿을 1.25 x 10에서 밀리리터당 5번째 세포 농도로 다시 현탁시킵니다. 다음으로, 10cm 페트리 접시 바닥에 5ml의 멸균 PBS를 도금합니다. 그런 다음 페트리 접시 뚜껑을 뒤집고 뚜껑 내부 표면에 세포 현탁액을 20마이크로리터 방울 여러 방울 떨어뜨립니다.

모든 방울을 놓았으면 매달려 있는 방울이 빠지지 않도록 주의하면서 접시 뚜껑을 접시에 다시 뒤집고 접시를 섭씨 37도의 인큐베이터에 72시간 동안 부드럽게 넣습니다. 배양이 끝나면 웰당 스페로이드당 100마이크로리터의 응고 용액을 48웰 플레이트에 추가하고 플레이트를 부드럽게 흔들고 두드려 피브린 응고 혼합물이 웰 전체를 코팅하도록 합니다. 플레이트를 인큐베이터에 1시간 동안 놓습니다.

응고층이 중합되면 광학 현미경으로 행잉 드롭 배양액에 스페로이드의 존재 여부를 확인하고 48웰 플레이트와 행잉 드롭 배양 접시를 세포 배양 후드로 옮깁니다. 페트리 접시 뚜껑을 조심스럽게 뒤집어 매달린 방울 배양물에 접근하고 21게이지 바늘이 장착된 1ml 주사기를 사용하여 코팅된 각 피브린 웰에 한 방울씩 전달합니다. 저는 스페로이드를 흡인하고 도금할 때 가장 어렵고 중요한 단계는 스페로이드를 파괴하지 않고 옮기는 것이기 때문에 각별한 주의를 기울입니다.

현미경으로 플레이트를 검사하여 스페로이드가 적절한 웰에 적절하게 파종되었는지 확인합니다. 방울이 들어 있는 각 스페로이드에 갓 준비한 응고 용액 100마이크로리터를 부드럽게 층을 이루고 현미경으로 스페로이드를 다시 검사하여 스페로이드가 여전히 손상되지 않고 각 웰의 중앙에 있는지 확인합니다. 그런 다음 48웰 플레이트를 인큐베이터로 되돌려 피브린의 두 번째 층이 중합될 수 있도록 합니다.

1시간 후, 해당 실험용 스페로이드 그룹에 적합한 배지 500마이크로리터로 각 웰을 처리하고 플레이트를 섭씨 37도의 인큐베이터로 되돌립니다. 24-72시간마다 명시야 현미경으로 스페로이드의 이미지를 획득하고, z 스택을 사용하여 3D 세포 배양의 연속적인 단면을 볼 수 있습니다. 그런 다음 적절한 이미지 분석 소프트웨어에서 각 연속 시점에서 각 스페로이드의 세포 경계를 추적하고 측정 기능을 사용하여 각 스페로이드의 면적 증가율에 액세스합니다.

배양에 따라, 관심 물질인 프로 또는 반(反)이주 제제에서, 스페로이드의 초기 영역은 명시야 현미경 이미징에 의해 결정될 수 있으며, 각 연속적인 시점에서 스페로이드체로부터 후속 세포 성장의 정도를 결정하기 위한 참조로 사용될 수 있습니다. 이 대표적인 실험에서, 친이주 제제에 노출된 스페로이드는 이동 억제제 또는 대조 제제에 노출된 스페로이드에 비해 원래 스페로이드체에서 멀어지는 이동 정도가 현저히 증가한 것으로 나타났습니다. 반대로, 항이동제에 노출된 스페로이드는 대조군 처리된 스페로이드에 비해 원래 스페로이드체에서 멀어지는 이동 정도가 현저히 감소했습니다.

이 기술을 숙달하면 적절하게 수행되면 세포 배양 시간을 제외하고 2시간 30분 안에 완료할 수 있습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 3차원 체외 세포 이동 분석을 위해 세포 스페로이드를 배양하고 삽입하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 절차에 따라 조직학 및 면역조직화학과 같은 다른 방법을 수행하여 응고 내의 피브린 네트워크 구조 또는 스페로이드 세포의 액틴 정렬이 세포 이동의 증가 또는 감소에 어떻게 대응하는지에 대한 추가 질문에 답할 수 있습니다.

세포 배양 및 바늘로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 항상 적절한 보호 장비를 착용하고 멸균 배양 후드에서 작업하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.