Summary
Vi demonstrere en snap chip teknologi til at udføre Cross-Country-reactivity-fri multipleksede sandwich immunassays ved blot snapping to dias. En snap apparatet bruges til at pålideligt overføre reagenser fra microarray til microarray. Snap chip kan bruges til enhver biokemiske reaktioner, der kræver colocalization af forskellige reagenser uden kontaminering.
Abstract
Multiplex proteinanalyse har vist superior diagnostiske følsomhed og nøjagtighed i forhold til enkelt proteiner. Antistof microarrays mulighed for tusindvis af mikro-skala immunassays udføres samtidigt på en enkelt chip. Sandwich assay format forbedrer assay specificitet ved at opdage hver målet med to antistoffer, men lider af krydsreaktivitet mellem reagenser, hvilket begrænser deres multiplexing kapaciteter. Antistof colocalization microarray (ACM) er blevet udviklet til Cross-Country-reactivity-fri multipleksede protein påvisning, men kræver et dyrt spotter på stedet for microarray fabrikation under assays. I dette arbejde udviser vi en snap chip-teknologi, som overfører reagens fra microarray til microarray af blot snapping to chips sammen, således ingen spotter kræves under prøven inkubation og efterfølgende anvendelse af påvisning antistoffer (klatter) på opbevaring af pre plettede dias, skaber dias forberedelse fra assay udførelse. Både enkelt og dobbelt overførselsmetoder præsenteres for at opnå præcise tilpasning mellem de to microarrays og dias fabrikation for begge metoder er beskrevet. Resultaterne viser, at < 40 μm justering er opnået med dobbelt overførsel, at nå en array tæthed af 625 steder/cm2. En 50-plexed immunoassay har gennemført for at påvise anvendeligheden af snap chip i multipleksede proteinanalyse. Grænserne for påvisning af 35 proteiner er i den vifte af pg/mL.
Introduction
Et panel af biomarkører bestående af flere proteiner kan give højere følsomhed og specificitet end en enkelt biomarkør i diagnosticering af komplekse sygdomme såsom kræft1,2. Enzym-forbundet immunosorbent assay (ELISA) har været guldstandarden teknologi anvendes i kliniske laboratorier at nå en grænse på opdagelse på lav pg/mL i plasma, men grænser for ét mål pr. assay3,4,5. Antistof microarrays er blevet udviklet for imødekommende tusindvis af miniaturized assays gennemført parallelt på en enkelt mikroskop dias6,7,8. Men den multiplexing kapacitet af denne metode er begrænset af reagens-drevet krydsreaktivitet, der følger af anvendelsen af en blanding af ising, og bliver det mere problematisk med et stigende antal mål9,10 , 11. Pla mfl. har erklæret, at den resulterende sårbarhed af en multiplex sandwich assay skalaer som 4N(N-1), hvor N er antallet af mål12.
For at afbøde krydsreaktivitet i antistof microarrays, antistof colocalization microarray er (ACM) blevet udviklet i vores laboratorium for multiplex sandwich assay12. Capture antistoffer (førerhuse) er spottet på et underlag med et microarray spotter. Efter blokering prøver på overfladen, og derefter individuelle klatter er plettet på de samme steder med cAb-antigen kompleks. Alle krydsreaktivitet scenarier mellem antistoffer og antigener kan afbødes med ACM, og påvisningsgrænser ved pg/mL er blevet nået. Men assay protokollen kræver forberedelse og spotting klatterne under eksperimenter ved hjælp af en on-site microarray spotter med høj præcision for justering formål, som er dyrt og tidskrævende, begrænse den brede anvendelse af denne teknologi i andre laboratorier. En håndholdt ACM, opkaldt snap chip er blevet udviklet Cross-Country-reactivity-fri og spotter-fri multiplex sandwich immunassays13,14,15. cAbs og klatter er pre spottet på en analyse og en overførsel dias henholdsvis i microarray format og gemt. Under analysen, dias er hentet og et microarray af klatter overføres kollektivt diaset assay som blot snapping de to chips sammen. En snap apparatet bruges til pålidelige reagens overførsel. Nitrocellulose belagt dias med en relativt stor antistof bindende kapacitet har været brugt som assay dias til at absorbere flydende dråber og dermed fremme reagens overførsel, imidlertid diasene er dyrere end almindelige glas lysbilleder og microarray scannere kompatibel med uigennemsigtige dias er nødvendige for signal erhvervelse.
I dette arbejde viser vi udfører en multiplex sandwich immunassay med en snap chip-protokollen. En roman snap apparater er blevet udviklet for mere praktisk og pålidelig reagens overførsel fra microarray til microarray. Vigtigere, har her vi etableret reagens overførselsmetode på regelmæssig glas dias med snap chip. 1024 steder blev overført og tilpasset til et glas dias, væsentlig udvidelse af brugen af denne teknologi i de fleste laboratorier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. fabrikation og opbevaring af snap chips
- enkelt overførselsmetode ( figur 1a)
- Spot cAb opløsninger indeholdende 400 µg/mL antistoffer og 20% glycerol i fosfatbufferet saltopløsning (PBS) på en nitrocellulose (eller en functionalized glas) assay dias med en inkjet microarray spotter 13 ved en relativ luftfugtighed på 60% (1,2 nL for hver plet) med 800 µm center til center afstand. Sørg for, at diasset er fast på spotter dækket efter et hjørne (her, i nederste venstre hjørne blev brugt).
- Ruger plettede assay dias ved stuetemperatur i 1 time med en relativ luftfugtighed på 60%.
- Klemme en slide modul pakning med 16 rum på diasset assay at opdele det i 16 brønde. Skyl diaset tre gange ved at tilføje 80 µL af PBS, som indeholder 0,1% Tween-20 (PBST) i hver godt, og ryster på 450 rpm på en shaker, 5 min hver time.
- Tilføje 80 µL blokerende løsninger til hver godt og omrystes i 1 h på 450 rpm.
- Fjerne pakningen og tørre diasset assay med en strøm af nitrogen.
- Lave en overførsel dias på spotter dæk og skubbe den nederste venstre hjørne af dias mod nederste venstre hjørne af spotter dæk. Inkjet spot et array af justering mærker (en løsning af polystyren micro-beads) med samme layout som for førerhuse.
- Lade justeringen mærker tørre. Flip overførsel dias og sætte det tilbage på spotter dæk, anbringelse mod nederst til venstre.
- Forberede dAb spotting opløsninger indeholdende 20 µg/mL antistoffer, 20% glycerol og 1% BSA.
- Ved hjælp af spotter ' s kamera, tage et billede af et varemærke, justering. Implementere dette billede i spotting programmet som en fiducial og få billede anerkendelsessystem af inkjet spotter til at identificere de mest øverste venstre mærke. Bruge sin koordinat som det første sted af matrixen dAb. Stedet 8 nL pr. droplet med en center-til-center afstand på 800 µm.
- Dobbelt overførselsmetode ( figur 1b)
- placere en overførsel dias 1 på inkjet spotter dækket mod nederste venstre hjørne. Spot cAbs opløsninger indeholdende 400 µg/mL antistoffer, 20% glycerol og 1% BSA i PBS i diaset med en inkjet microarray spotter på en relativ luftfugtighed på 60% (0,4 nL for hver plet og ~ 200 µm i diameter). Center-til-center afstand er 400 µm.
- Fastgøres overførsel dias med en nitrocellulose belagt (eller en functionalized glas) assay dias med en snap apparatur ( figur 2) til at overføre cAb dråber diaset assay.
- Drej alle seks knapper på siden af apparatet snap 90 grader til at trække og lås alle stemplerne i åben position. Indsæt overførsel dias i diasholderen i sin beholder med klippede hjørnet står fast pogo benet. Drej det første sæt af tre knapper til at frigive udstikkere med den gyldne pogo ben og sørg for, at diassene er skubbet mod justering stifter.
- Indsætte en nitrocellulose-belagt slide snap apparater hovedet siddende på de 4 pogo ben. Drej det andet sæt af tre knapper til at frigive udstikkere med sølv pin og sørg for, at diassene er skubbet mod justering stifter.
- Luk snap apparatet ved at placere den øverste shell på lysbilledholderen ved hjælp af justering søjler og huller til en præcis positionering.
- Indsætte lukkede snap apparater i sit bur og skubbe fanen lukning helt til at bringe microarrays ansigt til ansigt mens den passende pressionsmiddel. Holde lukket i 1 min.
- Adskille dias. Inkuber assay dias ved stuetemperatur i 1 time med en relativ luftfugtighed på 60%. Vask, blokere og tørre assay dias som beskrevet i trin 1.1.3 - 1.1.5.
- Placer et andet overførsel dias på inkjet spotter dæk og skubbe mod nederste venstre hjørne. Spot dAb opløsninger indeholdende 50 eller 100 µg/mL af antistoffer (se tabel 1), 20% glycerol og 1% BSA i PBS. Sikre, at hver enkelt spot er 0,8 nL og center til center afstand mellem steder er 400 µm.
- Gemme analysen og overførsel dias. Forsegle både analyse og overførsel dias i en lufttæt pose indeholder tørremidlet og sætte i en-20 ° C fryser.
2. Multipleksede immunassays med snap chips
- hente assay dias fra fryseren. Forlade den pose, forseglet i 30 min, indtil diasset kommer til stuetemperatur.
- Forbered 7-punkts serie fortyndet prøve løsninger ved spiking proteiner i PBS, som indeholder 0,05% Tween-20.
Bemærk: Her, en 5-fold fortyndingsfaktoren er brugt. De begyndende koncentrationer for hvert protein er angivet i tabel 1. - Forbered prøve løsninger som passende. For eksempel, fortyndes humant serum 4 gange i PBST buffer.
- Klemme en 16-rum pakning på diasset assay.
- Udfylde en kolonne af 8 brønde med 7 protein fortynding løsninger og en protein-fri PBST stødpudeopløsning af pipettering. Afpipetteres prøve løsninger i de andre 8 brønde på det samme dias.
Bemærk: 80 µL løsninger kan være egnet i hver brønd. Flere dias kan bruges til at måle yderligere prøver når nødvendigt. - Ruger prøver på en shaker på 450 rpm i 1 time ved stuetemperatur eller for overnatning på 4 ° C. vask diaset tre gange med PBST på shaker på 450 rpm, 5 min hver gang. Fjerne pakningen og tørre dias under en strøm af nitrogen gas.
- Hente overførsel dias med klatter fra fryseren. Holde posen lukket for 30 min ved stuetemperatur. Derefter inkuberes dias i et lukket kammer (fx Tom tips box) indeholdende 60% fugtighed stabilisering perler i 20 min. til rehydrering.
- Fastgøres overførsel dias med assay dias med en snap apparatur ( figur 2) til at overføre dAb dråber. Se afsnit 1.2.2 for driften af apparatet snap.
- Adskille dias. Inkuber assay dias i et lukket kammer, som indeholder 60% fugtighed stabilisering perler for 1 h. klemme diasset assay med en 16-rum pakning og skyl diasset 4 gange med PBST på en shaker på 450 rpm, 5 min hver time.
- Pipette 80 µL af opløsninger indeholdende 2,5 µg/mL streptavidin fluorophore i PBS i hvert hul. Inkuber i 20 min. på en shaker på 450 rpm.
- Skylles dias 3 gange med PBST og en gang med destilleret vand på shaker på 450 rpm. Fjerne pakningen og tørre dias med nitrogen gas.
3. Dias scanning og data analyse
- Scan assay dias med et fluorescens microarray scanner ved hjælp af 635 nm laser.
- Uddrag nettointensitet af hvert sted ved hjælp af en analyse software (f.eks. matrix-pro analyzer) 16.
- Beregne detektionsgrænsen (LOD) af hvert protein ved hjælp af en statistik software og bestemme protein koncentrationer i prøverne.
Bemærk: LOD er defineret som Y-skæringspunktet af standard curve øges ved tre gange standardafvigelsen af tre uafhængige assays.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Analyseprocedure for både enkelt og dobbelt overførselsmetoder er vist i figur 1. I enkelt overførsel, førerhuse er spottet direkte på diasset assay og klatterne overføres diaset assay ved brug i et spejlet mønster af cAbs (figur 1a). Kun én overførsel procedure er påkrævet, men denne metode lider af misforholdet mellem de to microarrays, hovedsageligt forårsaget af den kantede misforholdet mellem diasset og inkjet gantry (figur 2). En tilgang til at tackle denne udfordring er at overføre både taxaer og ising sekventielt i diaset assay efter spotting og om fastsættelse af dias i snap apparatet korrekt (figur 1b). Ved hjælp af denne metode, er begge microarrays overført til den nøjagtige samme holdning. Ingen image anerkendelse system eller justering markør er nødvendig for den dobbelte overførselsmetode. Forskydning for 98% af steder var 41 µm, 6-fold forbedring i forhold til enkelt overførsel metode14.
Snap apparat er udviklet til at være let at bruge uden uddannelse og minimere risikoen for array forskydning. Diasene er bragt sammen med nøjagtig positionsbestemmelse tak justering stifter fælles til både analyse og overførsel dias. Overførsel dias er lidt mindre til at passe under assay dias når suspenderet af pogo ben, indtil snap apparater er lukket. En spacer er inkluderet på overførsel dias opretholde et mikrometer mellemstore hul, der tillader pålidelig dråbe overførsel til glas dias. Endelig, buret og dets lukning fane er designet til at anvende tryk der er nødvendige for effektiv overførsel på hver snap for reproducerbare, høj kvalitet overførsel. Et foto snap apparatet er vist i figur 3.
Repræsentative billeder illustrerer resultaterne af reagens overførsel på en nitrocellulose og et glas dias er vist i figur 4. Alexa 532 mærket IgGs blev brugt som den første reagens, og Alexa 647 hedder IgGs blev brugt som den anden reagens. Efter overførslen, diaset blev scannet med 532 nm og 635 nm lasere. Resultatet viser, at 3136 (for diasset nitrocellulose) eller 1024 (for glas dias) microspots blev overført med nul fejl på assay dias og ingen krydskontaminering blev observeret efter overførsel af den anden reagens. Når du bruger glas lysbilleder, er det muligt at oprette flere hydrofobe overfladen af functionalization, således at reducere størrelsen af hver plet og faldende spot til spot afstand for at overføre et større antal steder. Dette arbejde udvider anvendelsen af snap chip teknologi til almindeligt anvendte glas substrater.
Standard kurver på en 50-plex immunassay målretning breast cancer-relaterede proteiner er illustreret i figur 5, svarende til den største multiplex sandwich antistof microarray til dato uden krydsreaktivitet. Dobbelt-overførselsmetode blev brugt i denne analyse, diaset blev scannet og fluorescens-intensiteten var kvantificeres for at generere de standard kurver. 35 ud af 50 proteiner nåede LODs på pg/mL (se tabel 1) og kan forbedres yderligere ved at optimere assay betingelser. Colocalization af reagenser letter brugen af flere antistof par på et enkelt dias uden krydsreaktivitet og giver mulighed for optimering af hvert par uafhængigt uden interferens med andre par12. Disse resultater viser, at snap chip er en skalerbar teknologi, der kan bruges til multipleksede protein kvantificering.
Figur 1. Skematisk af analyseprocedure sammenligning a single og b dobbelt overførselsmetoder. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Skematisk viser forskelle mellem enkelt - og dobbelt-overførsel. a en spejling af overførsel reagenser forstærker den kantede misforholdet mellem diasset og inkjet XY fase. (b) dobbelt-overførselsmetode overvinder den kantede forskydning. Tilpasset fra reference 14 med tilladelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Foto af apparatet snap. (a) åbnet enhed. (b) lukket enhed. c perspektivvisning af enheden. Kort, (i) overførsel dias er placeret i lysbilledholderen og skubbet mod justering stifter med pogopin monteret på stemplerne. (ii) assay diasene er anbragt oven på pogopins og skubbet mod justering stifter ved hjælp af et andet sæt af stemplerne. (iii) den øverste shell er placeret på toppen af lysbilledholderen og indsat i buret. En pres er anvendt ved hjælp af fanen lukning til at komprimere pogopin og samle diasene. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Kollektive overførsel af steder benytter en snap hak. Fluorescens scanning ved hjælp af 532 nm og 633 nm lasere til at demonstrere overførsel af antistoffer på en (en) nitrocellulose dias (tilpasset fra reference 14 med tilladelse) og (b) glas dias. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. Fluorescens billede af en assay dias og standard kurver af 50 proteiner målt parallelt med dobbelt overførselsmetode. a fluorescens billede af en assay dias til at generere en standardkurve. b nærbillede af et array. Skalalinjen = 2 mm. c Standard kurver for 50 proteiner. Fejllinjer blev beregnet som standardafvigelser fra tre uafhængige forsøg. Tilpasset fra reference 14 med tilladelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Protein navn | Start koncentration (ng/ml) | LOD (pg/ml) | Protein navn | Start koncentration (ng/ml) | LOD (pg/ml) |
| ANG2 | 500 | 1,3 × 104 | IL-6b | 1 | 2.1 × 102 |
Bord 1. Protein koncentrationer og LODs i bufferen fra 50-plex assay. LOD for CA 15-3 er i U/ml (*). Tilpasset fra Reference 14 med tilladelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I dette arbejde har vi præsenteret en snap chip-teknologi, der gør de gratis Cross-Country reactivity multiplex immunassays bredt tilgængelige for forskere med eksperimentelle grundopsætning. Adskiller sig fra eksisterende antistof microarrays, ingen microarray spotter er nødvendig for slutbrugere. Både enkelt og dobbelt overførselsmetoder er påvist, og dobbelt overførsel giver overlegen justering nøjagtighed ned til ~ 40 μm for 98% steder, med den største fejljustering af 63 µm14. En roman snap apparatet blev udviklet for at bekvemt Fastgør de to dias med konsekvent pres, hvilket gør denne teknologi tilgængelig for forskere. Pålidelig reagens overførsel er realiseret på nitrocellulose-belagt dias, men også på regelmæssige glas lysbilleder, betydeligt udvider anvendelsen af denne teknologi uden brug af omfattende uddannelse. For at påvise anvendeligheden af snap chip, en 50-plex immunassay blev gennemført ved hjælp af pre plettede og lagrede dias, og 70% af proteinerne opnåede LODs i den vifte af pg/mL14. I forhold til eksisterende multiplex immunassays, der gælder klatter som en blanding, er en vigtig fordel ved ACM og snap chip teknologi at assays på en chip er uafhængige til hinanden, således at for tilføjelse eller fjernelse af enhver antistof par uden forstyrrer andre par. Snesevis til hundredvis af proteiner kan måles samtidigt med en snap chip, således forkorte assay tid sammenlignet med andre metoder såsom automatiseret serie måling af sekventielle inkubation, som kræver serial anvendelse af hver antistof 17. Kun sub-nanoliter hver antistof er nødvendig for snap chip fabrikation, hvilket gør det mere økonomisk end konventionelle immunassays.
Antistof koncentrationerne anvendes og antigen inkubation trin er afgørende for at opnå højt assay følsomhed. I fabrikation af snap chips, kan antistof koncentration være optimeret afhængig af affiniteten af antistof par og typerne af assay dias (nitrocellulose eller ikke-nitrocellulose). Mængderne af hvert antistof spot kan justeres baseret på spotter kapacitet og justering nøjagtighed, og center-til-center afstand mellem steder kan ændres i overensstemmelse hermed. Efter overføre førerhuse til diasset assay, rugede vi assay dias ved stuetemperatur til 1 h. natten inkubation ved 4 ° C kan give bedre antistof bindende kapacitet. BSA gratis stabilisator løsninger blev (se tabel over materialer) brugt her til at blokere assay dias efter inkubation førerhuse. Andre blokerende reagenser som dyrenes serum eller mælk kan også arbejde for dette program.
I multiplex immunassays kan protokoller for ikke-nitrocellulose dias med forskellige overfladekemi udviklet og optimeret. En anden fortyndingsfaktoren kan bruges til at lave standard kurver afhængigt af målet proteiner. Forskellige fluorophores kan bruges til at mærke klatter, og diaset kan scannes ved hjælp af en laser ved en anden bølgelængde for signal samling.
I øjeblikket der er opnået en massefylde på 625 steder/cm2 med dobbelt overførsel metode14. Yderligere at forbedre multiplexing evne til snap chip, findes flere strategier. For det første, mindre mængder kan bruges til at reducere størrelsen af steder, således giver mulighed for kortere center til center afstand mellem steder og øget array tæthed. For det andet, kan man vælge en overførsel dias med en mere hydrofobe overflade for at mindske den spot størrelse. For det tredje kan bedre tilpasning mellem de to microarrays opnås ved at udføre finjustering af inkjet spotter, og yderligere optimering af de spotting parametre som afstanden mellem dyser og dias overflade.
Som for alle antistof-baserede immunassays er opfyldelse af snap chip immunassay underlagt tilgængelighed og kvalitet af antistoffer. Snap chip fungerer ved hjælp af en sandwich assay format, som er den mest udbredte assay format i ELISA på grund af høj følsomhed og specificitet af dual, sekventiel bindingen af et par af antistoffer rettet mod forskellige epitoper, men det er afhængig af tilgængeligheden af et par af kompatible antistoffer behov for opsamling og påvisning af target proteinet.
Værdien af snap chip teknologi er etableret for immunassays, og det forventes, at det kan bruges til enhver kemiske og biokemiske reaktioner, der kræver anvendelse af forskellige reagenser uden Kors-forureninger18,19 , 20 , 21 , 22. faktisk, snap-chip giver en generel løsning til at levere forskellige pre plettede reagenser fra microarray-til-microarray, således adskille chip fabrikation med ANALYSEPROCEDURE, og derfor hjælper med at løse de " makro til mikro"interfacing udfordre23. Som et eksempel, er snap chip blevet brugt til en 4-plex homogene enzym hæmning assay til at analysere 128 betingelser med præcis timing og sammenlignelige resultater til store volumen eksperimenter14. Det er også blevet anvendt til multipleksede væv farvning. Derudover kan det bidrage til stof screening applikationer til at teste tusindvis af kemikalier på forskellige bakterier eller celler, til enkelt celle analyse21,24, eller til at teste forskellige betingelser i enkelt eller Multi-trins kemiske reaktioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
McGill University har indgivet en patentansøgning om nogle aspekter af dette arbejde med Huiyan Li og David Juncker som opfindere.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Rob Sladek til brug i inkjet spotter. Vi anerkender den endelige støtte fra den canadiske institutter for sundhed Research (CIHR), naturvidenskabelige og Engineering Research Rådet i Canada (NSERC), canadiske kræft samfund Research Institute og Canada Foundation for Innovation (CFI). D.J. tak støtte fra en Canada forskning stol.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffered saline tablet | Fisher Scientific | 5246501EA | |
| Streptavidin-conjugated Cy5 | Rockland | s000-06 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | p1379 | |
| Bovine serum albumin | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc | 001-000-162 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Blocking solution: BSA-free StabilGuard Choice Microarray Stabilizer | SurModics, Inc | SG02 | |
| Nitrocellulose coated slides | Grace Bio-Laboratories, Inc | 305116 | |
| Aminosilane coated slides | Schott North America | 1064875 | |
| Snap Device | Parallex BioAssays Inc. | PBA-SD01 | |
| Inkjet microarray spotter | GeSiM | Nanoplotter 2.0 | |
| Slide module gasket | Grace Bio-Laboratories, Inc | 204862 | |
| Humidity Stabilization Beads | Parallex BioAssays Inc. | PBA-HU60 | |
| Array-Pro Analyzer software | Media Cybernetics | Version 4.5 | |
| Fluorescence microarray scanner | Agilent | SureScan Microarray Scanner | |
| Biostatistics software | GraphPad Software | GraphPad Prism 6 | |
| Endoglin capture antibody | R&D Systems | MAB10972 | |
| Endoglin protein | R&D Systems | 1097-EN | |
| Endoglin detection antibody | R&D Systems | BAF1097 | |
| IL-6a (see Table 1) | R&D Systems | ||
| IL-6b (see Table 1) | Invitrogen |
References
- Mor, G., et al. Serum protein markers for early detection of ovarian cancer. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (21), 7677-7682 (2005).
- Nicolini, A., et al. Intensive post-operative follow-up of breast cancer patients with tumour markers: CEA, TPA or CA15.3 vs MCA and MCA-CA15.3 vs CEA-TPA-CA15.3 panel in the early detection of distant metastases. BMC Cancer. 6 (1), 1-9 (2006).
- Hnasko, R., Lin, A., McGarvey, J. A., Stanker, L. H. A rapid method to improve protein detection by indirect ELISA. Biochem. Biophys. Res. Commun. 410 (4), 726-731 (2011).
- Percy, A. J., Chambers, A. G., Yang, J., Hardie, D. B., Borchers, C. H. Advances in multiplexed MRM-based protein biomarker quantitation toward clinical utility. Biochim. Biophys. Acta - Proteins and Proteomics. 1844 (5), 917-926 (2014).
- Ekins, R. P.
- Mahlknecht, P., et al. An antibody microarray analysis of serum cytokines in neurodegenerative Parkinsonian syndromes. Proteome Sci. 10 (1), 71-80 (2012).
- Miller, J. C., et al. Antibody microarray profiling of human prostate cancer sera: Antibody screening and identification of potential biomarkers. Proteomics. 3 (1), 56-63 (2003).
- Li, H., Leulmi, R. F., Juncker, D. Hydrogel droplet microarrays with trapped antibody-functionalized beads for multiplexed protein analysis. Lab Chip. 11 (3), 528-534 (2011).
- Juncker, D., Bergeron, S., Laforte, V., Li, H. Cross-reactivity in antibody microarrays and multiplexed sandwich assays: shedding light on the dark side of multiplexing. Curr. Opin. Chem. Biol. 18, 29-37 (2014).
- Blank, K., et al. Double-chip protein arrays: force-based multiplex sandwich immunoassays with increased specificity. Anal. Bioanal. Chem. 379 (7), 974-981 (2004).
- Albrecht, C., et al. DNA: A Programmable Force Sensor. Science. 301 (5631), 367-370 (2003).
- Pla-Roca, M., et al. Antibody Colocalization Microarray: A Scalable Technology for Multiplex Protein Analysis in Complex Samples. Mol. Cell. proteomics. 11 (4), (2012).
- Li, H., Bergeron, S., Juncker, D. Microarray-to-Microarray Transfer of Reagents by Snapping of Two Chips for Cross-Reactivity-Free Multiplex Immunoassays. Anal. Chem. 84 (11), 4776-4783 (2012).
- Li, H., Munzar, J. D., Ng, A., Juncker, D. A versatile snap chip for high-density sub-nanoliter chip-to-chip reagent transfer. Sci. Rep. 5, 11688 (2015).
- Li, H., Bergeron, S., Annis, M. G., Siegel, P. M., Juncker, D. Serial analysis of 38 proteins during the progression of human breast tumor in mice using an antibody colocalization microarray. Mol. Cell. Proteomics. 14, 1024-1037 (2015).
- Bergeron, S., Laforte, V., Lo, P. S., Li, H., Juncker, D. Evaluating mixtures of 14 hygroscopic additives to improve antibody microarray performance. Anal. Bioanal. Chem. 407 (28), 8451-8462 (2015).
- Whiteaker, J. R., et al. Sequential Multiplexed Analyte Quantification Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled to Mass Spectrometry. Mol. Cell. Proteomics. 11 (6), (2012).
- Xu, K., Wang, X., Ford, R. M., Landers, J. P. Self-Partitioned Droplet Array on Laser-Patterned Superhydrophilic Glass Surface for Wall-less Cell Arrays. Anal. Chem. 88 (5), 2652-2658 (2016).
- Lee, M. -Y., Park, C. B., Dordick, J. S., Clark, D. S. Metabolizing enzyme toxicology assay chip (MetaChip) for high-throughput microscale toxicity analyses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (4), 983-987 (2005).
- Fernandes, T. G., et al. Three-dimensional cell culture microarray for high-throughput studies of stem cell fate. Biotechnol. Bioeng. 106 (1), 106-118 (2010).
- Kwon, C. H., et al. Drug-Eluting Microarrays for Cell-Based Screening of Chemical-Induced Apoptosis. Anal. Chem. 83 (11), 4118-4125 (2011).
- Jogia, G. E., Tronser, T., Popova, A. A., Levkin, P. A. Droplet Microarray Based on Superhydrophobic-Superhydrophilic Patterns for Single Cell Analysis. Microarrays. 5 (4), 28 (2016).
- Schena, M., Shalon, D., Davis, R. W., Brown, P. O. Quantitative Monitoring of Gene Expression Patterns with a Complementary DNA Microarray. Science. 270 (5235), 467-470 (1995).
- Wu, J., et al. A sandwiched microarray platform for benchtop cell-based high throughput screening. Biomaterials. 32 (3), 841-848 (2011).
