Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Knipse Chip for Cross-reactivity-fri og Spotter-fri multiplex Sandwich immunanalyser

Published: November 13, 2017 doi: 10.3791/56230
Automatic Translation
1,2, 3, 1,2,3, 1,2
1McGill University and Génome Québec Innovation Centre, 2Biomedical Engineering Department, McGill University, 3Parallex BioAssays Inc.

Summary

Vi viser en fest chip teknologi for å utføre cross-reactivity-fri multiplex sandwich immunanalyser ved å klikke bare to lysbilder. En snapin-apparater brukes for pålitelig overføring reagenser fra microarray til microarray. Fest chip kan brukes for alle biokjemiske reaksjoner som krever colocalization av forskjellige reagenser uten kryss-kontaminering.

Abstract

Multiplex protein analyser har vist bedre diagnostiske følsomhet og nøyaktighet i forhold til enkelt proteiner. Antistoff microarrays tillate tusenvis av mikro-skala immunanalyser utføres samtidig på én enkelt brikke. Sandwich analysen formatet forbedrer analysen spesifisitet av oppdager hvert mål med to antistoffer, men lider av kryssreaktivitet mellom reagenser dermed begrenser deres multipleksing evner. Antistoff colocalization microarray (ACM) er utviklet for cross-reactivity-fri multiplex proteinet oppdagelsen, men krever en dyre spotter stedets microarray fabrikasjon under analyser. I dette arbeidet viser vi en fest chip teknologi som overfører reagens fra microarray til microarray av bare knipser cents sammen, dermed ingen spotter kreves under inkubasjon og anvendelse av gjenkjenning antistoffer (dAbs) på lagring av pre flekkete lysbilder, dissociating lysbilde utarbeidelse fra analysen kjøring. Både enkle og doble overføring presenteres for å oppnå nøyaktig justering mellom de to microarrays og lysbildet fabrikasjon for begge metodene beskrives. Resultatene viser at < 40 μm justering er oppnådd med dobbel overføring, nå en rekke tetthet 625 flekker/cm2. En 50-plexed immunanalyse er utført for å demonstrere brukbarheten av snapin chip multiplex protein analyse. Grensene for påvisning av 35 proteiner er i området av pg/mL.

Introduction

Et panel av biomarkers bestående av flere proteiner kan gi høyere sensitivitet og spesifisitet enn en enkelt biomarkør i diagnostikk av komplekse sykdommer som kreft1,2. Enzym knyttet immunosorbent analysen (ELISA) har vært gullstandarden teknologien som brukes i kliniske laboratorier oppnå en grense på gjenkjenning på lav pg/mL i plasma, men grensene til ett mål per analysen3,4,5. Antistoff microarrays er utviklet for imøtekommende tusenvis av miniatyriserte analyser gjennomført parallelt på en enkelt mikroskop lysbilde6,7,8. Men multipleksing evnen til denne metoden er begrenset av reagens-drevet kryssreaktivitet, som oppstår ved bruk av en blanding av dAbs, og det blir mer problematisk med et økende antall mål9,10 , 11. Pla et al. har uttalt at det resulterende sikkerhetsproblemet av en multiplex sandwich analysen skalaer som 4N(N-1) der N er antallet mål12.

For å redusere kryssreaktivitet i antistoff microarrays, antistoff colocalization microarray er (ACM) utviklet i vårt laboratorium for multiplex sandwich analysen12. Fange antistoffer (drosjer) er oppdaget på et substrat med et microarray spotter. Etter blokkering prøver brukes på overflaten, og deretter individuelle dAbs er oppdaget på de samme stedene med cAb-antigen komplekset. Alle kryssreaktivitet scenarier mellom antistoffer og antigener kan reduseres med ACM og grensene for gjenkjenning på pg/mL er oppnådd. Analysen protokollen krever imidlertid forbereder og dAbs spotting eksperimenter bruker en på stedet microarray spotter med høy presisjon for justering formål, som er dyrt og tidkrevende, begrense bred anvendelse av denne teknologien i andre laboratorier. En håndholdt ACM, kalt snapin chip har blitt utviklet for cross-reactivity-fri og spotter-fri multiplex sandwich immunanalyser13,14,15. Drosjer er dAbs pre oppdaget på et analysen lysbilde og en overføring lysbildet henholdsvis i microarray format og lagret. Under analysen, lysbildene er hentet og et microarray av dAbs overføres samlet inn i analysen lysbildet ved å bare klikke to brikkene sammen. En snapin-apparater brukes for pålitelig reagens overføring. Nitrocellulose belagt lysbilder med en relativt stor antistoff bindende kapasitet har blitt brukt som analysen lysbildene til å absorbere de flytende dråpene og dermed tilrettelegge reagens overføring, men lysbildene er dyrere enn vanlig glass lysbilder og microarray skannere kompatibel med ikke-gjennomsiktige lysbilder er nødvendig for signalet vinningen.

I dette arbeidet viser vi protokollen for å utføre en multiplex sandwich immunanalyse med en snap-chip. En ny snapin-apparater er utviklet for mer praktisk og pålitelig reagens overføring fra microarray til microarray. Viktigere, har her vi etablert reagens overføringsmetoden på vanlige glass lysbilder med snapin-chip. 1024 flekker var vellykket overført og justert på et glass lysbilde, betydelig utvide bruken av denne teknologien i de fleste laboratorier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. fabrikasjon og lagring av fest chips

  1. enkelt overføringsmetode ( figur 1a)
    1. Spot cAb løsninger som inneholder 400 µg/mL antistoffer og 20% glyserol i fosfat-bufret saltvann (PBS) på en nitrocellulose (eller et functionalized glass) analysen lysbildet med en inkjet microarray spotter 13 på luftfuktigheten er 60% (1.2 nL for hver spot) med 800 µm midtpunkt til midtpunkt avstand. Kontroller at lysbildet er fast på spotter dekk etter et hjørne (her, nederst til venstre ble brukt).
    2. Ruge flekkete analysen lysbildet ved romtemperatur 1t med luftfuktigheten er 60%.
    3. Klemme en slide modul pakning med 16 rom i analysen lysbildet å dele det i 16 brønner. Skyll lysbildet tre ganger ved å legge til 80 µL av PBS 0,1 prosent Tween-20 (PBST) i hver godt og riste på 450 rpm på en shaker, 5 min hver gang.
    4. Legge til 80 µL av blokkering løsninger for hver godt og riste 1t 450 RPM.
    5. Fjern pakning og tørr analysen lysbildet med en strøm av nitrogen.
    6. Fikse et overføring lysbilde på spotter dekk og skyv nederst til venstre på lysbildet mot nedre venstre hjørne av spotter dekk. Inkjet oppdage en rekke justering merker (en løsning av polystyren mikro-perler) med samme oppsett som for drosjer.
    7. La justering merkene tørr. Vende overføring lysbildet og legge den tilbake på spotter dekk, fikse mot nederst til venstre.
    8. Forberede dAb småblødninger løsninger som inneholder 20 µg/mL antistoffer, 20% glyserol og 1% BSA.
    9. Bruker spotter ' s kamera, ta et bilde av en justering. Implementere dette bildet i småblødninger programmet som en fiducial og få bildet anerkjennelsessystemet av inkjet spotter å identifisere mest øverste venstre merket. Bruke sin koordinaten som det første stedet i dAb-matrisen. Spot 8 nL per dråpe med et midtpunkt til midtpunkt avstand på 800 µm.
  2. Dobbel overføringsmetode ( figur 1b)
    1. plasserer en overføring lysbilde 1 på inkjet spotter dekket mot nedre venstre hjørne. Spot drosjer løsninger som inneholder 400 µg/mL antistoffer, 20% glyserol og 1% BSA i PBS på lysbildet med en inkjet microarray spotter på luftfuktigheten er 60% (0,4 nL for hver spot og ~ 200 μm i diameter). Midtpunkt til avstanden er 400 µm.
    2. Festes overføring lysbildet med en nitrocellulose belagt (eller et functionalized glass) analysen lysbildet med en snap apparater ( figur 2) overføre cAb dråpene på analysen lysbildet.
      1. Slå alle seks knapper på siden av snapin apparatet 90 grader til å trekke og låse alle stemplene i åpen posisjon. Sett inn overføring lysbildet i lysbildeholderen i sin beholder med avkuttet hjørne mot fast pogo pin. Slå det første settet med tre knapper å løslate stempler med den gylne pogo pin og at lysbildene er skjøvet mot justering pinnene.
      2. Inn et nitrocellulose-belagt lysbilde i snapin apparater opp ned sitter på 4 pogo pinnene. Slå det andre settet med tre knapper å løslate stempler med sølv pin og at lysbildene er skjøvet mot justering pinnene.
      3. Lukker snapin apparatet ved å plassere topp skallet på lysbildeholderen bruker justering søyler og hull for en nøyaktig posisjonering.
      4. Sette inn lukket snapin apparatet i buret sitt og trykk kategorien nedleggelse helt ned for å bringe microarrays ansikt til ansikt mens søknad aktuelle trykket. Oppbevare lukket i 1
    3. Skille lysbildene. Inkuber analysen lysbildet ved romtemperatur 1t med luftfuktigheten er 60%. Vask, blokkere og tørr analysen lysbildet som beskrevet i trinnene 1.1.3 - 1.1.5.
    4. Plasser et annet overføring lysbilde på inkjet spotter dekk og trykk mot nedre venstre hjørne. Spot dAb løsninger som inneholder 50 eller 100 µg/mL av antistoffer (se tabell 1), 20% glyserol og 1% BSA i PBS. Kontroller at hver spot er 0,8 nL og midtpunkt til midtpunkt avstanden mellom stedene er 400 µm.
    5. Lagre analysen og overføre lysbildet. Forsegle både analysen og overføre lysbilder i en lufttett posen som inneholder fuktighet og satt i en 20 ° C fryser.

2. Multiplekset immunanalyser med fest chips

  1. hente analysen lysbildet fra fryseren. La sekken forseglet i 30 min før lysbildet kommer til romtemperatur.
  2. Forberede 7-punktet føljetong utvannet utvalg løsninger av skyter proteiner i PBS 0,05 prosent Tween-20.
    Merk: Her en 5-fold fortynningsfaktoren brukes. Start konsentrasjonen for hver protein er oppført i tabell 1.
  3. Forberede prøven løsninger som passer. For eksempel fortynne humant serum 4 ganger i PBST buffer.
  4. Klemme en 16-compartment pakning på analysen lysbildet.
  5. Ut én kolonne med 8 brønner med 7 protein fortynning løsningene og en protein-fri PBST buffer løsning pipettering. Pipetter prøve løsningene i andre 8 brønnene i samme lysbilde.
    Merk: 80 µL løsninger kan passe i hver brønn. Lysbilder kan brukes til å måle flere eksempler når det er nødvendig.
  6. Ruge prøvene i en shaker på 450 rpm enten 1t ved romtemperatur eller for overnatting på 4 ° C. vask lysbildet tre ganger med PBST på shaker på 450 rpm, 5 min hver gang. Fjern pakning og tørr lysbildet under en strøm av nitrogen gass.
  7. Hente overføring lysbildet med dAbs fra fryseren. Holde posen forseglet for 30 min ved romtemperatur. Deretter ruge lysbildet i et lukket kammer (f.eks tom tips boks) inneholder 60% fuktighet stabilisering perler for 20 min for utvanning.
  8. Festes overføring lysbildet med analysen lysbildet med en snap apparater ( figur 2) overføre dAb-dråper. Se delen 1.2.2 for driften av apparatet snapin.
  9. Skille lysbildene. Inkuber analysen lysbildet i et lukket kammer som inneholder 60% fuktighet stabilisering perler for 1 h. klemme analysen lysbildet med en 16-compartment pakning og skyll lysbildet 4 ganger bruker PBST på en shaker på 450 rpm, 5 min hver gang.
  10. Pipette 80 µL av løsninger som inneholder 2,5 µg/mL streptavidin fluorophore i PBS i hver brønn. Inkuber etter 20 min på en shaker på 450 rpm.
  11. Skyll lysbildet 3 ganger med PBST og en gang med destillert vann på shaker på 450 rpm. Fjern pakning og tørr lysbilde ved hjelp av nitrogen gass.

3. Skyv skanning og dataanalyse

  1. skanne analysen lysbildet med en fluorescens microarray skanner med 635-nm-laseren.
  2. Ekstra netto intensiteten på hvert sted å bruke en analyse programvare (f.eks matrise-pro analyzer) 16.
  3. Beregner grensen for påvisning (LOD) hver protein benytter en statistikk programvare og bestemme protein konsentrasjonen i utvalgene.
    Merk: LOD defineres som Y-skjæringspunktet av standard cuenkelte stasjoner økes med tre ganger standardavviket for tre uavhengige analyser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Analysen prosedyren for både enkle og doble overføring metoder er vist i figur 1. I enkelt overføring, drosjer er oppdaget på analysen lysbildet og dAbs overføres inn i analysen lysbildet ved bruk i et speil mønster av drosjer (figur 1a). Bare én prosedyre kreves, men denne metoden lider forskyvning mellom de to microarrays, hovedsakelig forårsaket av kantete misalignment mellom lysbildet og inkjet Portal (figur 2). En tilnærming til takle denne utfordringen er å overføre både drosjer og dAbs sekvensielt inn i analysen lysbildet etter spotting og fikse lysbildene i snapin-apparatet riktig (figur 1b). Bruker denne metoden, overføres begge microarrays til nøyaktig samme posisjon. Ingen bilde anerkjennelse system eller justering markør er nødvendig for dobbel overføringsmetoden. Misalignment 98% av stedene var innen 41 µm, 6-fold forbedring i forhold til enkelt overføring metode14.

Fest apparatet er utviklet for å være enkel å bruke uten trening og minimere risikoen matrise skjevheter. Lysbildene er ført sammen med nøyaktig plassering takket være innstillingsnålene som er felles for både analysen og overføring. Overføre lysbildet er litt mindre å passe under analysen lysbildet når suspendert av pogo pinner, til fest apparatet lukkes. En avstand er inkludert i overføringen lysbildet opprettholde en mikrometer store gapet som tillater pålitelige dråpeoverføring til av objektglass. Endelig er buret og nedleggelse fanen utformet gjelder trykk er nødvendig for effektiv overføring på hver enkelt for reproduserbare, høy kvalitet overføring. Et bilde av fest apparatet er vist i Figur 3.

Representant bildene illustrerer resultatene av reagens overføring til et nitrocellulose lysbilde og et glass lysbilde er vist i Figur 4. Alexa 532 merket IgGs ble brukt som den første reagensen og Alexa 647 merket IgGs ble brukt som andre reagensen. Etter overføring, lysbildet ble skannet med 532 nm og 635 nm lasere. Resultatet viser at 3136 (for nitrocellulose lysbildet) eller 1024 (for av objektglass) microspots ble overført uten feil på analysen lysbildene, og ingen krysskontaminering ble observert ved overføring andre reagensen. Når du bruker glass lysbilder, er det mulig å skape mer hydrofobe overflate av functionalization, dermed redusere størrelsen på hver spot og redusere sted å oppdage avstanden for overføring av et større antall flekker. Dette arbeidet utvider anvendelsen av snapin chip teknologi til vanlige glass underlag.

Standard kurver av 50-plex immunanalyse målretting brystkreft relaterte proteiner er illustrert i figur 5tilsvarer den største multiplex sandwich antistoff microarray hittil uten kryssreaktivitet. Dobbel-overføringsmetoden ble brukt i denne analysen lysbildet ble skannet og fluorescens intensiteten ble kvantifisert for å generere standard kurvene. 35 av 50 proteiner nådd LODs på pg/mL (se tabell 1) og kan forbedres ytterligere ved å optimalisere analysen betingelsene. Colocalization reagenser forenkler bruken av flere antistoff par på ett lysbilde uten kryssreaktivitet og gjør at optimalisering av hvert par uavhengig med uten forstyrrelser på andre par12. Disse resultatene indikerer at snapin-brikken er en skalerbar teknologi som kan brukes for multiplex protein kvantifisering.

Figure 1
Figur 1. Skjematisk av analysen prosedyren sammenligne a single og (b) dobbel overføring metoder. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2. Skjematisk viser forskjellene mellom enkelt - og dobbelt-transfer. (a) speiling av overføring reagensene forsterker kantete misalignment mellom lysbildet og inkjet XY scenen. (b) dobbel-overføringsmetoden overvinner kantete misalignment. Tilpasset fra referanse 14 med tillatelse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3. Bilde av fest apparatet. (a) åpnet enhet. (b) lukket enhet. (c) perspektivvisning av enheten. Kort, (i) overføre lysbilder er plassert i lysbildeholderen og presset mot innstillingsnålene med pogopin montert på stempler. (ii) analysen lysbilder er plassert på toppen av pogopins og presset mot justering pinnene med en andre stempler. (iii) overdelen er plassert på toppen av lysbildeholderen og settes inn i buret. Et press påføres ved hjelp av kategorien nedleggelse komprimere pogopin og samle lysbildene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4. Kollektive overføring av flekker ved hjelp av en snapin-chip. Fluorescens avsøke benytter 532 nm og 633 nm lasere å demonstrere overføring av antistoffer til (a) en nitrocellulose lysbildet (tilpasset fra referanse 14 med tillatelse) og (b) glass skyve. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5. Fluorescens bildet av et analysen lysbilde og standard kurver av 50 proteiner måles parallelt med dobbel overføringsmetode. (a) fluorescens bilde av et analysen lysbilde for å generere en standard kurve. (b) nærbilde av en matrise. Skala bar = 2 mm. (c) Standard kurver for 50 proteiner. Feilfelt ble beregnet som standard avvik fra tre uavhengige eksperimenter. Tilpasset fra referanse 14 med tillatelse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Protein navn Start konsentrasjonen (ng/ml) LOD (pg/ml) Protein navn Start konsentrasjonen (ng/ml) LOD (pg/ml)
ANG2 500 1.3 × 104 IL-6b 1 2.1 × 102
BDNF 500 1.0 × 102 IL-5 50 77 CA 15-3 * 1 4,9 × 103 IL-4 1000 1,5 × 104 CEA 1000 5.4 × 103 IL-2 50 76 CXCL10/IP-10 50 1.7 × 102 LEP 200 4.0 × 102 CRP 200 44 MIG 500 11 × 102 ENG 1000 6.2 × 102 CCL3/MIP-1Α 50 3.3 EGF 50 1,8 × 102 CCL4/MIP-1Β 50 12 EGFR 200 1.9 × 102 MMP-3 500 1.0 × 102 FAS-L 500 4.5 × 102 M-CSF 500 8.2 × 103 FGF 500 1.0 × 103 MMP-9 200 3.1 × 102 G-CSF 500 39 CCL2/MCP-1 50 55 GM-CSF 50 3.8 NCAM-1 500 1.7 × 103 GRO-Α 50 3.0 × 102 Β-NGF 200 1.4 × 103 HER2 500 3,5 × 103 NT-3 200 5.8 × 102 PDGF-BB 200 73 OPN 500 1.9 × 103 IL-1Β 500 7.9 × 102 RBP4 200 1.2 × 102 IL-1ra 200 1.1 × 103 SPARC 1000 4.6 × 104 IL-15 50 8.2 × 102 TNF-Α 50 4.4 IL-12 1 30 TNF-RI 50 1.3 × 102 IL-11 500 1.2 × 103 TNF-RII 50 12 IL-10 500 6.1 × 102 FAS/TNFRSF6 200 2,8 × 102 IL-8 50 6.6 uPA 200 24 IL-7 2.5 26 uPAR(CD87) 200 76 IL-6en 1000 84 VEGF 200 6,7 × 102

Tabell 1. Protein konsentrasjoner og LODs buffer fra 50-plex analysen. LOD ca 15-3 er i U/ml (*). Tilpasset fra referanse 14 med tillatelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I dette arbeidet har vi presentert en fest chip teknologi som gjør cross-reactivity-fri multiplex immunanalyser tilgjengelig for forskere med eksperimentelle grunnoppsett. Forskjellig fra eksisterende antistoff microarrays, ingen microarray spotter kreves for sluttbrukere. Både enkle og doble overføring metoder er vist, og dobbel overføring gir overlegen justering nøyaktighet ned til ~ 40 μm til 98% flekker, med største misalignment 63 µm14. En ny snapin-apparater ble utviklet for å enkelt feste de to lysbildene med konsekvent press, gjør denne teknologien tilgjengelig for forskere. Pålitelig reagens overføring er realisert ikke bare på nitrocellulose-belagt lysbilder, men også på vanlige glass lysbilder, betydelig utvidelse av anvendelsen av denne teknologien uten omfattende opplæring. For å demonstrere brukbarheten av snapin chip, en 50-plex immunanalyse ble utført med pre flekkete og lagret, og 70% av proteiner oppnådde LODs i området av pg/mL14. Sammenlignet med eksisterende multiplex immunanalyser som Påfør som en blanding, er en viktig fordel av ACM og fest chip teknologi at analyser på en chip er uavhengige, slik at for å legge til eller fjerne antistoff par uten forstyrre noen andre parene. Titalls til hundrevis av proteiner kan måles samtidig med en snap chip, dermed forkorte analysen tid i forhold til andre metoder som automatisert føljetong måling av sekvensiell inkubasjon som krever føljetong anvendelse av hver antistoff 17. Bare sub-nanoliter hver antistoff kreves for snapin flis fabrikasjon, gjør det mer økonomisk enn konvensjonell immunanalyser.

Antistoff konsentrasjonen brukes og antigen inkubasjon trinnene er avgjørende for å oppnå høy analysen følsomhet. I produksjon av snapin chips, kan antistoff konsentrasjon optimaliseres avhengig av slektskap av antistoff parene og typer analysen lysbildene (nitrocellulose eller ikke-nitrocellulose). Volum av hver antistoff spot kan bli justert basert på spotter kapasiteten og justering nøyaktighet og midtpunkt til avstanden mellom stedene kan endres tilsvarende. Etter overføring drosjer i analysen lysbildet, ruges vi analysen lysbildet ved romtemperatur for 1 h. overnatting inkubasjon på 4 ° C kan gi bedre antistoff innbindingen behandlingskapasitet. BSA gratis stabilisator løsninger ble (se tabellen materialer) brukt her å blokkere analysen lysbildet etter rugende drosjer. Andre blokkerer reagenser som dyr serum eller melk kan også arbeide for dette programmet.

I de multiplex immunanalyser, kan protokoller for ikke-nitrocellulose lysbilder med ulike overflatekjemi utvikles og optimalisert. En annen fortynning faktor kan brukes til å lage standard kurver avhengig av målet proteiner. Forskjellige fluorophores kan brukes til å merke dAbs, og lysbildet kan skannes ved hjelp av en laser på en annen bølgelengde for signalet samling.

En tetthet av 625 flekker/cm2 er foreløpig oppnådd med dobbel overføring metode14. For ytterligere å forbedre multipleksing evnen til snapin chip, finnes det flere strategier. Først kan mindre volumer brukes til å redusere størrelsen på de flekkene, slik at for kortere midtpunkt til midtpunkt avstand mellom flekker og økt matrise tetthet. Dernest kan du velge en overføring lysbildet med en mer hydrofobe overflate å redusere størrelsen. For det tredje, bedre samsvar mellom de to microarrays kan oppnås ved å utføre finjustering av inkjet spotter, og ytterligere optimalisere småblødninger parametrene som avstanden mellom dysene og skyve overflaten.

Som for alle antistoff-baserte immunanalyser er ytelsen til snapin chip immunanalyse tilgjengelighet og kvalitet av antistoffer. Fest chip opererer med en sandwich analysen format, som er den mest brukte analysen formatet i ELISA høy sensitivitet og spesifisitet by av doble, sekvensielle binding av et par av antistoffer målretting ulike epitopes, men den er avhengig tilgjengeligheten av et par kompatibel antistoffer nødvendig for fangst deteksjon av mål protein.

Verdien for fest chip teknologi er etablert for immunanalyser, og det forventes at det kan brukes for alle kjemiske og biokjemiske reaksjoner som krever bruke forskjellige reagenser uten kryss-forurensing18,19 , 20 , 21 , 22. egentlig snapin chip gir en generell løsning å levere ulike pre flekkete reagenser fra microarray til microarray, dermed å oppheve tilknytning av flis fabrikasjon analysen fremgangsmåten, og derfor hjelper adressering den " makro-til-micro"grensesnitt utfordre23. Som et eksempel, har snap chip blitt brukt for en 4-plex homogen enzym hemming analysen analysere 128 forhold med presis timing og sammenlignbare resultater stort volum eksperimenter14. Det er også brukt til multiplex vev farging. I tillegg kan bidra til narkotikarelaterte screening programmer å teste tusenvis av kjemikalier på forskjellige bakterier eller celler, enkelt celle analyse21,24, eller for å teste ulike forhold i ett eller flere trinn kjemisk reaksjoner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

McGill University har arkivert en patent på noen aspekter av dette arbeidet med Huiyan Li og David Juncker som oppfinnere.

Acknowledgments

Vi takker Dr. Rob Sladek for bruk av inkjet spotter. Vi erkjenner den siste støtten fra den kanadiske institutter for helse forskning (CIHR), Natural Science og Engineering Research Council for Canada (NSERC), den kanadiske kreft samfunnet Research Institute og Canada grunnlaget for innovasjon (CFI). DJ Takk støtte fra en Canada forskning stol.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phosphate buffered saline tablet Fisher Scientific 5246501EA
Streptavidin-conjugated Cy5 Rockland s000-06
Tween-20 Sigma-Aldrich p1379
Bovine serum albumin Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc 001-000-162
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
Blocking solution: BSA-free StabilGuard Choice Microarray Stabilizer SurModics, Inc SG02
Nitrocellulose coated slides Grace Bio-Laboratories, Inc 305116
Aminosilane coated slides Schott North America 1064875
Snap Device Parallex BioAssays Inc. PBA-SD01
Inkjet microarray spotter GeSiM Nanoplotter 2.0
Slide module gasket Grace Bio-Laboratories, Inc 204862
Humidity Stabilization Beads Parallex BioAssays Inc. PBA-HU60
Array-Pro Analyzer software Media Cybernetics Version 4.5
Fluorescence microarray scanner Agilent SureScan Microarray Scanner
Biostatistics software GraphPad Software GraphPad Prism 6
Endoglin capture antibody R&D Systems MAB10972
Endoglin protein R&D Systems 1097-EN
Endoglin detection antibody R&D Systems BAF1097
IL-6a (see Table 1) R&D Systems
IL-6b (see Table 1) Invitrogen

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mor, G., et al. Serum protein markers for early detection of ovarian cancer. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (21), 7677-7682 (2005).
  2. Nicolini, A., et al. Intensive post-operative follow-up of breast cancer patients with tumour markers: CEA, TPA or CA15.3 vs MCA and MCA-CA15.3 vs CEA-TPA-CA15.3 panel in the early detection of distant metastases. BMC Cancer. 6 (1), 1-9 (2006).
  3. Hnasko, R., Lin, A., McGarvey, J. A., Stanker, L. H. A rapid method to improve protein detection by indirect ELISA. Biochem. Biophys. Res. Commun. 410 (4), 726-731 (2011).
  4. Percy, A. J., Chambers, A. G., Yang, J., Hardie, D. B., Borchers, C. H. Advances in multiplexed MRM-based protein biomarker quantitation toward clinical utility. Biochim. Biophys. Acta - Proteins and Proteomics. 1844 (5), 917-926 (2014).
  5. Ekins, R. P. Multi-analyte immunoassay. J Pharm Biomed Anal. 7 (2), 155-168 (1989).
  6. Mahlknecht, P., et al. An antibody microarray analysis of serum cytokines in neurodegenerative Parkinsonian syndromes. Proteome Sci. 10 (1), 71-80 (2012).
  7. Miller, J. C., et al. Antibody microarray profiling of human prostate cancer sera: Antibody screening and identification of potential biomarkers. Proteomics. 3 (1), 56-63 (2003).
  8. Li, H., Leulmi, R. F., Juncker, D. Hydrogel droplet microarrays with trapped antibody-functionalized beads for multiplexed protein analysis. Lab Chip. 11 (3), 528-534 (2011).
  9. Juncker, D., Bergeron, S., Laforte, V., Li, H. Cross-reactivity in antibody microarrays and multiplexed sandwich assays: shedding light on the dark side of multiplexing. Curr. Opin. Chem. Biol. 18, 29-37 (2014).
  10. Blank, K., et al. Double-chip protein arrays: force-based multiplex sandwich immunoassays with increased specificity. Anal. Bioanal. Chem. 379 (7), 974-981 (2004).
  11. Albrecht, C., et al. DNA: A Programmable Force Sensor. Science. 301 (5631), 367-370 (2003).
  12. Pla-Roca, M., et al. Antibody Colocalization Microarray: A Scalable Technology for Multiplex Protein Analysis in Complex Samples. Mol. Cell. proteomics. 11 (4), (2012).
  13. Li, H., Bergeron, S., Juncker, D. Microarray-to-Microarray Transfer of Reagents by Snapping of Two Chips for Cross-Reactivity-Free Multiplex Immunoassays. Anal. Chem. 84 (11), 4776-4783 (2012).
  14. Li, H., Munzar, J. D., Ng, A., Juncker, D. A versatile snap chip for high-density sub-nanoliter chip-to-chip reagent transfer. Sci. Rep. 5, 11688 (2015).
  15. Li, H., Bergeron, S., Annis, M. G., Siegel, P. M., Juncker, D. Serial analysis of 38 proteins during the progression of human breast tumor in mice using an antibody colocalization microarray. Mol. Cell. Proteomics. 14, 1024-1037 (2015).
  16. Bergeron, S., Laforte, V., Lo, P. S., Li, H., Juncker, D. Evaluating mixtures of 14 hygroscopic additives to improve antibody microarray performance. Anal. Bioanal. Chem. 407 (28), 8451-8462 (2015).
  17. Whiteaker, J. R., et al. Sequential Multiplexed Analyte Quantification Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled to Mass Spectrometry. Mol. Cell. Proteomics. 11 (6), (2012).
  18. Xu, K., Wang, X., Ford, R. M., Landers, J. P. Self-Partitioned Droplet Array on Laser-Patterned Superhydrophilic Glass Surface for Wall-less Cell Arrays. Anal. Chem. 88 (5), 2652-2658 (2016).
  19. Lee, M. -Y., Park, C. B., Dordick, J. S., Clark, D. S. Metabolizing enzyme toxicology assay chip (MetaChip) for high-throughput microscale toxicity analyses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (4), 983-987 (2005).
  20. Fernandes, T. G., et al. Three-dimensional cell culture microarray for high-throughput studies of stem cell fate. Biotechnol. Bioeng. 106 (1), 106-118 (2010).
  21. Kwon, C. H., et al. Drug-Eluting Microarrays for Cell-Based Screening of Chemical-Induced Apoptosis. Anal. Chem. 83 (11), 4118-4125 (2011).
  22. Jogia, G. E., Tronser, T., Popova, A. A., Levkin, P. A. Droplet Microarray Based on Superhydrophobic-Superhydrophilic Patterns for Single Cell Analysis. Microarrays. 5 (4), 28 (2016).
  23. Schena, M., Shalon, D., Davis, R. W., Brown, P. O. Quantitative Monitoring of Gene Expression Patterns with a Complementary DNA Microarray. Science. 270 (5235), 467-470 (1995).
  24. Wu, J., et al. A sandwiched microarray platform for benchtop cell-based high throughput screening. Biomaterials. 32 (3), 841-848 (2011).

Tags

Bioteknologi problemet 129 Sandwich immunanalyser antistoffer multiplekset fest cross-reactivity-fri spotter-fri chip
Knipse Chip for Cross-reactivity-fri og Spotter-fri multiplex Sandwich immunanalyser
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, H., Bergeron, S., Larkin, H.,… More

Li, H., Bergeron, S., Larkin, H., Juncker, D. Snap Chip for Cross-reactivity-free and Spotter-free Multiplexed Sandwich Immunoassays. J. Vis. Exp. (129), e56230, doi:10.3791/56230 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter