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Bioengineering

Rápido Chip para Cruz-reactivity-libre y observador de tiro multiplexado inmunoensayos de Sandwich

Published: November 13, 2017 doi: 10.3791/56230
Automatic Translation
1,2, 3, 1,2,3, 1,2
1McGill University and Génome Québec Innovation Centre, 2Biomedical Engineering Department, McGill University, 3Parallex BioAssays Inc.

Summary

Demostramos una tecnología de chip de complemento para realizar inmunoensayos sandwich multiplexados Cruz-reactivity-free simplemente chasquear dos diapositivas. Un aparato de presión se utiliza para transferir confiablemente reactivos de microarray de microarrays. El chip del broche de presión puede utilizarse reacciones bioquímicas que requieren colocalización de diferentes reactivos sin contaminación cruzada.

Abstract

Análisis de la proteína multiplexada ha demostrado una sensibilidad diagnóstica superior y precisión frente a las proteínas solo. Microarrays de anticuerpos permiten miles de micro escala inmunoensayos realizados simultáneamente en un solo chip. Formato de ensayo sándwich mejora la especificidad del ensayo mediante la detección de cada destino con dos anticuerpos, pero sufre de reactividad cruzada entre reactivos lo que limita su capacidad de multiplexación. Microarray de colocalización de anticuerpo (ACM) ha sido desarrollado para la detección de proteína multiplexados Cruz-reactivity-free, pero requiere un costoso observador in situ para la fabricación de microarrays durante los ensayos. En este trabajo, demostramos una tecnología de chip de snap que transfiere reactivo de microarrays para microarrays por simplemente encaja a presión juntos, que así no observador es necesario durante la incubación de la muestra y posterior aplicación de anticuerpos de detección (dAbs) con dos fichas almacenamiento de portaobjetos previamente manchados, disociando la preparación de los portaobjetos de la ejecución del ensayo. Ambos métodos de transferencia individuales y dobles se presentan para lograr la alineación exacta entre los dos microarrays y la fabricación de la diapositiva para ambos métodos se describen. Resultados muestran que < 40 μm alineación se ha conseguido con la doble transferencia, alcanzando una densidad de matriz de 625 puntos/cm2. Un inmunoanálisis de 50 plexed se ha realizado para demostrar la utilidad de la viruta del complemento en el análisis de la proteína multiplexados. Límites de detección de proteínas de 35 están en la gama de pg/mL.

Introduction

Puede proporcionar un panel de biomarcadores que comprende múltiples proteínas de más alta sensibilidad y especificidad que un único biomarcador en el diagnóstico de enfermedades complejas como cáncer1,2. El análisis enzima-ligado del inmunosorbente (ELISA) ha sido la tecnología estándar utilizada en laboratorios clínicos alcanzar un límite de detección bajo pg/ml en plasma, sino límites a un destino por ensayo3,4,5. Microarrays de anticuerpos se han desarrollado para albergar miles de ensayos miniaturizados llevó a cabo en paralelo en un solo microscopio diapositiva6,7,8. Sin embargo, la capacidad de multiplexación de este método es limitada por reactividad cruzada basada en el reactivo, que surjan de la aplicación de una mezcla de lenguados, y llega a ser más problemático con un número creciente de objetivos9,10 , 11. Pla et al. han declarado que la vulnerabilidad resultante de un análisis multiplex emparedado escalas como 4N(N-1) donde N es el número de objetivos12.

Para mitigar la reactividad cruzada en microarrays de anticuerpos, anticuerpos colocalization microarrays (ACM) se ha desarrollado en nuestro laboratorio de ensayo sándwich multiplex12. Anticuerpos de captura (cAbs) son vistos en un substrato con un observador de microarrays. Después de bloqueo de las muestras se aplican en la superficie, y luego toques individuales son vistos en los mismos lugares con el complejo antígeno-cAb. Todos los escenarios de reactividad cruzada entre antígenos y anticuerpos pueden ser mitigados con ACM, y límites de detección en pg/mL se han logrado. Sin embargo, el protocolo de ensayo requiere preparación y manchado el dAbs durante los experimentos usando un spotter de microarray in situ con la alta precisión para propósito de la alineación, que es caro y consume tiempo, limitar la aplicación amplia de esta tecnología en otros laboratorios. Un mano ACM, llamado snap chip ha sido desarrollado para Cruz-reactivity-free y observador de tiro-libre multiplexar sandwich inmunoensayos13,14,15. Taxis y lenguados son pre-vistos en una diapositiva de ensayo y un tobogán de transferencia respectivamente en formato de microarrays y almacenados. Durante el ensayo, se recuperan las diapositivas y un microarray de lenguados son transferidos colectivamente en la diapositiva de ensayo simplemente chasquear las dos fichas juntos. Un aparato de presión se utiliza para la transferencia confiable reactivo. Portaobjetos de nitrocelulosa recubierto con una capacidad de enlace de anticuerpos relativamente grandes se han utilizado como las diapositivas ensayo para absorber las gotitas de líquido y así facilitar la transferencia de reactivo, sin embargo, las diapositivas son más caras que microarray y laminas de vidrio regular escáneres compatibles con diapositivas no transparentes son necesarios para la adquisición de señales.

En este trabajo, demostramos el protocolo de llevar a cabo un immunoensayo del emparedado multiplex con un chip de snap. Un aparato novedoso complemento ha sido desarrollado para la transferencia de reactivo más conveniente y confiable de microarray de microarrays. Aquí lo importante, hemos establecido el método de transferencia de reactivo sobre portaobjetos de vidrio ordinario con la viruta del cierre. 1024 puntos se transfirieron con éxito y alineados sobre un portaobjetos de vidrio, ampliando significativamente el uso de esta tecnología en la mayoría de los laboratorios.

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Protocol

1. fabricación y almacenamiento de snap chips

  1. método de transferencia simple ( Figura 1a)
    1. punto cAb soluciones que contengan 400 μg/mL anticuerpos y 20% de glicerol en solución salina tamponada con fosfato (PBS) sobre una nitrocelulosa (o un vidrio funcionalizado) diapositiva de ensayo con una de inyección de tinta microarray observador 13 en una humedad relativa de 60% (1.2 nL para cada punto) con espaciamiento de centro a centro de 800 μm. Asegúrese de que la diapositiva es fijada sobre la cubierta del observador según un ángulo (aquí, la esquina inferior izquierda fue utilizada).
    2. Incubar el portaobjetos manchada ensayo a temperatura ambiente durante 1 h con una humedad relativa de 60%.
    3. Abrazadera Junta módulo diapositivas con 16 compartimentos en la diapositiva de análisis para dividir en 16 pozos. Enjuagar el portaobjetos tres veces mediante la adición de 80 μl de PBS con un 0.1% Tween-20 (SAFT) en cada pozo y sacudiendo a 450 rpm en un agitador, 5 minutos cada vez.
    4. Añadir 80 μl de bloqueo para cada bien y agitar por 1 h a 450 rpm.
    5. Quite la Junta y secar el portaobjetos de ensayo con una corriente de nitrógeno.
    6. Fijar una diapositiva de transferencia en la cubierta del observador de tiro y empuje la parte inferior izquierda de la diapositiva contra la esquina inferior izquierda de la cubierta del observador. Tinta punto una amplia gama de marcas de alineación (una solución de micro-granos del poliestireno) con el mismo diseño que las cabinas de.
    7. Deje las marcas de alineación en seco. Tapa de la diapositiva de la transferencia y lo vuelva a colocar la cubierta de spotter, fijación contra la esquina inferior izquierda.
    8. Preparar el lenguado manchado las soluciones que contienen 20 μg/mL anticuerpos, glicerol al 20% y 1% de BSA.
    9. Usando el telescopio de ' s cámara, toma una foto de una marca de alineación. Implementar esta imagen en el programa de localización como una referencia y obtener el sistema de reconocimiento de imagen del telescopio de inyección de tinta para identificar la boya izquierda. Utilice sus coordenadas en el primer lugar de la matriz de dAb. Punto 8 nL por gota con un espaciamiento de centro a centro de 800 μm.
  2. Método de doble transferencia ( Figura 1b)
    1. colocar una diapositiva de transferencia 1 en la cubierta de quitamanchas de tinta contra la esquina inferior izquierda. Punto taxis soluciones que contengan 400 μg/mL anticuerpos, glicerol al 20% y 1% de BSA en PBS sobre la diapositiva con un spotter de microarray de inyección de tinta en una humedad relativa de 60% (0.4 nL para cada punto y ~ 200 μm de diámetro). El espaciamiento de centro a centro es 400 μm.
    2. Ajustar la transferencia con un recubrimiento de nitrocelulosa (o un vidrio funcionalizado) ensayo diapositiva usando un aparato de presión ( figura 2) para transferir las gotitas de la cabina en la diapositiva de ensayo.
      1. a su vez los seis botones laterales el aparato de presión por 90 grados y bloquear todos los elementos en la posición abierta. Insertar la diapositiva de transferencia en el soporte de diapositivas en su receptáculo con la esquina recortada hacia el perno del pogo fijo. La primera puesta de tres botones para liberar los émbolos con el perno del pogo oro y asegúrese de que las diapositivas son empujadas contra los pernos de alineación.
      2. Insertar un portaobjetos recubiertos con nitrocelulosa en el snap aparato boca abajo sentado en los 4 pines pogo. Gire el segundo conjunto de tres botones para liberar émbolos con el pin plata y asegúrese de que las diapositivas son empujadas contra los pernos de alineación.
      3. Cerrar el aparato de presión mediante la colocación de la carcasa superior del soporte de diapositivas utilizando la alineación pilares y huecos para un posicionamiento preciso.
      4. Inserte el aparato cerrado snap en su jaula y presione la pestaña de cierre completamente para los microarrays cara a cara mientras se aplica la presión adecuada. Mantener cerrada durante 1 minuto
    3. Separar las diapositivas. Incubar el portaobjetos de ensayo a temperatura ambiente durante 1 h con una humedad relativa de 60%. Lavar, bloquear y secar el portaobjetos de ensayo como se describe en pasos 1.1.3 - 1.1.5.
    4. Ponga otra diapositiva de la transferencia en la cubierta de quitamanchas de tinta y empuje contra la esquina inferior izquierda. DAb punto soluciones que contienen 50 o 100 μg/mL de anticuerpos (ver tabla 1), glicerol al 20% y 1% de BSA en PBS. Asegurarse de que cada punto es 0.8 nL y el espaciamiento de centro a centro entre puntos es de 400 μm.
    5. Tienda el ensayo y la diapositiva de la transferencia. Análisis y transferencia de diapositivas en una bolsa hermética que contenga desecante del sello y puso en un congelador de-20 ° C.

2. Multiplexado de inmunoensayos con snap chips

  1. recuperar la diapositiva de prueba del congelador. Deja la bolsa sellada durante 30 minutos hasta que el carro llega a temperatura ambiente.
  2. Prepare 7 puntos serie diluida soluciones muestra por clavar las proteínas en PBS que contenga 0.05% Tween-20.
    Nota: Aquí, se utiliza un factor de 5-fold dilución. Las concentraciones de partida para cada proteína se enumeran en la tabla 1.
  3. Preparar soluciones de muestra según el caso. Por ejemplo, diluir el suero humano 4 veces en buffer de SAFT.
  4. Abrazadera de una Junta de compartimiento 16 en la diapositiva ensayo.
  5. Llenar una columna de 8 pocillos con las soluciones de dilución de 7 proteína y una solución de tampón de SAFT proteínas mediante pipeteo. Pipetear las soluciones muestra en los otros pozos de 8 en la diapositiva misma.
    Nota: se pueden caber 80 soluciones μL en cada pozo. Más diapositivas pueden utilizarse para medir muestras adicionales cuando sea necesario.
  6. Incubar las muestras en un agitador a 450 rpm por 1 h a temperatura ambiente o para pasar la noche a 4 ° C. lavado el carro tres veces con SAFT en el agitador a 450 rpm, 5 minutos cada vez. Retire la Junta y secar el portaobjetos bajo una corriente de gas nitrógeno.
  7. Recuperar el carro de transferencia con toques del congelador. Mantener la bolsa sellada durante 30 min a temperatura ambiente. Luego, incubar el portaobjetos en una cámara cerrada (por ejemplo caja de consejos vacíos) que contiene granos de estabilización de humedad de 60% por 20 min para la rehidratación.
  8. Ajustar el carro de transferencia con la diapositiva de ensayo usando un aparato de presión ( figura 2) para transferir las gotitas de dAb. Ver sección 1.2.2 para el funcionamiento de los aparatos de presión.
  9. Separar las diapositivas. Incubar el portaobjetos de ensayo en una cámara cerrada que contiene granos de estabilización de humedad de 60% para h. 1 abrazadera de la diapositiva de ensayo con un empaque de 16 compartimentos y enjuagar el portaobjetos 4 veces con SAFT en un agitador a 450 rpm, 5 minutos cada vez.
  10. Pipeta 80 μl de las soluciones que contienen 2,5 fluoróforo estreptavidina μg/mL en PBS a cada pocillo. Incubar por 20 min en un agitador a 450 rpm.
  11. Enjuague la diapositiva 3 veces con Saft y una vez con agua destilada en el agitador a 450 rpm. Retire la Junta y secar el portaobjetos usando nitrógeno gas.

3. Deslice la exploración y análisis de datos

  1. analizar la diapositiva de prueba con un scanner de microarrays de fluorescencia usando el láser de 635 nm.
  2. Extraer la intensidad neta de cada punto mediante un análisis software (e.g. matriz pro analyzer) 16.
  3. Calcular el límite de detección (LOD) de cada proteína utilizando un software estadístico y determinar las concentraciones de proteína en las muestras de.
    Nota: El LOD se define como la intersección de la norma cuincrementado en tres veces la desviación estándar de tres ensayos independientes RVE.

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Representative Results

El procedimiento del ensayo de single y doble métodos de transferencia se muestra en la figura 1. En una transferencia, los taxis son vistos directamente en la diapositiva de ensayo y los lenguados se transfieren en la diapositiva de ensayo al uso en forma de espejo de los taxis (Figura 1a). Procedimiento de solo transferencia se requiere, pero este método sufre de desalineación entre los dos microarrays, causada principalmente por el desalineamiento angular entre la diapositiva y del puente de la chorro de tinta (figura 2). Un enfoque para abordar este desafío es a taxis y lenguados secuencialmente en la diapositiva de ensayo después de localizar y fijar correctamente las diapositivas en el aparato de presión (Figura 1b). Usando este método, ambos microarrays son transferidos a la misma posición exacta. Ningún marcador de sistema o alineación de reconocimiento de imagen se requiere para el método de doble transferencia. El desalineamiento el 98% de los puntos fue de 41 μm, 6-fold mejora en comparación con el método de transferencia solo14.

El aparato de presión ha sido diseñado para ser fácil de usar sin ningún entrenamiento y minimizar el riesgo de desalineamiento de la matriz. Las diapositivas son llevadas junto con colocación exacta gracias a pernos de alineación común para el análisis y transferencia de diapositivas. La diapositiva de transferencia es un poco más pequeña para caber debajo de la diapositiva de ensayo cuando suspendió el pogo las clavijas, hasta que el aparato de presión está cerrado. Un espaciador es incluido en la diapositiva de transferencia manteniendo una brecha de tamaño micrométrico que permite transferencia confiable de la gotita a la diapositiva de cristal. Por último, la jaula y su lengüeta del encierro están diseñados para aplicar la presión necesaria para la transferencia de efectivo en cada complemento para transferencia reproducibles y de alta calidad. Una foto de los aparatos de presión se muestra en la figura 3.

Imágenes representativas que ilustran los resultados de la transferencia del reactivo sobre un portaobjetos de nitrocelulosa y un portaobjetos de vidrio se muestran en la figura 4. Alexa 532 etiquetado depósitos fueron utilizados como el primer reactivo, y Alexa 647 etiquetado depósitos fueron utilizados como el segundo reactivo. Después de la transferencia, la diapositiva fue analizada con 532 nm y 635 nm láseres. El resultado muestra que 3136 (para el portaobjetos de nitrocelulosa) o 1024 (para el portaobjetos de cristal) microspots fueron transferidos con cero falta en las diapositivas de ensayo y ninguna contaminación cruzada fue observada a transferir el reactivo de segunda. Cuando se utilizan laminas de vidrio, es posible crear más superficie de funcionalización, así reduciendo el tamaño de cada punto y disminuir la distancia de punto a punto para la transferencia de un mayor número de puntos. Este trabajo amplía la aplicación de la tecnología de chip de snap a substratos de vidrio utilizado.

Curvas estándar de un cáncer de mama dirigida a 50-plex inmunoensayo relacionadas con proteínas se ilustran en la figura 5, correspondiente al microarray de anticuerpo sandwich múltiplex más grande hasta la fecha sin reactividad cruzada. Método de doble transferencia fue utilizado en este ensayo, la diapositiva fue analizada y se cuantificó la intensidad de fluorescencia para generar las curvas estándar. proteínas de 35 clientes de los 50 llegó a LODs pg/ml (ver tabla 1) y puede mejorarse aún más mediante la optimización de las condiciones de ensayo. Colocalización de reactivos facilita el uso de múltiples pares de anticuerpos en una sola diapositiva sin reactividad cruzada y permite la optimización de cada par independientemente con la no interferencia de otros pares12. Estos resultados indican que chip snap es una tecnología escalable que puede utilizarse para la cuantificación de proteína multiplexados.

Figure 1
Figura 1. Esquema de procedimiento de análisis que comparan solo (a) y (b) doble transferencia métodos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2. Esquema que muestra las diferencias entre simple y doble transferencia. (a) reflejo de los reactivos de transferencia amplifica el desalineamiento angular entre la diapositiva y el XY de inyección de tinta. (b) transferencia de doble método supera la desalineación angular. Adaptado de referencia 14 con permiso. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3. Foto de los aparatos de presión. (a) abrir el dispositivo. (b) dispositivo cerrado. (c) perspectiva del dispositivo. Brevemente, () transfiera el portaobjetos se coloca en el soporte de diapositivas y empujado contra las clavijas de alineación con el pogopin montado en émbolos. (ii) las diapositivas de ensayo se colocan encima de la pogopins y empujadas contra las clavijas de alineación con un segundo conjunto de elementos. (iii) la carcasa superior es colocada sobre el soporte de diapositivas y se inserta en la jaula. Se aplica una presión usando la pestaña de cierre para comprimir el pogopin y unir las diapositivas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4. Traslado de puntos usando un chip de un broche de presión. Análisis de fluorescencia con 532 nm y 633 lasers del nanómetro para demostrar la transferencia de anticuerpos en un (a) nitrocelulosa (b) vidrio diapositiva y diapositiva (adaptado de referencia 14 con permiso). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5. Imagen de fluorescencia de una diapositiva de prueba y curvas estándar de 50 proteínas medición en paralelo utilizando el método de doble transferencia. (a) imagen de de la fluorescencia de una guía de análisis para generar una curva estándar. (b) primer plano de una matriz. Barra de escala = 2 mm. (c) estándar curvas de 50 proteínas. Barras de error se calcularon las desviaciones estándar de tres experimentos independientes. Adaptado de referencia 14 con permiso. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Nombre de la proteína A partir de concentración (ng/ml) LOD (pg/ml) Nombre de la proteína A partir de concentración (ng/ml) LOD (pg/ml)
ANG2 500 1.3 × 104 IL-6b 1 2.1 × 102
BDNF 500 1,0 × 102 IL-5 50 77 CA 15-3 * 1 4.9 × 103 IL-4 1000 1,5 × 104 CEA 1000 5.4 × 103 IL-2 50 76 CXCL10, IP-10 50 1,7 × 102 LEP 200 4.0 x 102 CRP 200 44 MIG 500 11 × 102 ENG 1000 6.2 × 102 CCL3/MIP-1Α 50 3.3 EGF 50 de 1,8 × 102 CCL4/MIP-1Β 50 12 EGFR 200 1,9 × 102 MMP-3 500 1,0 × 102 FAS-L 500 4,5 × 102 M-CSF 500 8.2 × 103 FGF 500 1,0 × 103 MMP-9 200 3.1 × 102 G-CSF 500 39 CCL2, MCP-1 50 55 GM-CSF 50 3.8 NCAM-1 500 1,7 × 103 GRO-Α 50 de 3.0 × 102 Β-NGF 200 1,4 × 103 HER2 500 3.5 x 103 NT-3 200 5,8 x 102 PDGF-BB 200 73 OPN 500 1,9 × 103 IL-1Β 500 7,9 x 102 RBP4 200 1,2 × 102 IL-1ra 200 1.1 × 103 SPARC 1000 4.6 × 104 IL-15 50 8.2 × 102 TNF-Α 50 4.4 IL-12 1 30 TNF-RI 50 1.3 × 102 IL-11 500 1,2 × 103 TNF-RII 50 12 IL-10 500 6.1 × 102 FAS/TNFRSF6 200 2,8 × 102 IL-8 50 6.6 uPA 200 24 IL-7 2.5 26 uPAR(CD87) 200 76 IL-6un 1000 84 VEGF 200 6,7 × 102

Tabla 1. Las concentraciones de proteína y LODs en tampón de ensayo 50-plex. El LDD de CA 15-3 es en U/ml (*). Adaptado de referencia 14 con permiso.

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Discussion

En este trabajo, hemos presentado una tecnología de chip de complemento que hace las immunoassays multiplex Cruz-reactivity-free ampliamente disponible para los investigadores con configuración experimental básica. A diferencia de los microarrays de anticuerpos, ningún observador de microarrays es necesario para los usuarios finales. Se demuestran solo y métodos de transferencia de doble, y doble transferencia ofrece exactitud de la alineación superior a ~ 40 μm para los puntos del 98%, con el desalineamiento mayor de 63 μm14. Fue desarrollado un aparato novedoso complemento para ajustar convenientemente los dos portaobjetos con presión constante, haciendo esta tecnología accesible a los investigadores. Transferencia confiable reactivo se realiza no sólo en portaobjetos recubiertos con nitrocelulosa, sino también en las diapositivas de vidrio ordinario, ampliando significativamente la aplicación de esta tecnología sin la necesidad de un entrenamiento extensivo. Para demostrar la utilidad de la viruta del cierre, un inmunoensayo de plex 50 se llevó a cabo usando las diapositivas previamente manchados y almacenados, y el 70% de las proteínas logrado LODs en la gama de pg/mL14. En comparación con los inmunoensayos multiplexores que lenguados se aplican como una mezcla, un beneficio importante de la ACM y la tecnología de chip de complemento es que los ensayos en un chip son independientes entre sí, permitiendo añadir o eliminar cualquier par de anticuerpo sin interferir con otras parejas. Decenas a cientos de proteínas pueden medirse simultáneamente con un chip rápido, acortando el tiempo de ensayo en comparación con otros métodos como la medición automatizada de serial por incubación secuencial que requiere aplicación de serie de cada anticuerpo 17. Sólo sub-nanoliter de cada anticuerpo es necesario para la fabricación de la viruta del complemento, lo que es más económico que los inmunoensayos convencionales.

Las concentraciones de anticuerpo utilizadas y los pasos de incubación de antígeno son críticos para alcanzar la sensibilidad del ensayo alta. En la fabricación de los chips del broche de presión, concentración de anticuerpo puede ser optimizado dependiendo de la afinidad de los pares de anticuerpos y los tipos de las diapositivas de ensayo (nitrocelulosa o no nitrocelulosa). Los volúmenes de cada punto del anticuerpo pueden ser ajustados en base a la capacidad del observador de tiro y la exactitud de la alineación y la separación centro a centro entre los puntos se puede cambiar por consiguiente. Después de transferir los taxis a la diapositiva de ensayo, incubamos la diapositiva de ensayo a temperatura de incubación durante la noche de 1 h. a 4 ° C podría dar mejor capacidad de unión del anticuerpo. BSA estabilizador gratis soluciones (ver la tabla de materiales) fueron utilizadas aquí para bloquear la corredera de ensayo después de la incubación de taxis. Otros reactivos bloqueo como leche o suero animal también pueden funcionar para esta aplicación.

En los inmunoensayos multiplexados, protocolos para portaobjetos de nitrocelulosa no con química de superficies diferentes pueden ser desarrollados y optimizados. Un factor de dilución diferentes puede ser utilizado para hacer curvas estándar dependiendo de las proteínas blanco. Fluoróforos diferentes pueden utilizarse para etiquetar dAbs y la diapositiva puede analizarse usando un láser a una longitud de onda diferentes para la recogida de la señal.

En la actualidad, se ha logrado una densidad de 625 puntos/cm2 con doble transferencia método14. Para mejorar aún más la capacidad de multiplexación de la viruta del cierre, varias estrategias están disponibles. En primer lugar, los volúmenes más pequeños pueden utilizarse para reducir el tamaño de las manchas, permitiendo así más corta distancia centro a centro entre puntos y aumento de la matriz densidad. En segundo lugar, se puede elegir una diapositiva de transferencia con una superficie más para reducir el tamaño del spot. En tercer lugar, mejor alineación entre los dos microarrays puede lograrse realizando ajuste fino del telescopio de inyección de tinta, y además optimizar el telescopios parámetros como la distancia entre boquillas y la superficie del portaobjetos.

En cuanto a los inmunoensayos basados en anticuerpos, el rendimiento del inmunoensayo de chip de snap es sujeto a la disponibilidad y calidad de los anticuerpos. El chip de cierre funciona mediante un formato de ensayo sándwich, que es el formato de ensayo más ampliamente utilizado en ELISA debido a la alta sensibilidad y especificidad de la Unión dual, secuencial de un par de anticuerpos dirigidos a diferentes epítopes, pero depende la disponibilidad de un par de anticuerpos compatibles necesarios para la captura y detección de la proteína diana.

Se establece el valor de la tecnología de chip de snap para inmunoensayos, y se espera que puede ser utilizado para reacciones químicas y bioquímicas que requieren aplicar diferentes reactivos sin contaminaciones cruzadas18,19 , 20 , 21 , 22. en realidad, el chip de cierre proporciona una solución general a entregar diversos reactivos de la moteada de microarrays para microarrays, desmarcando así la fabricación de la viruta con el procedimiento del ensayo y por lo tanto ayuda a hacer frente a la " entretela de macro a micro"desafío23. Por ejemplo, el chip de complemento se ha utilizado para un ensayo de inhibición enzimática homogénea 4-plex para analizar 128 condiciones con tiempos precisos y resultados comparables a los experimentos de gran volumen14. También se ha aplicado para la tinción de tejido multiplexado. Además, puede contribuir a aplicaciones para probar miles de productos químicos en diferentes bacterias o células, unicelular análisis21,24, o probar diferentes condiciones en química simple o multi-step de detección de drogas reacciones.

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Disclosures

La Universidad de McGill ha presentado una solicitud de patente en algunos aspectos de este trabajo con Li Huiyan y David Juncker como inventores.

Acknowledgments

Agradecemos al Dr. Rob Sladek el uso del telescopio de inyección de tinta. Reconocemos el apoyo final de los institutos canadienses de investigación de la salud (CIHR), la Ciencia Natural e Ingeniería investigación Consejo de Canadá (NSERC), el Instituto canadiense de investigación de sociedad de cánceres y la Fundación Canadá para la innovación (CFI). D.J. gracias apoyo de una Cátedra de investigación de Canadá.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phosphate buffered saline tablet Fisher Scientific 5246501EA
Streptavidin-conjugated Cy5 Rockland s000-06
Tween-20 Sigma-Aldrich p1379
Bovine serum albumin Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc 001-000-162
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
Blocking solution: BSA-free StabilGuard Choice Microarray Stabilizer SurModics, Inc SG02
Nitrocellulose coated slides Grace Bio-Laboratories, Inc 305116
Aminosilane coated slides Schott North America 1064875
Snap Device Parallex BioAssays Inc. PBA-SD01
Inkjet microarray spotter GeSiM Nanoplotter 2.0
Slide module gasket Grace Bio-Laboratories, Inc 204862
Humidity Stabilization Beads Parallex BioAssays Inc. PBA-HU60
Array-Pro Analyzer software Media Cybernetics Version 4.5
Fluorescence microarray scanner Agilent SureScan Microarray Scanner
Biostatistics software GraphPad Software GraphPad Prism 6
Endoglin capture antibody R&D Systems MAB10972
Endoglin protein R&D Systems 1097-EN
Endoglin detection antibody R&D Systems BAF1097
IL-6a (see Table 1) R&D Systems
IL-6b (see Table 1) Invitrogen

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References

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Inmunoensayos de bioingeniería número 129 de Sandwich anticuerpos multiplexados Cruz-reactivity-free libre de spotter complemento chip
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Li, H., Bergeron, S., Larkin, H., Juncker, D. Snap Chip for Cross-reactivity-free and Spotter-free Multiplexed Sandwich Immunoassays. J. Vis. Exp. (129), e56230, doi:10.3791/56230 (2017).

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