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Immunology and Infection

साइट उत्पंन करने के लिए एक सतही प्रोटोकॉल-विशेष रूप से ई कोलाई में Acetylated प्रोटीन

Published: December 9, 2017 doi: 10.3791/57061
Automatic Translation
1,2, 3, 4, 1, 1,2
1Department of Chemistry and Biochemistry, University of Arkansas, 2Cell and Molecular Biology Program, University of Arkansas, 3Department of Biological Sciences, University of Arkansas, 4Fayetteville High School

Summary

आनुवंशिक कोड विस्तार प्रोटीन acetylation सहित जैविक प्रक्रियाओं की एक विस्तृत श्रृंखला का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण के रूप में कार्य करता है । यहाँ हम एक सतही प्रोटोकॉल का प्रदर्शन करने के लिए इस तकनीक का दोहन करने के लिए विशिष्ट साइटों में homogeneously acetylated प्रोटीन पैदा करने के लिए ई कोलाई कोशिकाओं.

Abstract

प्रोटीन के विशिष्ट पदों पर होने वाले पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों में सेलुलर प्रक्रियाओं की एक किस्म में महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए दिखाया गया है । उनमें से, प्रतिवर्ती lysine acetylation सबसे व्यापक रूप से जीवन के सभी डोमेन में वितरित में से एक है । हालांकि कई मास स्पेक्ट्रोमेट्री-आधारित acetylome अध्ययन किया गया है, इन ख्यात acetylation लक्ष्य के आगे लक्षण वर्णन सीमित किया गया है । एक संभावित कारण यह है कि यह सबसे क्लासिक जैव रासायनिक दृष्टिकोण से वांछित पदों पर विशुद्ध रूप से acetylated प्रोटीन उत्पंन करने के लिए मुश्किल है । इस चुनौती को दूर करने के लिए, आनुवंशिक कोड विस्तार तकनीक को एक इंजीनियर pyrrolysyl-tRNA synthetase वैरिएंट की जोड़ी का उपयोग करने के लिए लागू किया गया है, और इसके cognate tRNA से Methanosarcinaceae प्रजातियों, cotranslational को प्रत्यक्ष करने के लिए ब्याज की प्रोटीन में विशिष्ट साइट पर acetyllysine की । citrullinated acetylation के अध्ययन में पहले आवेदन के बाद, इस दृष्टिकोण प्रोटीन की एक किस्म पर acetylation अध्ययन की सुविधा है । इस काम में, हम एक सतही प्रोटोकॉल का प्रदर्शन के लिए साइट का उत्पादन विशेष रूप से acetylated प्रोटीन मॉडल जीवाणु मेजबान के रूप में ई कोलाई का उपयोग करके । Malate डिहाइड्रोजनेज इस काम में एक प्रदर्शन उदाहरण के रूप में इस्तेमाल किया गया था ।

Introduction

प्रोटीन के बाद अनुवाद संशोधन (PTMs) अनुवाद प्रक्रिया के बाद होते हैं, और कार्यात्मक समूहों के एमिनो एसिड अवशेषों को आबंध अलावा से उठता है, लगभग सभी जैविक प्रक्रियाओं में महत्वपूर्ण भूमिका निभा रहा है, जीन सहित प्रतिलेखन, तनाव प्रतिक्रिया, सेलुलर भेदभाव, और चयापचय1,2,3। तिथि करने के लिए, के बारे में ४०० विशिष्ट PTMs की पहचान की गई है4। जीनोम और proteome के intricacy प्रोटीन PTMs द्वारा एक काफी हद तक परिलक्षित है, के रूप में वे प्रोटीन गतिविधि और स्थानीयकरण को विनियमित, और प्रोटीन, न्यूक्लिक एसिड, लिपिड, और cofactors के रूप में अंय अणुओं के साथ बातचीत को प्रभावित5।

प्रोटीन acetylation पिछले दो दशकों6,7,8,9,10,11,12में PTMs अध्ययन में सबसे आगे रहा है । Lysine acetylation पहले histones में अधिक से अधिक ५० साल पहले की खोज की थी13,14, अच्छी तरह से छानबीन किया गया है, और अधिक से अधिक ८० प्रतिलेखन कारकों, नियामकों में अस्तित्व में जाना जाता है, और विभिंन प्रोटीन15, 16,17. प्रोटीन acetylation पर अध्ययन न केवल हमें अपने विनियामक तंत्र की गहरी समझ के साथ प्रदान की है, लेकिन यह भी बेकार acetylation की वजह से रोगों की एक संख्या के लिए निर्देशित उपचार18,19, 20 , 21 , 22 , 23. यह माना जाता था कि lysine acetylation केवल eukaryotes में होता है, लेकिन हाल के अध्ययनों से पता चला है कि प्रोटीन acetylation भी बैक्टीरियल फिजियोलॉजी में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, chemotaxis सहित, एसिड प्रतिरोध, सक्रियण, और स्थिरीकरण pathogenicity आइलैंड्स और अन्य डाह संबंधित प्रोटीन्स24,25,26,27,28,29.

एक सामांय रूप से इस्तेमाल किया विधि जैव रासायनिक lysine acetylation विशेषताएं साइट का उपयोग कर रहा है-निर्देश mutagenesis । Glutamine अपने समान आकार और ध्रुवीयता की वजह से acetyllysine की नकल के रूप में प्रयोग किया जाता है । Arginine एक गैर acetylated lysine नकल के रूप में उपयोग किया जाता है, क्योंकि यह शारीरिक स्थितियों के तहत अपने सकारात्मक आरोप को बरकरार रखता है, लेकिन acetylated नहीं हो सकता । हालांकि, दोनों की नकल असली isosteres नहीं है और हमेशा की उंमीद परिणाम30उपज नहीं है । सबसे कठोर दृष्टिकोण विशिष्ट lysine अवशेषों पर homogeneously acetylated प्रोटीन उत्पन्न करना है, जो प्रकृति7,11में lysine acetylation के कम stoichiometry के कारण अधिकांश शास्त्रीय विधियों के लिए कठिन या असंभव है । इस चुनौती आनुवंशिक कोड विस्तार की रणनीति है, जो एक इंजीनियर pyrrolysyl-tRNA synthetase संस्करण Methanosarcinaceae प्रजातियों से tRNA के साथ Pylacetyllysine प्रभारी को रोजगार से सुलझाया गया है, मेजबान का उपयोग mRNA में UAG stop codon को दबाने के लिए शोधों मशीनरी, और लक्ष्य प्रोटीन की डिज़ाइन की गई स्थिति में acetyllysine का निगमन31का निर्देशन करता है । हाल ही में, हमने एक बेहतर EF-Tu-बाइंडिंग tRNA३२ और अपग्रेडेड acetyllysyl-tRNA synthetase३३के साथ इस सिस्टम को ऑप्टिमाइज़ किया है । इसके अलावा, हम malate डिहाइड्रोजनेज३४ और tyrosyl-tRNA synthetase३५के acetylation अध्ययन में इस बढ़ाया निगमन प्रणाली लागू किया है । इस के साथ साथ, हम malate डिहाइड्रोजनेज (MDH), जो हम बड़े पैमाने पर एक प्रदर्शन उदाहरण के रूप में अध्ययन किया है का उपयोग करके जैव रासायनिक पहचान के लिए आणविक क्लोनिंग से शुद्ध रूप से acetylated प्रोटीन पैदा करने के लिए प्रोटोकॉल का प्रदर्शन ।

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Protocol

1. साइट-लक्ष्य जीन का निर्देशन Mutagenesis

नोट: MDH T7 प्रमोटर के अंतर्गत व्यक्त की है केएमएफ-1 सदिश के साथ CloDF13 मूल और एक प्रति संख्या के साथ 20 में ४०३४।

  1. परिचय १४० स्थिति पर एंबर बंद codon प्राइमरों द्वारा जीन में (आगे प्राइमर: GGTGTTTATGACटैगAACAAACTGTTCGGCG और रिवर्स प्राइमर: GGCTTTTTTCAGCACTTCAGCAGCAATTGC), साइट के निर्देश mutagenesis किट के बाद ।
  2. इस टेंपलेट प्लाज्मिड जंगली प्रकार के जीन युक्त malate dehydratase बढ़ाना, और पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया (पीसीआर) प्रतिक्रिया द्वारा रोक codon उत्परिवर्तन डालें । प्रतिक्रिया मिश्रण में, 2x डीएनए पोलीमरेज़ एंजाइम मिश्रण, १.२५ µ एल के 10 µ एम आगे प्राइमर के १२.५ µ एल शामिल हैं, १.२५ µ एल के 10 µ मीटर रिवर्स प्राइमर, 1 µ एल ऑफ टेम्पलेट डीएनए (20 एनजी/µ एल) (केएमएफ-1 प्लाज्मिड जंगली-प्रकार MDH के जीन युक्त), और µ के 9 nuclease एल-मुक्त पानी ।
    1. पीसीआर रिएक्शन पैरामीटर्स का उपयोग निम्नानुसार करें: 30 s के लिए ९८ ° c पर प्रारंभिक विकार; ९८ डिग्री सेल्सियस पर 10 एस के 25 चक्र, ५५ डिग्री सेल्सियस पर 30 एस, और ७२ डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट; 3 मिनट के लिए ७२ डिग्री सेल्सियस पर अंतिम विस्तार । पीसीआर के बाद, प्रवर्धित सामग्री सीधे कळेनासे-Ligase-DpnI एंजाइम मिश्रण किट से circularization और टेम्पलेट हटाने के लिए कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए जोड़ें ।
      नोट: प्रतिक्रिया मिश्रण पीसीआर उत्पाद के 1 µ एल, 2x प्रतिक्रिया बफर के 5 µ एल, 10x कळेनासे के 1 µ एल-Ligase-DpnI एंजाइम मिश्रण, और µ के 3 nuclease एल-मुक्त पानी शामिल हैं ।
  3. किट से 25 µ l गल सक्षम ई. कोलाई DH5α कोशिकाओं की ट्यूब के लिए प्रतिक्रिया मिश्रण के 5 µ एल जोड़ें । सावधानी से झटका ट्यूब मिश्रण करने के लिए, और बर्फ पर 30 min. Heat सदमे के लिए मिश्रण जगह 30 एस के लिए ४२ ° c पर मिश्रण, और अतिरिक्त 5 मिनट के लिए बर्फ पर जगह है ।
    1. पिपेट ६०० µ कमरे के तापमान के एल मिश्रण में किट से Catabolite दमन (समाज) मीडिया के साथ सुपर इष्टतम शोरबा, २५० rpm पर मिलाते के साथ ६० मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर गर्मी, एक lysogeny शोरबा (पौंड) पर फैल १०० µ l इसी एंटीबायोटिक के साथ प्लेट आगर , और २५० rpm पर मिलाते के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर रात भर गर्मी ।
  4. इसी एंटीबायोटिक के साथ 6 मिलीलीटर ताजा पौंड मीडिया में 4-6 एकल कालोनियों उठाओ, और २५० rpm पर मिलाते के साथ रातोंरात ३७ डिग्री सेल्सियस पर गर्मी । प्लाज्मिड शुद्धि किट द्वारा प्रत्येक रात संस्कृति से plasmids निकालें, निर्माता के मैनुअल निंनलिखित, तो सेवा प्रदाता के प्रोटोकॉल के अनुसार डीएनए अनुक्रमण के लिए plasmids भेजने के लिए सही स्थिति में codon उत्परिवर्तन रोकने की पुष्टि करें ।
  5. 1 मिलीलीटर रातोंरात संस्कृति और ३०० µ एल १००% DMSO मिश्रण से-८० ° c पर सही अनुक्रम के साथ तनाव की दुकान ।

2. Acetylated प्रोटीन की अभिव्यक्ति

  1. अनुकूलित acetyllysyl के जीन डालें-tRNA synthetase३३ और अनुकूलित tRNAPyl ३२ में pTech प्लाज्मिड । tRNA synthetase जीन को गठित lpp प्रवर्तक के अंतर्गत रखें । tRNA जीन को गठित proK प्रवर्तक३४के अंतर्गत रखें ।
    1. सह रूपांतरित टैग-malate डिहाइड्रोजनेज के जीन युक्त, और प्लाज्मिड अनुकूलित acetyllysine निगमन प्रणाली बंदरगाह, 25 µ एल गल में सक्षम ई. कोलाई BL21 (DE3) कोशिकाओं से युक्त३४ अभिव्यक्ति वेक्टर रूपांतरण 10 एस के लिए ४२ डिग्री सेल्सियस पर गर्मी सदमे, और अतिरिक्त 5 मिनट के लिए बर्फ पर जगह है ।
    2. पिपेट ६०० µ मिश्रण में कमरे के तापमान समाज मीडिया के एल, २७५ rpm पर मिलाते के साथ ६० मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर गर्मी, १०० µ जी के साथ एक थाली पर १०० µ एल प्रसार/एमएल streptomycin और ५० µ जी/एमएल क्लॉरॅंफेनिकोल, और ३७ rpm पर मिलाते हुए के साथ २७५ डिग्री सेल्सियस पर रात भर गर्मी ।
  2. थाली से एक एकल कॉलोनी उठाओ, और लगाना 15 मिलीलीटर १०० µ जी के साथ ताजा पौंड मीडिया में/एमएल streptomycin और ५० µ जी/एमएल क्लॉरॅंफेनिकोल में एक ५० मिलीलीटर ट्यूब पर रात भर ३७ ° c के साथ मिलाते हुए २५० rpm की गति से । एक 1 एल कुप्पी में एंटीबायोटिक दवाओं के साथ ३०० मिलीलीटर ताजा पौंड मीडिया के लिए 15 मिलीलीटर रातोंरात संस्कृति हस्तांतरण, और २५० rpm पर मिलाते के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर गर्मी ।
  3. पानी के साथ acetyllysine भंग १०० mM स्टॉक समाधान बनाने के लिए, 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर । 5 मिमी acetyllysine और 20 मिमी nicotinamide (deacetylases के अवरोधक) वृद्धि मीडिया को जोड़ने जब अवशोषक ६०० एनएम पर ०.५ तक पहुंचता है ।
    1. ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक अतिरिक्त 1 ज के लिए कोशिकाओं को विकसित, २५० rpm पर मिलाते हुए, तो प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए ०.५ mM IPTG जोड़ने के लिए, और 25 डिग्री सेल्सियस रात भर में कोशिकाओं को बढ़ने, १८० rpm पर मिलाते के साथ ।
      नोट: अभिव्यक्ति शर्तों अलग प्रोटीन के लिए अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है ।
  4. 15 मिनट के लिए 4 ° c पर ३,००० x g पर केंद्रापसारक द्वारा इकट्ठा कोशिकाओं, supernatant को छोड़ें और फॉस्फेट-बफ़र्ड खारा (पंजाब) बफ़र (10 mm Na2HPO4, १.८ mm KH2PO4, १३७ mm NaCl, २.७ mm KCl) के साथ सेल छर्रों को धो लें । 5 मिनट के लिए 4 ° c पर १०,००० x g पर धोया कोशिकाओं को इकट्ठा, supernatant त्यागें, और सेल छर्रों-८० डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।

3. Acetylated प्रोटीन का शुद्धिकरण

  1. पिघल बर्फ पर जमे हुए सेल छर्रों, और lysis बफर के 15 मिलीलीटर (५० mm tris (hydroxymethyl) aminomethane (tris) पीएच ७.८, ३०० मिमी NaCl, 20 मिमी imidazole, और 20 मिमी nicotinamide), 5 µ एल के β-mercaptoethanol और 1 µ एल Benzonase nuclease (२५० इकाइयों) के साथ पुनः निलंबित ।
  2. ४० kHz sonication द्वारा ७०% बिजली उत्पादन में 10 एस कम फटने के 10 चक्र के साथ तोड़ कोशिकाओं, कच्चे तेल निकालने के रूप में ठंडा करने के लिए 30 एस के अंतराल के बाद । 4 डिग्री सेल्सियस पर 25 मिनट के लिए २०,००० x g पर कच्चे तेल निकालने केंद्रापसारक । ०.४५ µm झिल्ली फिल्टर के साथ supernatant फिल्टर, और एक स्तंभ में लोड निकल के 1 मिलीलीटर-nitrilotriacetic एसिड (Ni-NTA) राल equilibrated 20 मिलीलीटर पानी के साथ और lysis बफर के 20 मिलीलीटर ।
    नोट: कोशिकाओं को भी हल्के डिटर्जेंट द्वारा तोड़ा जा सकता है, अगर sonication उपलब्ध नहीं है ।
  3. वॉश बफर के 20 मिलीलीटर (५० mm Tris पीएच ७.८, ३०० mm NaCl, ५० mm imidazole, और 20 mm nicotinamide) के साथ कॉलम धो, और फिर रेफरेंस बफर के 2 मिलीलीटर (५० मिमी elute पीएच ७.८, ३०० मिमी Tris, १५० मिमी NaCl, और 20 मिमी imidazole) के साथ nicotinamide ।
  4. पीडी-10 कॉलम द्वारा साल्टिंग बफर (25 एमएम Tris नं० ७.८ और 10 एमएम NaCl) के साथ-साथ इस रेफरेंस अंश को निर्माता के मैनुअल का पालन करें । ब्रैडफोर्ड प्रोटीन परख रिएजेंट के निर्देश का पालन करके eluted प्रोटीन की एकाग्रता को मापने । आगे के प्रयोगों के लिए नमकीन प्रोटीन तैयार होता है ।
    नोट: प्रोटीन का ५०% ग्लिसरॉल शेयर करें, और भंडारण के लिए में-८० डिग्री सेल्सियस रखें ।

4. Acetylated प्रोटीन के जैव रासायनिक लक्षण वर्णन

  1. एसडीएस-पृष्ठ तथा मास स्पेक्ट्रोमेट्री िरा ।
    1. सोडियम dodecyl सल्फेट (एसडीएस) नमूना बफर के साथ प्रकृति प्रोटीन (5 µ एल प्रोटीन नमूना 2 µ एल 4x एसडीएस नमूना बफर के साथ) में एक 2 मिलीलीटर ट्यूब में १०५ ° c 5 मिनट के लिए, 10 एस के लिए २००० x g पर मिश्रण केंद्रापसारक, 4-20% सोडियम dodecyl सल्फेट polyacrylamide जेल पर लोड electroph oresis (एसडीएस-PAGE) जेल, और 30 मिनट के लिए २०० V पर चलाने के लिए ।
    2. आसुत जल के साथ जेल धो और 5 मिनट के लिए धीरे से हिला, प्रक्रिया दोहरा 3 बार । पानी त्यागें, और Coomassie नीले दाग के साथ जेल दाग 1 एच के लिए कोमल मिलाते के साथ । de-आसुत पानी के साथ जेल दाग, 30 मिनट के लिए धीरे से हिला, और इस de-3 बार दाग दोहराएं ।
    3. Coomassie नीले दाग एसडीएस-पृष्ठ जेल पर ३३ केडीए पर बैंड कट, और यह जन स्पेक्ट्रोमेट्री सुविधाओं या कंपनियों के लिए भेज acetyllysine की पुष्टि करने के लिए डिजाइन की स्थिति में शामिल किया गया था ।
      नोट: मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के प्रोटोकॉल ने पिछला प्रयोग३४के बाद किया था ।
  2. वेस्टर्न सोख्ता
    1. चरण ४.१ में एक ही प्रोटोकॉल के साथ एसडीएस-पृष्ठ जेल चलाएँ । जेल चलाने के बाद, स्थानांतरण बफर के साथ जेल सोख (25 मिमी Tris, १९२ मिमी glycine, पीएच ८.३, और 20% मेथनॉल) 15 मिनट के लिए.
    2. 1 मिनट के लिए मेथनॉल के साथ एक ०.२ µm, 7 सेमी x ८.५ सेमी polyvinylidene difluoride (PVDF) झिल्ली को सक्रिय करें, और हस्तांतरण सैंडविच तैयार करने से पहले हस्तांतरण बफर के साथ कुल्ला ।
      नोट: मेथनॉल त्वचा के संपर्क, आंख से संपर्क, घूस, या साँस लेना के मामले में खतरनाक है । गंभीर से अधिक जोखिम मौत में परिणाम कर सकते हैं ।
    3. anode को कैथोड से हस्तांतरण सैंडविच बनाओ (स्पंज, फिल्टर कागज, एसडीएस-पृष्ठ जेल, PVDF झिल्ली, फिल्टर कागज, और स्पंज) । हस्तांतरण टैंक में ढेर रखो, ४५ मिनट के लिए ३५० mA के निरंतर वर्तमान में चलाते हैं ।
      नोट: स्थानांतरण समय अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है ।
    4. धो PVDF झिल्ली के साथ 25 मिलीलीटर Tris-खारा बफर, ०.१% के बीच 20 (TBST) (१३७ mm NaCl, 20 मिमी Tris, ०.१% के बीच-20, पीएच ७.६) बफर के साथ 5 मिनट के लिए कोमल मिलाते हुए । कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए TBST बफर में 5% गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA) के साथ झिल्ली ब्लॉक ।
    5. एचआरपी-संयुग्मित acetyllysine-एंटीबॉडी के साथ एक अंतिम एकाग्रता के साथ झिल्ली की मशीन 1 µ जी/एमएल के साथ पतला 5% BSA में 4 ° c पर TBST में रात भर कोमल झटकों के साथ ।
      नोट: तेज़ परिणामों के लिए, यह चरण 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान में किया जा सकता है । एंटीबॉडी के कमजोर पड़ने के अनुकूलन की जरूरत हो सकती है ।
    6. कोमल झटकों के साथ 5 मिनट के लिए 20 मिलीलीटर TBST बफर के साथ झिल्ली धो, चरण 4 बार दोहरा । निर्माता के निर्देशों का पालन करके झिल्ली के लिए chemiluminescence सब्सट्रेट लागू करें । एक चार्ज-युग्मित डिवाइस (सीसीडी) कैमरा-आधारित imager के साथ सिग्नल कैप्चर ।

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Representative Results

acetylated MDH प्रोटीन की उपज 1 एल संस्कृति प्रति 15 मिलीग्राम था, जबकि जंगली प्रकार के MDH की थी 31 1 एल संस्कृति प्रति मिलीग्राम । शुद्ध प्रोटीन एसडीएस द्वारा विश्लेषण-पृष्ठ के रूप में चित्रा 1में दिखाया गया । वाइल्ड-टाइप MDH को एक धनात्मक नियंत्रण३४के रूप में उपयोग किया गया था । प्रोटीन कोशिकाओं से शुद्ध acetyllysine (ले) निगमन प्रणाली और उत्परिवर्ती mdh जीन बंदरगाह, लेकिन विकास मीडिया में पृष्ठ के बिना, एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था । शुद्ध प्रोटीन के Lysine acetylation पश्चिमी सोख्ता द्वारा पता लगाया गया था के रूप में acetyllysine-एंटीबॉडी का उपयोग कर चित्रा 2में दिखाया गया है । malate डिहाइड्रोजनेज में lysine अवशेषों १४० के acetylation ने मिलकर जन स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण द्वारा पुष्टि की थी जैसा कि चित्र 3में दिखाया गया है ।

MDH प्रोटीन के प्रोटीन अनुक्रम (मिलकर एमएस विश्लेषण के लिए टुकड़ा बोल्ड में है):

MKVAVLGAAGGIGQALALLLKTQLPSGSELSLYDIAPVTPGVAVDLSHIPTAVKIKGFSGEDAT
PALEGADVVLISAGVARKPGMDRSDLFNVNAGIVKNLVQQVAKTCPKACIGIITNPVNTTVAIAA
EVLKKAGVYDKNKLFGVTTLDIIRSNTFVAELKGKQPGEVEVPVIGGHSGVTILPLLSQVPGV
SFTEQEVADLTKRIQNAGTEVVEAKAGGGSATLSMGQAAARFGLSLVRALQGEQGVVECAY
VEGDGQYARFFSQPLLLGKNGVEERKSIGTLSAFEQNALEGMLDTLKKDIALGEEFVNK

अनुकूलित acetyllysyl के प्रोटीन अनुक्रम-tRNA synthetase३३:

MDKKPLDVLISATGLWMSRTGTLHKIKHYEISRSKIYIEMACGDHLVVNNSRSCRPARAFRYHKY
RKTCKRCRVSDEDINNFLTRSTEGKTSVKVKVVSEPKVKKAMPKSVSRAPKPLENPVSAKAST
DTSRSVPSPAKSTPNSPVPTSASAPALTKSQTDRLEVLLNPKDEISLNSGKPFRELESELLSRR
KKDLQQIYAEERENYLGKLEREITRFFVDRGFLEIKSPILIPLEYIERMGIDNDTELSKQIFRVDKN
FCLRPMMAPNLLNYARKLDRALPDPIKIFEIGPCYRKESDGKEHLEEFTMLNFFQMGSGCTRE
NLESIITDFLNHLGIDFKIVGDSCMVYGDTLDVMHGDLELSSAVVGPIPLDREWGIDKPWIGAGF
GLERLLKVKHDFKNIKRAARSESYYNGISTNL

अनुकूलित tRNA के जीन अनुक्रमPyl ३२:

GGAAACGTGATCATGTAGATCGAATGGACTCTAAATCCGTTCAGTGGGGTTAGATTCCCC
ACGTTTCCGCCA

Figure 1
चित्र 1 : Coomassie नीले दाग एसडीएस-पृष्ठ जेल शुद्ध पूर्ण लंबाई MDH और उसके ले-युक्त संस्करण । रेफरेंस अंशों की एक ही मात्रा एसडीएस-पेज जेल पर लोड की गई । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 : शुद्ध वंय-प्रकार MDH और उसके ले-युक्त संस्करण के पश्चिमी सोख्ता । रेफरेंस अंशों की एक ही मात्रा भरी हुई थी । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3 : LC-ms/ले-युक्त MDH संस्करण का एमएस विश्लेषण । पेप्टाइड के मिलकर जन स्पेक्ट्रम (अवशेषों 135-142) AGVYDK शुद्ध acetylated MDH संस्करण सेएसीNK । कश्मीरएसी नोट शामिल है । पृष्ठ से युक्त पेप्टाइड के आंशिक अनुक्रम व्याख्या बी या y आयन श्रृंखला से पढ़ा जा सकता है । मिलाए गए पीक रेड में थे । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

गैर विहित अमीनो एसिड के आनुवंशिक शामिल (ncaas) एक सौंपा codon के दमन पर आधारित है, ज्यादातर एंबर बंद codon UAG३६,३७,३८,३९, ncAA द्वारा आरोप लगाया tRNA जिसमें संगत anticodon । के रूप में जाना जाता है, UAG codon बैक्टीरिया में रिलीज फैक्टर-1 (RF1) द्वारा मांयता प्राप्त है, और यह भी कायस और lysine के रूप में विहित अमीनो एसिड (tyrosine) द्वारा आरोपित मेजबान से cognate tRNAs के पास से दबा दिया जा सकता है४०,४१। तो, UAG codon में ncaa शामिल की दक्षता ncaa के बीच प्रतियोगिता पर निर्भर करता है tRNAs और RF1 आरोप लगाया है, जबकि ncaa निगमन की पवित्रता ncaa-आरोप लगाया tRNAs और cAA के बीच प्रतियोगिता पर निर्भर cognate tRNAs के पास आरोप लगाया । कम उपज और लक्ष्य acetylated प्रोटीन की शुद्धता मेजबान कोशिकाओं में पेश ओर्थोगोनल जोड़ी की कम निगमन दक्षता के कारण हो सकता है । इस समस्या को मीडिया में acetyllysine की एकाग्रता में वृद्धि से हल किया जा सकता है, और हाल ही में अनुकूलित acetyllysine निगमन प्रणाली है, जो ५८ बार३२,३३, दोनों द्वारा UAG codon दमन वृद्धि का उपयोग कर acetyllysine निगम की कार्यकुशलता और शुद्धता में सुधार किया जाएगा । के रूप में चित्रा 1 में दिखाया गया है और प्रोटीन की पैदावार की तुलना, acetyllysine निगमन की क्षमता के बारे में ५०% थी, और वहां कोई पता लगाने वाला प्रोटीन ले निगमन प्रणाली और MDH के उत्परिवर्ती जीन बंदरगाह बंदरगाहों से शुद्ध था, लेकिन में पृष्ठ के बिना विकास मीडिया, जो acetyllysine निगमन की उच्च शुद्धता का संकेत दिया । इसके अलावा, मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण भी MDH की स्थिति १४० में कोई कायस नहीं दिखा था, acetyllysine निगमन की एकरूपता का संकेत है ।

इस दृष्टिकोण की दो मुख्य सीमाएं हैं । सबसे पहले, क्योंकि acetyllysine के प्रतियोगिता के दोनों RF1 और cAA के साथ tRNA आरोप लगाया cognate tRNAs के पास ऊपर वर्णित है, वर्तमान में, acetyllysine अवशेषों कि एक साथ एक प्रोटीन में शामिल किया जा सकता है की अधिकतम संख्या तीन है ३३,४२. दूसरे, कोशिकाओं deacetylases के अन्य प्रकार है, जो nicotinamide का विरोध और कुछ लक्ष्य प्रोटीन deacetylate हो सकता है. तो, उन प्रोटीन विशिष्ट साइटों पर १००% acetylation तक पहुंच नहीं हो सकता है । हाल ही में, हम एक thio-acetyllysine प्रणाली जो एक गैर acetyllysine४३के अनुरूप deacetylable के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है की स्थापना की है, इस प्रकार इस प्रणाली इस मामले में एक अच्छा वैकल्पिक दृष्टिकोण हो सकता है.

जैसा कि पहले उल्लेख किया है, क्लासिक के लिए रासायनिक दृष्टिकोण lysine acetylation विशेषताएं साइट का उपयोग कर रहा है-निर्देश mutagenesis । Glutamine acetyllysine की नकल के रूप में प्रयोग किया जाता है, और arginine एक गैर acetylated lysine नकल के रूप में उपयोग होता है । हालांकि, दोनों की नकल असली isosteres नहीं हैं, और हमेशा की उंमीद परिणाम नहीं उपज30। आनुवंशिक कोड विस्तार रणनीति विशिष्ट lysine अवशेषों पर homogeneously acetylated प्रोटीन उत्पंन कर सकता है, जो acetylated प्रोटीन की विशेषता के लिए सबसे कठोर तरीका है ।

acetyllysine के लिए आनुवंशिक निगमन प्रणाली pyrrolysyl-tRNA synthetase वेरिएंट की जोड़ी से व्युत्पंन किया गया था, और उनके cognate प्रजाति से tRNA, जो भी Methanosarcinaceae ४४में ओर्थोगोनल जाना जाता है । पिछले अध्ययनों से पता चला है कि इस प्रणाली स्तनधारी कोशिकाओं और प्रोटीन acetylation अध्ययन के लिए कुछ जानवरों में लागू किया जा सकता है३९, इस प्रकार वर्तमान प्रोटोकॉल चिकित्सा में व्यापक अनुप्रयोगों के लिए स्तनधारी कोशिकाओं और यहां तक कि पशुओं के लिए विस्तारित किया जा सकता है अनुसंधान और उद्योग । इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल भी अनिवार्य रूप से एक ही करने के लिए ncaas के विभिंन प्रकार शामिल इस्तेमाल प्रोटोकॉल है, ओर्थोगोनल मेजबान कोशिकाओं में शुरू की जोड़ी के लिए एक साधारण परिवर्तन महसूस ।

Lysine deacetylases (KDACs) प्रोटीन्स४५में acetylated Lysine अवशेषों से एसिटाइल समूह को हटा दें । sirtuin प्रकार CobB ई. कोलाई, जो nicotinamide27द्वारा बाधित किया जा सकता है में ही प्रसिद्ध deacetylase है । इसलिए, कोशिका वृद्धि और प्रोटीन शुद्धि के दौरान उत्पन्न acetylated प्रोटीन की deacetylation को रोकने के लिए, 20 से ५० mM nicotinamide को वृद्धि मीडिया और शुद्धि बफ़र्स दोनों में जोड़ा जाना चाहिए । एक बार शुद्ध, lysine अवशेषों की acetylation अपेक्षाकृत deacetylase की कमी के कारण स्थिर है । दूसरे, प्रोटीन में अंय lysine अवशेषों पर गैर विशिष्ट acetylation की पृष्ठभूमि को कम करने के लिए, BL21 (DE3) तनाव अभिव्यक्ति तनाव के रूप में इस्तेमाल किया गया था, प्रोटीन acetylation के अपने काफी निचले स्तर की वजह से आमतौर पर इस्तेमाल किया K12-व्युत्पंन उपभेदों४६ . के रूप में चित्रा 2में दिखाया गया है, वंय प्रकार BL21 (DE3) कोशिकाओं से व्यक्त MDH पश्चिमी सोख्ता द्वारा कोई जासूसी acetylation था । इस लक्ष्य प्रोटीन में acetylation की शुद्धता बढ़ाने के लिए एक और महत्वपूर्ण कारक है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस कार्य को NIH (AI119813), Arkansas विश्वविद्यालय की और से पुरस्कार Arkansas को विज्ञान संस्थान द्वारा समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bradford protein assay Bio-Rad 5000006 Protein concentration
4x Laemmli Sample Buffer Bio-Rad 1610747 SDS sample buffer
Coomassie G-250 Stain Bio-Rad 1610786 SDS-PAGE gel staining
4-20% SDS-PAGE ready gel Bio-Rad 4561093 Protein determination
Ac-K-100 (HRP Conjugate) Cell Signaling 6952 Antibody
IPTG CHEM-IMPEX 194 Expression inducer
Nε-Acetyl-L-lysine CHEM-IMPEX 5364 Noncanonical amino acid
PD-10 desalting column GE Healthcare 17085101 Desalting
Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit NEB E0554 Introducing the stop codon
BL21 (DE3) cells NEB C2527 Expressing strain
QIAprep Spin Miniprep Kit QIAGEN 27106 Extracting plasmids
Ni-NTA resin QIAGEN 30210 Affinity purification resin
nicotinamide Sigma-Aldrich N3376 Deacetylase inhibitor
β-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250 Reducing agent
BugBuster Protein Extraction Reagent Sigma-Aldrich 70584 Breaking cells
Benzonase nuclease Sigma-Aldrich E1014 DNase
ECL Western Blotting Substrate ThermoFisher 32106 Chemiluminescence
Premixed LB Broth VWR 97064 Cell growth medium
Bovine serum albumin VWR 97061-416 western blots blocking

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इम्यूनोलॉजी अंक १३० प्रोटीन acetylation पद-शोधों में संशोधन जेनेटिक कोड विस्तार विहित अमीनो अम्ल malate डिहाइड्रोजनेज सिंथेटिक बायोलॉजी
साइट उत्पंन करने के लिए एक सतही प्रोटोकॉल-विशेष रूप से <em>ई कोलाई</em> में Acetylated प्रोटीन
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Venkat, S., Gregory, C., Meng, K., Gan, Q., Fan, C. A Facile Protocol to Generate Site-Specifically Acetylated Proteins in Escherichia Coli. J. Vis. Exp. (130), e57061, doi:10.3791/57061 (2017).

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