Summary
Genetiska koden expansion fungerar som ett kraftfullt verktyg för att studera en mängd biologiska processer, inklusive protein acetylering. Här visar vi ett lättköpt protokoll att utnyttja denna teknik för att generera homogeneously acetylerade proteiner på specifika platser i Escherichia coli celler.
Abstract
Post-translationella modifieringar som förekommer vid specifika positioner av proteiner har visat sig spela en viktig roll i en mängd olika cellulära processer. Bland dem är reversibel lysin acetylering en av de mest spridda i alla domäner i livet. Även om många mass spectrometry-baserade acetylome studier har utförts, har ytterligare karakterisering av dessa förmodade acetylering mål varit begränsad. En möjlig orsak är att det är svårt att generera rent acetylerade proteiner på önskade positioner genom de flesta klassiska biokemiska metoder. För att övervinna denna utmaning, har den genetiska kod expansion tekniken tillämpats för att använda par en konstruerad pyrrolysyl-tRNA Synthetasen variant, och dess cognate tRNA från Methanosarcinaceae arter, direkt cotranslational införlivande av acetyllysine på den specifika platsen i proteinet av intresse. Efter första ansökan i studien av Histon acetylering, har detta tillvägagångssätt underlättat acetylering studier på en mängd olika proteiner. I detta arbete visat vi ett lättköpt protokoll för att producera anläggningsvis acetylerade proteiner med hjälp av modell bakterien Escherichia coli som värd. Malate dehydrogenas användes som en demonstration exempel i detta arbete.
Introduction
Post-translationella modifieringar (PTMs) av proteiner uppstår efter översättningsprocessen och uppstår från kovalent tillägg av funktionella grupper till aminosyra rester, spelar viktiga roller i nästan alla biologiska processer, inklusive gen transkription, stressreaktion, celldifferentiering och metabolism1,2,3. Hittills har cirka 400 distinkta varit PTMs identifierade4. Krångliga genomet och proteomet förstärks i stor utsträckning av protein PTMs, som de reglerar protein aktivitet och lokalisering, och påverkar samspelet med andra molekyler som kofaktorer5, lipider, proteiner och nukleinsyror.
Protein acetylering har varit i spetsen för PTMs studier i senaste två decennierna6,7,8,9,10,11,12. Lysin acetylering upptäcktes först i Histonerna mer än 50 år sedan13,14, har varit väl granskas, och finns i mer än 80 transkriptionsfaktorer, tillsynsmyndigheter och olika proteiner15, 16,17. Studier på protein acetylering har inte bara gett oss en djupare förståelse för dess reglerande mekanismer, men även guidade behandlingar för ett antal sjukdomar som orsakas av dysfunktionella acetylering18,19, 20 , 21 , 22 , 23. trodde att lysin acetylering bara händer i Eukaryoter, men nyare studier har visat att protein acetylering också spelar viktiga roller i bakteriell fysiologi, inklusive Kemotaxis, acid motstånd, aktivering och stabilisering av patogenicitet öar och andra virulens relaterade proteiner24,25,26,27,28,29.
En vanligt förekommande metod att biokemiskt karakterisera lysin acetylering använder webbplats riktad mutagenes. Glutamin används som en härma av acetyllysine på grund av dess liknande storlek och polaritet. Arginin är utnyttjas som en icke-acetylerade lysin härma, eftersom det bevarar dess positiva laddning under fysiologiska betingelser men kan inte vara acetylerade. Men båda härmar är inte riktiga isosteres och ger inte alltid de förväntade resultat30. Den mest rigorösa strategin är att generera homogeneously acetylerade proteiner vid specifika lysin rester, som är svårt eller omöjligt för mest klassiska metoder på grund av den låga stökiometri av lysin acetylering i naturen7,11. Denna utmaning har varit avslöjad av den genetiska kod expansionsstrategin, som sysselsätter en konstruerad pyrrolysyl-tRNA-syntetas variant från Methanosarcinaceae arter att ladda tRNAenPyl med acetyllysine, använder tredjeparts värden translationell maskiner att undertrycka UAG stoppa codon i mRNA och dirigerar införlivandet av acetyllysine i mål protein31designade ställning. Nyligen har vi optimerat detta system med en förbättrad EF-Tu-bindning tRNA32 och en uppgraderad acetyllysyl-tRNA Synthetasen33. Vi har dessutom tillämpat Detta förbättrade inkorporering system i acetylering studier malate dehydrogenas34 och tyrosyl-tRNA Synthetasen35. Häri, visar vi protokollet för att generera rent acetylerade proteiner från molekylär kloning att biokemiska identifiering med hjälp av malate dehydrogenas (MDH), som vi har i stor utsträckning studerat som en demonstrativ exempel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. webbplats riktad mutagenes av målgenen
Obs: MDH uttrycks under T7 promotorn i pCDF-1 vektorn med CloDF13 ursprung och en kopia antal 20 till 4034.
- Införa den bärnsten stop kodon högst 140 i genen av primrar (vidarebefordra primer: GGTGTTTATGACTAGAACAAACTGTTCGGCG och reverse primer: GGCTTTTTTCAGCACTTCAGCAGCAATTGC), följa instruktioner av webbplats riktad mutagenes kit.
- Förstärka mall plasmiden som innehåller genen för vildtyp malat dehydratase och infoga stop kodon mutationen av polymeras-kedjereaktion (PCR) reaktionen. I reaktionsblandningen, inkluderar 12,5 µL av 2 X DNA polymeras enzym mix, 1,25 µL 10 µM Forward primer, 1,25 µL 10 µM Reverse primer, 1 µL av DNA (20 ng/µL) (pCDF-1 plasmid innehållande av vildtyps-MDH-genen), och 9 µL nuclease-gratis vatten.
- Använda PCR-reaktion parametrar enligt följande: inledande denaturering vid 98 ° C i 30 s; 25 cykler av 10 s på 98 ° C, 30 s vid 55 ° C och 3 min vid 72 ° C; slutliga förlängning vid 72 ° C under 3 minuter. Efter PCR, lägga till det förstärkta materialet direkt till Kinas-Ligase-DpnI enzym mixen från kit för 1 h i rumstemperatur för borttagning av circularization och mall.
Obs: Reaktionsblandningen innehåller 1 µL av PCR-produkten, 5 µL 2 X reaktion buffert, 1 µL 10 X Kinase-Ligase-DpnI enzym mix och 3 µL nuclease-gratis vatten.
- Använda PCR-reaktion parametrar enligt följande: inledande denaturering vid 98 ° C i 30 s; 25 cykler av 10 s på 98 ° C, 30 s vid 55 ° C och 3 min vid 72 ° C; slutliga förlängning vid 72 ° C under 3 minuter. Efter PCR, lägga till det förstärkta materialet direkt till Kinas-Ligase-DpnI enzym mixen från kit för 1 h i rumstemperatur för borttagning av circularization och mall.
- Tillsätt 5 µL av reaktionsblandning till röret på 25 µL tinade behöriga E. coli DH5α celler från kit. Noggrant svep röret till blanda och placera blandningen på is för 30 min. värme chock blandningen vid 42 ° C i 30 s och plats på is för ytterligare 5 min.
- Pipettera 600 µL av rumstemperatur Super Optimal buljong med Catabolite förtryck (SOC) media från kit i blandningen, inkubera vid 37 ° C under 60 minuter med skakningar vid 250 rpm, sprida 100 µL på lysogeny buljong (LB) agar plåt med motsvarande antibiotika , och inkubera över natten vid 37 ° C med skakningar vid 250 rpm.
- Plocka 4 – 6 enstaka kolonier i 6 mL färsk LB media med motsvarande antibiotika och inkubera vid 37 ° C över natten med skakningar vid 250 rpm. Extrahera plasmider från varje övernattning kultur av Plasmiden rening kit, efter tillverkarens manual och sedan skicka plasmider för DNA-sekvensering enligt protokollet av tjänsteleverantören att bekräfta stop kodon mutationen på rätt positioner.
- Lagra stammen med rätt sekvens vid-80 ° C genom att blanda 1 mL övernattning kultur och 300 µL 100% DMSO.
2. redovisning av proteinet acetylerade
- Infoga generna av optimerad acetyllysyl-tRNA Synthetasen33 och optimerad tRNAPyl 32 in pTech Plasmiden. Placera den tRNASynthetase genen konstituerande lpp arrangören. Placera den tRNA-gen under den konstituerande proK arrangören34.
- Tillsammans förvandla den uttryck vektor34 innehållande muterade TAG-innehållande genen malate dehydrogenas, och plasmiden härbärgerat optimerad acetyllysine inkorporering systemet, till 25 µL tinade behöriga E. coli BL21(DE3) celler av värme chock vid 42 ° C i 10 s och plats på is för ytterligare 5 min.
- Pipettera 600 µL av rumstemperatur SOC media i blandningen, inkubera vid 37 ° C under 60 minuter med skakningar vid 275 rpm, sprida 100 µL på en tallrik med 100 µg/mL streptomycin och 50 µg/mL kloramfenikol och inkubera över natten vid 37 ° C med skakningar vid 275 rpm.
- Plocka upp en enda koloni från plattan, och Inokulera i 15 mL färsk LB media med 100 µg/mL streptomycin och 50 µg/mL kloramfenikol i en 50 mL tub över natten vid 37 ° C under skakning med hastighet av 250 rpm. Överföra 15 mL övernattning kulturen till 300 mL färsk LB media med antibiotika i en 1 L mätkolv och inkubera vid 37 ° C med skakningar vid 250 rpm.
- Lös acetyllysine med vatten till 100 mM stamlösning, förvaras vid 4 ° C. Lägga till 5 mM acetyllysine och 20 mM nikotinamid (hämmare av deacetylases) till tillväxt medier när absorbansen når 0,5 på 600 nm.
- Odla cellerna för en ytterligare 1 h vid 37 ° C, skaka vid 250 rpm, då lägga till 0,5 mM IPTG för proteinuttryck och odla cellerna vid 25 ° C över natten, med skakningar vid 180 rpm.
Obs: Villkor som uttryck kan behöva optimering för olika proteiner.
- Odla cellerna för en ytterligare 1 h vid 37 ° C, skaka vid 250 rpm, då lägga till 0,5 mM IPTG för proteinuttryck och odla cellerna vid 25 ° C över natten, med skakningar vid 180 rpm.
- Samla celler genom centrifugering vid 3 000 x g vid 4 ° C under 15 minuter, avlägsna supernatanten och tvätta cell pellets med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) bufferten (10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl). Samla in tvättade cellerna vid 10 000 x g vid 4 ° C i 5 min, avlägsna supernatanten och lagra cell pellets vid-80 ° C.
3. rening av proteinet acetylerade
- Tina frysta cell pellets på is, och resuspendera med 15 mL lyseringsbuffert (50 mM tris (hydroxymetyl) aminometan (Tris) pH 7,8, 300 mM NaCl, 20 mM Imidazol och 20 mM nikotinamid), 5 µL av β-merkaptoetanol och 1 µL bensonas nuclease (250 enheter).
- Bryta celler av 40 kHz ultraljudsbehandling på 70% effekt med 10 cykler av 10 s korta skurar, följt av intervall på 30 s för kylning till formuläret råa extrakt. Centrifugera rå extrakt vid 20 000 x g i 25 minuter vid 4 ° C. Filtrera supernatanten med det 0,45 µm membranfiltret, och ladda in i en kolumn som innehåller 1 mL av nickel-nitrilotriacetic acid (Ni-NTA) harts jämviktas med 20 mL vatten och 20 mL lyseringsbuffert.
Obs: Cellerna kan också brytas milda tvättmedel, om ultraljudsbehandling inte är tillgänglig. - Tvätta kolonnen med 20 mL av tvättbuffert (50 mM Tris pH 7,8, 300 mM NaCl, 50 mM Imidazol och 20 mM nikotinamid) och sedan eluera med 2 mL eluering buffert (50 mM Tris pH 7,8, 300 mM NaCl, 150 mM Imidazol och 20 mM nikotinamid).
- Avsalta eluering bråket med avsaltning buffert (25 mM Tris pH 7,8 och 10 mM NaCl) av kolumnen PD-10, efter tillverkarens handbok. Mätning av koncentrationen av proteinet eluerat genom att följa anvisningen av Bradford protein assay reagensen. Desalted proteinet är redo för ytterligare experiment.
Obs: Gör 50% glycerol lager av protein, och hålla i-80 ° C för lagring.
4. biokemisk karakterisering av proteinet acetylerade
-
SDS-PAGE och mass spectrometry analyser.
- Denaturera proteiner med natrium dodecyl sulfate (SDS) prov bufferten (5 µL protein prov med 2 µL 4 X SDS prov buffert) i en 2 mL tub vid 105 ° C i 5 min, Centrifugera blandningen vid 2000 x g i 10 s, belastning på den 4-20% sodium dodecyl sulfate Polyakrylamidgelen electroph oresis (SDS-PAGE) gel, och kör på 200 V för 30 min.
- Tvätta gelen med destillerat vatten och skaka försiktigt i 5 min, upprepa processen 3 gånger. Kasta vatten och fläcken gelen med Coomassie blå fläck för 1 h med milda skakningar. De fläcken gelen med destillerat vatten, skaka försiktigt i 30 min, och upprepa detta färga de 3 gånger.
- Klippa bandet på 33 kDa på Coomassie blå-färgade SDS-PAGE gel, och skicka det till masspektrometri faciliteter eller företag för att bekräfta acetyllysine införlivades vid designade position.
Obs: Protokollet av masspektrometri analys följt den tidigare experiment34.
-
Western Blotting
- Kör SDS-PAGE gelen med samma protokoll i steg 4.1. Efter gelen kör, Blötlägg gelen med överföring bufferten (25 mM Tris, 192 mM glycin, pH 8,3 och 20% metanol) för 15 min.
- Aktivera ett 0,2 µm, 7 cm x 8,5 cm polyvinylidene kryptondifluorid (PVDF) membran med metanol för 1 min, och skölj med överföring buffert innan du förbereder överföringen smörgås.
Obs: Metanol är farligt vid hudkontakt, ögonkontakt, förtäring eller inandning. Svår överexponering kan leda till döden. - Gör överföring smörgås från katod till anod (svamp, filterpapper, SDS-PAGE gel, PVDF membran, filterpapper och svamp). Sätta i stacken i överföring tanken, kör på konstant ström på 350 mA för 45 min.
Obs: Överföringstiden behöva optimering. - Tvätta PVDF membranet med 25 mL Tris-buffrad koksaltlösning, 0,1% Tween 20 (TBST) (137 mM NaCl, 20 mM Tris, 0.1% Tween-20, pH 7,6) buffert för 5 min med milda skakningar. Blockera membranet med 5% bovint serumalbumin (BSA) i TBST bufferten för 1 h i rumstemperatur.
- Inkubera membranet med HRP-konjugerad acetyllysine-antikropp med en slutlig koncentration på 1 µg/mL spädas med 5% BSA i TBST vid 4 ° C över natten med milda skakningar.
Obs: För snabbare resultat, kunde detta steg utföras i rumstemperatur i 1 h. Utspädning av antikropp kan behöva optimering. - Tvätta membranet med 20 mL TBST buffert för 5 min med milda skakningar, upprepa steget 4 gånger. Gälla membranet chemiluminescence substratet genom att följa tillverkarens instruktioner. Fånga signalen med en laddning – tillsammans enhet (CCD) kamerabaserade imager.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Avkastningen av acetylerade MDH protein var 15 mg per 1 L kultur, medan det av vildtyp MDH var 31 mg per 1 L kultur. Renade proteiner analyserades av SDS-PAGE som visas i figur 1. Den vildtyp MDH användes som en positiv kontroll34. Det protein som renas från celler hysa acetyllysine (AcK) införlivandet systemet och den muterade mdh -genen, men utan AcK i tillväxt medier, användes som en negativ kontroll. Lysin acetylering av renade proteiner upptäcktes av western blotting med den acetyllysine-antikroppen som visas i figur 2. Acetylering av lysin återstoden 140 i på malate dehydrogenas bekräftades av tandem mass spectrometry analys som visas i figur 3.
Protein sekvensen av MDH protein (fragmentet för tandem MS analys är i fetstil):
MKVAVLGAAGGIGQALALLLKTQLPSGSELSLYDIAPVTPGVAVDLSHIPTAVKIKGFSGEDAT
PALEGADVVLISAGVARKPGMDRSDLFNVNAGIVKNLVQQVAKTCPKACIGIITNPVNTTVAIAA
EVLKKAGVYDKNKLFGVTTLDIIRSNTFVAELKGKQPGEVEVPVIGGHSGVTILPLLSQVPGV
SFTEQEVADLTKRIQNAGTEVVEAKAGGGSATLSMGQAAARFGLSLVRALQGEQGVVECAY
VEGDGQYARFFSQPLLLGKNGVEERKSIGTLSAFEQNALEGMLDTLKKDIALGEEFVNK
Protein sekvensen av optimerad acetyllysyl-tRNA Synthetasen33:
MDKKPLDVLISATGLWMSRTGTLHKIKHYEISRSKIYIEMACGDHLVVNNSRSCRPARAFRYHKY
RKTCKRCRVSDEDINNFLTRSTEGKTSVKVKVVSEPKVKKAMPKSVSRAPKPLENPVSAKAST
DTSRSVPSPAKSTPNSPVPTSASAPALTKSQTDRLEVLLNPKDEISLNSGKPFRELESELLSRR
KKDLQQIYAEERENYLGKLEREITRFFVDRGFLEIKSPILIPLEYIERMGIDNDTELSKQIFRVDKN
FCLRPMMAPNLLNYARKLDRALPDPIKIFEIGPCYRKESDGKEHLEEFTMLNFFQMGSGCTRE
NLESIITDFLNHLGIDFKIVGDSCMVYGDTLDVMHGDLELSSAVVGPIPLDREWGIDKPWIGAGF
GLERLLKVKHDFKNIKRAARSESYYNGISTNL
Gensekvensen av optimerad tRNAPyl 32:
GGAAACGTGATCATGTAGATCGAATGGACTCTAAATCCGTTCAGTGGGGTTAGATTCCCC
ACGTTTCCGCCA
Figur 1 : The Coomassie blå-färgade SDS-PAGE gel av renat fullängds MDH och dess AcK-innehållande variant. Samma volym av eluering fraktioner lastades på den SDS-PAGE gel. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Den western blotting av renat vildtyp MDH och dess AcK-innehållande variant. Samma volym av eluering fraktioner lastades. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : LC-MS/MS-analys av AcK-innehållande MDH variant. Tandem mass spektrumet av peptid (rester 135-142) AGVYDKACNK från renat acetylerade MDH variant. KAC betecknar AcK inkorporering. Den partiella sekvensen av peptiden innehållande AcK kan läsas från kommenterad b eller y ion-serie. Matchade toppar var i rött. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Genetiska införlivandet av noncanonical aminosyror (ncAAs) är baserad på undertryckandet av en tilldelade kodon, mestadels bärnsten stop kodon UAG36,37,38,39, av de ncAA-laddad tRNAen som innehåller den motsvarande Anticodonen. Som är känd, den UAG Codonen är erkänd av den frige factor-1 (RF1) i bakterier och det kan också dämpas av nära besläktat tRNAs från värdar debiteras av kanoniska aminosyror (cAAs) såsom lysin och tyrosin40,41. Så, effektiviteten i ncAA införlivande på den UAG Codonen beror på konkurrensen mellan ncAA laddade tRNAs och RF1, medan renheten av ncAA inkorporering förlitar sig på konkurrensen mellan ncAA laddade tRNAs och Luftfartsverket laddade nära besläktat tRNAs. Låg avkastning och renhet av målproteinet acetylerade kan orsakas av låga inkorporering effektivitet ortogonala paret förs in i värdceller. Detta problem kunde lösas genom att öka koncentrationen av acetyllysine i medierna, och med nyligen optimerad acetyllysine inkorporering system, som ökade UAG kodon dämpningen av 58 gånger32,33, både effektivitet och renhet acetyllysine bolagsordning kommer att förbättras. Som visas i figur 1 och jämföra protein avkastning, effektiviteten i acetyllysine inkorporeringen var ca 50%, och det fanns inga detekterbara protein som renats från celler som härbärgerat AcK inkorporering systemet och den muterade genen av MDH, men utan AcK i tillväxt medier, som visade hög renhet acetyllysine bolagsordning. Dessutom visade masspektrometri analys också inte någon cAAs vid 140 av MDH, som visar att läkemedlet förblandas de acetyllysine.
Det finns två huvudsakliga begränsningarna med denna metod. För det första på grund av konkurrensen av acetyllysine laddad tRNA med båda RF1 och Luftfartsverket laddade nära besläktat tRNAs beskrivs ovan, för närvarande, det maximala antalet acetyllysine restprodukter som samtidigt kan införlivas i ett enda protein är tre 33,42. För det andra har celler andra typer av deacetylases, som motstår nikotinamid och kan deacetylate vissa målproteiner. Så, dessa proteiner kanske inte når 100% acetylering på specifika platser. Nyligen har vi etablerat ett thio-acetyllysine inkorporering system som kan användas som en icke-deacetylable analog acetyllysine43, således detta system kunde vara ett bra alternativ i detta fall.
Som tidigare nämnts använder den klassiska strategin för biokemiskt karakterisera lysin acetylering webbplats riktad mutagenes. Glutamin används som en härma av acetyllysine och arginin utnyttjas som en icke-acetylerade lysin härma. Men båda härmar är inte riktiga isosteres, och ger inte alltid de förväntade resultat30. Den genetiska kod expansionsstrategin kunde generera homogeneously acetylerade proteiner vid specifika lysin rester, vilket är det mest noggranna sättet att karakterisera acetylerade proteiner.
Genetiska inkorporering systemet för acetyllysine härleddes från para av pyrrolysyl-tRNA Synthetasen varianter och deras cognate tRNA från Methanosarcinaceae arter, som är också kända för att vara ortogonala i Eukaryoter44. Tidigare studier har visat att detta system skulle kunna tillämpas i däggdjursceller och vissa djur för protein acetylering studier39, således detta protokoll skulle kunna utvidgas till däggdjursceller och även djur för bredare program i medicinsk forskning och industri. Detta protokoll är dessutom också i huvudsak samma protokoll används för att infoga olika typer av ncAAs, vilket nödvändiggör en enkel förändring till ortogonala para förs in i värdceller.
Lysin deacetylases (KDACs) ta bort gruppen acetyl från acetylerade lysin återstoden i proteiner45. Sirtuin-typ CobB är den enda välkända histondeacetylas i E. coli, som kan hämmas av nikotinamid27. Så, för att förhindra deacetylering acetylerade protein genereras under celltillväxt och protein rening, 20 till 50 mM nikotinamid bör läggas till i både tillväxt medier och rening buffertar. När renat, är acetylering av lysin rester relativt stabilt på grund av histondeacetylas. För det andra, för att sänka bakgrund av ospecifik acetylering på andra lysin rester i proteinet, BL21 (DE3) stam användes som uttryck stam, på grund av sitt väsentligt lägre nivå av protein acetylering än vanliga K12-derived stammar46 . I figur 2visas de vildtyp MDH uttryckt från BL21(DE3) celler hade inga påvisbara acetylering av western blotting. Detta är en annan viktig faktor att öka renheten av acetylering i målproteinet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av NIH (AI119813), start från University of Arkansas, och award från Arkansas Biosciences Institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bradford protein assay | Bio-Rad | 5000006 | Protein concentration |
| 4x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 1610747 | SDS sample buffer |
| Coomassie G-250 Stain | Bio-Rad | 1610786 | SDS-PAGE gel staining |
| 4-20% SDS-PAGE ready gel | Bio-Rad | 4561093 | Protein determination |
| Ac-K-100 (HRP Conjugate) | Cell Signaling | 6952 | Antibody |
| IPTG | CHEM-IMPEX | 194 | Expression inducer |
| Nε-Acetyl-L-lysine | CHEM-IMPEX | 5364 | Noncanonical amino acid |
| PD-10 desalting column | GE Healthcare | 17085101 | Desalting |
| Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit | NEB | E0554 | Introducing the stop codon |
| BL21 (DE3) cells | NEB | C2527 | Expressing strain |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27106 | Extracting plasmids |
| Ni-NTA resin | QIAGEN | 30210 | Affinity purification resin |
| nicotinamide | Sigma-Aldrich | N3376 | Deacetylase inhibitor |
| β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | Reducing agent |
| BugBuster Protein Extraction Reagent | Sigma-Aldrich | 70584 | Breaking cells |
| Benzonase nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | DNase |
| ECL Western Blotting Substrate | ThermoFisher | 32106 | Chemiluminescence |
| Premixed LB Broth | VWR | 97064 | Cell growth medium |
| Bovine serum albumin | VWR | 97061-416 | western blots blocking |
References
- Krishna, R. G., Wold, F.
- Lothrop, A. P., Torres, M. P., Fuchs, S. M.
- Walsh, C. T. Posttranslational modification of proteins : expanding nature's inventory. , Roberts and Company Publishers. Englewood, Colorado. (2006).
- Khoury, G. A., Baliban, R. C., Floudas, C. A. Proteome-wide post-translational modification statistics: frequency analysis and curation of the swiss-prot database. Sci Rep. 1, (2011).
- Grotenbreg, G., Ploegh, H.
- Arif, M., Selvi, B. R., Kundu, T. K. Lysine acetylation: the tale of a modification from transcription regulation to metabolism. Chembiochem. 11 (11), 1501-1504 (2010).
- Cohen, T., Yao, T. P. AcK-knowledge reversible acetylation. Science's STKE : signal transduction knowledge environment. (245), pe42 (2004).
- Drazic, A., Myklebust, L. M., Ree, R., Arnesen, T.
- Escalante-Semerena, J. C. Nε-acetylation control conserved in all three life domains. Microbe. 5, 340-344 (2010).
- Kouzarides, T. Acetylation: a regulatory modification to rival phosphorylation? The EMBO journal. 19 (6), 1176-1179 (2000).
- Soppa, J. Protein acetylation in archaea, bacteria, and eukaryotes. Archaea. , (2010).
- Verdin, E., Ott, M. 50 years of protein acetylation: from gene regulation to epigenetics, metabolism and beyond. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (4), 258-264 (2015).
- Allfrey, V. G., Faulkner, R., Mirsky, A. E. Acetylation and Methylation of Histones and Their Possible Role in the Regulation of Rna Synthesis. P Natl Acad Sci USA. 51, 786-794 (1964).
- Phillips, D. M. The presence of acetyl groups of histones. Biochem j. 87, 258-263 (1963).
- Sterner, D. E., Berger, S. L. Acetylation of histones and transcription-related factors. Microbiology and molecular biology reviews: MMBR. 64 (2), 435-459 (2000).
- Glozak, M. A., Sengupta, N., Zhang, X., Seto, E. Acetylation and deacetylation of non-histone proteins. Gene. 363, 15-23 (2005).
- Close, P., et al. The emerging role of lysine acetylation of non-nuclear proteins. Cell Mol Life Sci. 67 (8), 1255-1264 (2010).
- Iyer, A., Fairlie, D. P., Brown, L. Lysine acetylation in obesity, diabetes and metabolic disease. Immunol Cell Biol. 90 (1), 39-46 (2012).
- You, L., Nie, J., Sun, W. J., Zheng, Z. Q., Yang, X. J. Lysine acetylation: enzymes, bromodomains and links to different diseases. Essays Biochem. 52, 1-12 (2012).
- Bonnaud, E. M., Suberbielle, E., Malnou, C. E.
- Fukushima, A., Lopaschuk, G. D. Acetylation control of cardiac fatty acid beta-oxidation and energy metabolism in obesity, diabetes, and heart failure. Biochim Biophys Acta. 1862 (12), 2211-2220 (2016).
- Kaypee, S., et al. Aberrant lysine acetylation in tumorigenesis: Implications in the development of therapeutics. Pharmacol Ther. 162, 98-119 (2016).
- Tapias, A., Wang, Z. Q. Lysine Acetylation and Deacetylation in Brain Development and Neuropathies. Genomics Proteomics Bioinformatics. 15 (1), 19-36 (2017).
- Hu, L. I., Lima, B. P., Wolfe, A. J. Bacterial protein acetylation: the dawning of a new age. Molecular microbiology. 77 (1), 15-21 (2010).
- Jones, J. D., O'Connor, C. D.
- Bernal, V., et al. Regulation of bacterial physiology by lysine acetylation of proteins. New biotechnol. 31 (6), 586-595 (2014).
- Hentchel, K. L., Escalante-Semerena, J. C. Acylation of Biomolecules in Prokaryotes: a Widespread Strategy for the Control of Biological Function and Metabolic Stress. Microbiology and molecular biology reviews : MMBR. 79 (3), 321-346 (2015).
- Ouidir, T., Kentache, T., Hardouin, J. Protein lysine acetylation in bacteria: Current state of the art. Proteomics. 16 (2), 301-309 (2016).
- Wolfe, A. J. Bacterial protein acetylation: new discoveries unanswered questions. Curr Genet. 62 (2), 335-341 (2016).
- Albaugh, B. N., Arnold, K. M., Lee, S., Denu, J. M.
- Neumann, H., Peak-Chew, S. Y., Chin, J. W. Genetically encoding Nε-acetyllysine in recombinant proteins. Nat chem biol. 4 (4), 232-234 (2008).
- Fan, C., Xiong, H., Reynolds, N. M., Soll, D. Rationally evolving tRNAPyl for efficient incorporation of noncanonical amino acids. Nucleic Acids Res. 43 (22), e156 (2015).
- Bryson, D., et al. Continuous directed evolution of aminoacyl-tRNA synthetases to alter amino acid specificity and enhance activity. Nat Chem Biol. , (2017).
- Venkat, S., Gregory, C., Sturges, J., Gan, Q., Fan, C. Studying the Lysine Acetylation of Malate Dehydrogenase. J Mol Biol. 429 (9), 1396-1405 (2017).
- Venkat, S., Gregory, C., Gan, Q., Fan, C. Biochemical characterization of the lysine acetylation of tyrosyl-tRNA synthetase in Escherichia coli. Chembiochem. 18 (19), 1928-1934 (2017).
- Liu, C. C., Schultz, P. G. Adding new chemistries to the genetic code. Annu Rev Biochem. 79, 413-444 (2010).
- Mukai, T., Lajoie, M. J., Englert, M., Soll, D.
- O'Donoghue, P., Ling, J., Wang, Y. S., Soll, D. Upgrading protein synthesis for synthetic biology. Nat Chem Biol. 9 (10), 594-598 (2013).
- Chin, J. W. Expanding and reprogramming the genetic code of cells and animals. Annu Rev Biochem. 83, 379-408 (2014).
- O'Donoghue, P., et al. Near-cognate suppression of amber, opal and quadruplet codons competes with aminoacyl-tRNAPyl for genetic code expansion. FEBS Lett. 586 (21), 3931-3937 (2012).
- Aerni, H. R., Shifman, M. A., Rogulina, S., O'Donoghue, P., Rinehart, J. Revealing the amino acid composition of proteins within an expanded genetic code. Nucleic Acids Res. 43 (2), e8 (2015).
- Huang, Y., et al. A convenient method for genetic incorporation of multiple noncanonical amino acids into one protein in Escherichia coli. Mol Biosyst. 6 (4), 683-686 (2010).
- Venkat, S., et al. Genetically encoding thioacetyl-lysine as a nondeacetylatable analog of lysine acetylation in Escherichia coli. FEBS Open. , (2017).
- Wan, W., Tharp, J. M., Liu, W. R. Pyrrolysyl-tRNA synthetase: an ordinary enzyme but an outstanding genetic code expansion tool. Biochim Biophys Acta. 1844 (6), 1059-1070 (2014).
- Gregoretti, I. V., Lee, Y. M., Goodson, H. V. Molecular evolution of the histone deacetylase family: functional implications of phylogenetic analysis. J Mol Biol. 338 (1), 17-31 (2004).
- Weinert, B. T., et al. Acetyl-phosphate is a critical determinant of lysine acetylation in E. coli. Mol cell. 51 (2), 265-272 (2013).
