Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Escherichia Coli proteinler Site-Specifically oluşturmak için Facile iletişim kuralı Acetylated

Published: December 9, 2017 doi: 10.3791/57061
Automatic Translation
1,2, 3, 4, 1, 1,2
1Department of Chemistry and Biochemistry, University of Arkansas, 2Cell and Molecular Biology Program, University of Arkansas, 3Department of Biological Sciences, University of Arkansas, 4Fayetteville High School

Summary

Genetik kod genişleme biyolojik süreçler, protein asetilasyon dahil olmak üzere geniş bir çalışma için güçlü bir araç olarak hizmet vermektedir. Burada biz homojen oluşturmak için bu teknik yararlanma facile bir protokol proteinler, Escherichia coli hücreleri belirli sitelerdeki acetylated göstermek.

Abstract

Proteinlerin belirli konumlarda meydana translasyonel modifikasyonlar hücresel çeşitli önemli rol oynarlar gösterilmiştir. Bunlar arasında tersinir lizin asetilasyon en çok dağıtılmış hayat tüm etki alanlarında biridir. Daha da çok sayıda acetylome kütle spektrometresi tabanlı çalışma gerçekleştirilmiş olsa da, bu sözde asetilasyon hedefler karakterizasyonu sınırlı olmuştur. Olası bir nedeni çoğu klasik biyokimyasal yaklaşım tarafından istenen pozisyonlarda tamamen acetylated proteinleri üretmek zor olmasıdır. Bu zorluğu aşmak için genetik kod genişletme tekniği cotranslational birleşme yönlendirmek için bir mühendislik pyrrolysyl-tRNA sentetaz varyant ve onun soydaş tRNA Methanosarcinaceae türlerden çifti kullanın uygulandı protein ilgi belirli sitesinde acetyllysine. Histon asetilasyon çalışmada ilk uygulama sonra bu yaklaşım asetilasyon çalışmalar proteinler çeşitli kolaylaştırdı. Bu çalışmada, ev sahibi olarak modeli bakteri Escherichia coli kullanarak site-specifically acetylated proteinleri üretmek için facile bir protokol gösterdi. Malat dehidrogenaz gösteri örnek bu eser olarak kullanıldı.

Introduction

Proteinlerin translasyonel modifikasyonlar (PTMs) çeviri işleminden sonra ortaya çıkan ve Fonksiyonel grupların kovalent ilavesi amino asit kalıntıları, gene de dahil olmak üzere hemen hemen tüm biyolojik süreçler içinde önemli roller oynayan ortaya çıkan Transkripsiyon, stres tepkisi, hücresel başkalaşım ve metabolizma1,2,3. Bugüne kadar yaklaşık 400 farklı PTMs saptanan4olmuştur. Onlar protein etkinlik ve yerelleştirme düzenleyen ve proteinler, nükleik asitler, lipidler ve Kofaktörler5gibi diğer molekülleri ile etkileşimi etkileyen genom ve Proteom karışıklık protein PTMs tarafından büyük ölçüde güçlendirilmiş.

Protein asetilasyon son yirmi yılda6,7,8,9,10,11,12PTMs çalışmalarda ön planda olmuştur. Lizin asetilasyon Histon içinde daha 50 yıl önce13,14, iyi incelemiş ve 80'den fazla transkripsiyon faktörleri, düzenleyiciler ve çeşitli proteinler15bulunduğunun bilinmesi was ilk kâşif, 16,17. Protein asetilasyon üzerinde çalışmalar sadece bize onun düzenleyici mekanizmaları daha derin bir anlayış ile sağlanan, ancak da işlevsiz asetilasyon18,19tarafından, neden olduğu hastalıkların bir dizi için Tedaviler güdümlü 20 , 21 , 22 , 23. bu lizin asetilasyon sadece ökaryotlarda olur, ancak son yıllarda yapılan çalışmalarda bu protein asetilasyon de Kemotaksis, asit direnci, harekete geçirmek ve istikrar gibi bakteri fizyolojisi, anahtar rol oynar göstermiştir inanılıyordu patojen Adaları ve diğer virülans proteinler24,25,26,27,28,29ile ilgili.

Biyokimyasal olarak lizin asetilasyon karakterize etmek için yaygın olarak kullanılan bir yöntem sitesi yönetmen mutagenesis kullanıyor. Glutamin benzer büyüklüğü ve polarite nedeniyle acetyllysine bir taklit kullanılır. Pozitif býrakýldýðýnda fizyolojik koşullar altında korur ancak acetylated olamaz beri arginin acetylated lizin taklit kullanılmaktadır. Ancak, her iki taklit eder gerçek isosteres değildir ve her zaman beklenen sonuçları30verir. En titiz yaklaşım olduğu zor veya imkansız en klasik yöntemlerle lizin asetilasyon doğa7,11düşük stoichiometry nedeniyle, belirli lizin artıkları, homojen acetylated proteinler oluşturmaktır. Bu meydan okuma bir mühendislik pyrrolysyl-tRNA sentetaz istihdam genetik kod genişleme stratejisi tarafından sökülmüş tRNA şarj etmek için Methanosarcinaceae türlerden varyantPyl ile acetyllysine, kullanır ev sahibi UAG bastırmak için translasyonel makine mRNA kodon durdurmak ve acetyllysine hedef protein31tasarlanmış pozisyonda birleşme yönlendirir. Son zamanlarda, biz bu sistemi geliştirilmiş bir EF-Tu-bağlama tRNA32 ve yükseltilmiş acetyllysyl-tRNA sentetaz33ile optimize. Ayrıca, Gelişmiş birleşme programında küçük bir sistem asetilasyon çalışmalar malat dehidrogenaz34 ve tyrosyl-tRNA sentetaz35başvurdum. Burada, biz tamamen acetylated Proteinlerin moleküler biyokimyasal kullanıcı kimliğini bir demonstrasyon örnek olarak kapsamlı bir şekilde inceledik malat dehidrogenaz (MDH), kullanarak klonlama üzerinden oluşturma protokolü göstermek.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. site yönettiği Mutagenesis hedef gen

Not: MDH altında T7 organizatörü pCDF-1 vektör CloDF13 kökeni ve 20-4034kopya sayısı ile ifade edilir.

  1. Amber kodonu gen pozisyonda 140 astar tarafından tanıtmak (ileri astar: GGTGTTTATGACEtiketAACAAACTGTTCGGCG ve ters astar: GGCTTTTTTCAGCACTTCAGCAGCAATTGC), site yönettiği mutagenesis kiti öğretim takip.
  2. Vahşi-türü malat dehidrataz gen içeren şablonu plazmid yükseltmek ve Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) tepkimesi tarafından stop kodonu mutasyon ekleyin. Reaksiyon karışımı 2 X DNA polimeraz enzimi Mix 12.5 µL, 10 µM ileri astar, 1,25 µL 10 µM ters astar, şablonun DNA 1 µL 1,25 µL içerir (20 ng/µL) (pCDF-1 plazmid vahşi tipi MDH gen içeren) ve 9 nükleaz ücretsiz su µL.
    1. PCR reaksiyon parametreleri aşağıdaki gibi kullanın: ilk denatürasyon 30 98 ° C'de s; 10 25 döngüleri 98 ° c, 30 s s 55 ° C ve 3 dak 72 ° c; 3 dk 72 ° C'de son uzantısı. PCR sonra güçlendirilmiş malzeme kiti daireselleşmesi ve şablonu kaldırma için oda sıcaklığında 1 h için doğrudan kinaz-ligaz-DpnI enzim karışıma ekleyin.
      Not: 1 µL PCR ürün, 5 µL 2 reaksiyon arabellek X, 10 X kinaz-ligaz-DpnI enzim karışımı 1 µL ve nükleaz ücretsiz su 3 µL tepki karışımı içerir.
  3. 25 µL tüp tepki karışımı 5 µL çözdürülen yetkili E. coli eklemek DH5α hücreleri Takımı'ndan. Dikkatle karışımı için tüp fiske ve buz 30 dk. ısı şok 30 s ve ek 5 min için buz üzerinde yer için 42 ° C'de karışımı karışımı yerleştirin.
    1. Oda sıcaklığında Catabolite baskı (SOC) medya kiti ile süper en iyi suyu 600 µL karışım içine pipet, 250 devir / dakikada sallayarak ile 60 dk 37 ° C'de kuluçkaya, karşılık gelen antibiyotik ile bir lysogeny suyu (LB) agar plaka üzerine 100 µL yaymak ve gecede 37 ° C'de 250 devir / dakikada sallayarak ile kuluçkaya.
  4. 4-6 tek kolonileri 6 mL taze LB ortamla ilgili antibiyotik içine almak ve 37 ° C'de gecede 250 devir / dakikada sallayarak ile kuluçkaya. Plazmid üreticinin el kitabı, sonra Gönder plazmid DNA sıralama stop kodonu mutasyon doğru pozisyonlarda onaylamak için servis saðlayýcýnýzýn protokolüne göre için takip plazmid arıtma seti tarafından her gece kültüründen ayıklayın.
  5. Gerilme-80 ° C'de doğru sırada ile 1 mL gecede kültür ve 300 µL % 100 DMSO karıştırarak saklayın.

2. ifade Acetylated protein

  1. En iyi duruma getirilmiş acetyllysyl-tRNA sentetaz33 genler takın ve tRNA optimizePyl 32 pTech plazmid içine. TRNA sentetaz gen bünye lpp organizatörü altında yerleştirin. TRNA gen bünye proK organizatörü34altında yerleştirin.
    1. Malat dehidrogenaz, mutasyona uğramış etiketi içeren gen içeren ifade vektör34 co dönüştürmek ve en iyi duruma getirilmiş acetyllysine birleşme sistem yataklık plazmid, 25 µL tarafından çözülmüş yetkili E. coli BL21(DE3) hücreleri 10 s ve ek 5 min için buz üzerinde yer için 42 ° C'de ısı şok.
    2. Oda sıcaklığında SOC kitle 600 µL karışım içine pipet, 275 rpm'de sallayarak ile 60 dk 37 ° C'de kuluçkaya, 100 µg/mL streptomisin ve 50 µg/mL kloramfenikol ile bir plaka üzerine 100 µL yaymak ve gecede 37 ° C'de 275 rpm'de sallayarak ile kuluçkaya.
  2. Bir koloni plaka almak ve 100 µg/mL streptomisin ve 50 µg/mL kloramfenikol 250 rpm hızında sallayarak ile 50 mL tüp gecede 37 ° C'de 15 mL taze LB medya içine aşılamak. 300 mL taze LB medya bir 1 L şişesi antibiyotik ile 15 mL gecede kültür aktarmak ve 37 ° C'de 250 devir / dakikada sallayarak ile kuluçkaya.
  3. Acetyllysine 4 ° C'de depolamak 100 mM hisse senedi çözüm yapmak için su ile dağıtılması Absorbans 0,5 600 ulaştığında 5 mM acetyllysine ve 20 mM Nikotinamid (uyku inhibitörü) büyüme ortamına Ekle nm.
    1. 250 devir / dakikada sallayarak 37 ° C'de bir ek 1 h için hücrelerin büyümesine sonra 0,5 mM IPTG protein ifade ekleyin ve 25 ° C'de hücreler gecede, 180 rpm'de sallayarak ile büyümek.
      Not: İfade koşulları farklı proteinler için en iyi duruma getirme gerekebilir.
  4. 3000 x g 15dk için 4 ° c de centrifuging tarafından hücreleri toplamak, süpernatant atmak ve hücre topakları fosfat tamponlu tuz (PBS) arabellek (10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl) ile yıkayın. 10.000 x g 5 min için 4 ° C'de yıkanmış hücreleri toplamak, süpernatant atmak ve hücre granül-80 ° C'de depolayın

3. Acetylated Protein saflaştırma

  1. Buzda donmuş hücre topakları çözülme ve 15 mL ile lizis arabellek (50 mM tris (hydroxymethyl) aminomethane (Tris) pH 7.8, 300 mM NaCl, 20 mM imidazole ve 20 mM Nikotinamid) β-mercaptoethanol ve 1 µL Benzonase nükleaz (250 adet) 5 µL yeniden askıya alma.
  2. Hücreleri tarafından 40 kHz sonication 30 aralıkları tarafından takip 10 s kısa atışlar 10 döngüleri ile çıkış % 70 güçte kırmak için formu ham özü soğutma için s. Santrifüj ham ayıklamak 20.000 x g 4 ° C'de 25 min için de Süpernatant 0,45 µm membran filtre ile filtre ve 1 mL 20 mL su ve lizis arabellek 20 mL equilibrated nikel-nitrilotriacetic asit (Ni-NTA) reçine içeren bir sütun içine yükleyin.
    Not: Sonication kullanılabilir değilse hücreleri da hafif deterjan tarafından kırık.
  3. Sütun yıkama arabelleği (50 mM Tris pH 7.8, 300 mM NaCl, 50 mM imidazole ve 20 mM Nikotinamid) 20 mL ile yıkama ve 2 mL elüsyon arabellek (50 mM Tris pH 7.8, 300 mM NaCl, 150 mM imidazole ve 20 mM Nikotinamid) ile elute.
  4. Elüsyon kesir arabellek (25 mM Tris pH 7.8 ve 10 mM NaCl) desalting ile üreticisinin takip PD-10 sütun tarafından desalt. Eluted protein konsantrasyonu yanında tabi belgili tanımlık öğretim Bradford protein tahlil reaktif ölçmek. Desalted protein daha fazla deneyler için hazır hale geliyor.
    Not: % 50 gliserol stok protein yapmak ve-80 ° C depolama için tutun.

4. biyokimyasal Acetylated Protein karakterizasyonu

  1. SDS-sayfa ve kütle spektrometresi analizleri.
    1. Proteinler 5 min için 105 ° C'de 2 mL tüp içinde Sodyum Lauryl Sülfat (SDS) örnek arabellek (5 µL protein örnek 2 µL 4 X SDS örnek arabellek ile) ile tabiatını, 2000 x g 10 karisimin santrifüj kapasitesi s, 4-%20 Sodyum Lauryl Sülfat polyacrylamide jel electroph üzerine yükleme oresis (SDS-sayfa) jel ve koşmak vasıl 200 V 30 dk için.
    2. Jel distile su ile yıkayın ve yavaşça 5 min için işlemi 3 kez tekrar çalkalanır. Su atın ve jel ile nazik sallayarak ile 1 h için Coomassie mavi leke leke. Distile su ile jel de-leke, 30 dk ve bu de-leke 3 kez tekrar yavaşça salla.
    3. Coomassie mavi lekeli SDS-sayfa jel üzerinde 33 kDa adlı grup kesmek ve kütle spektrometresi tesis veya şirketler acetyllysine tasarlanmış konumda kurulmuştur onaylamak için gönderin.
      Not: Önceki deneme34kütle spektrometresi çözümleme protokolü takip ettim.
  2. Batı kurutma
    1. SDS-sayfa jel adım 4.1 aynı iletişim kuralını çalıştırmak. Jel çalıştırmak sonra jel 15dk için Aktarım arabellek (25 mM Tris, 192 mM glisin, pH 8.3 ve % 20 metanol) ile ıslatın.
    2. 0.2 µm, 7 cm x 8,5 cm polivinilidin difluoride (PVDF) membran metanol 1 dakika ile etkinleştirin ve transfer sandviç hazırlamadan önce Aktarım arabellek ile durulayın.
      Not: Metanol ciltle temas, göz teması, yenmesi veya inhalasyon durumunda zararlıdır. Şiddetli aşırı pozlama ölüme neden olabilir.
    3. Katot anot (sünger, filtre kağıdı, SDS-sayfa jel, PVDF membran, filtre kağıdı ve sünger) transfer sandviç olun. Sürekli mevcut 350 çalıştırın transfer tankında koydum mA 45 dk için.
      Not: Transfer süresi optimizasyonu gerekebilir.
    4. PVDF membran 25 mL Tris arabelleğe alınmış serum fizyolojik, % 0,1 ile yıkayın ara 20 (TBST) (137 mM NaCl, 20 mM Tris, %0.1 ara-20, pH 7,6) arabellek nazik sallayarak ile 5 min için. Membran ile %5 sığır serum albümin (BSA) oda sıcaklığında 1 h için TBST arabellekte engelleyin.
    5. HRP-Birleşik acetyllysine-antikor 1 µg/ml TBST %5 BSA ile 4 ° C'de gecede nazik sallayarak ile seyreltilmiş son bir konsantrasyon ile ile membran kuluçkaya.
      Not: Daha hızlı sonuç için bu adım 1 h için oda sıcaklığında gerçekleştirilebilir. Antikor seyreltme optimizasyonu gerekebilir.
    6. Membran ile 20 mL TBST arabellek ile nazik sallayarak, 5 min için adım 4 kez tekrar yıkayın. Kemiluminesan substrat membran için üreticinin yönergelerini izleyerek uygulanır. Kamera tabanlı bir şarj kuplajlı cihaz (CCD) Imager sinyali yakalamak.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bu vahşi tipi MDH 31 mg-1 L kültür iken acetylated MDH protein verimini 15 mg-1 L kültür, oldu. Şekil 1' de gösterildiği gibi saf protein SDS-PAGE tarafından analiz edildi. Vahşi-türü MDH olumlu denetim34kullanıldı. Acetyllysine (AcK) birleşme sistem ve mutant mdh gen yataklık hücrelerden ama AcK olmadan büyüme medya, saf protein bir negatif kontrol kullanıldı. Lizin asetilasyon saf protein western Blot acetyllysine-antikor Şekil 2' de gösterildiği gibi kullanarak tespit edildi. Lizin kalıntısı 140 malat dehidrogenaz asetilasyon şekil 3' te gösterilen tandem kütle spektrometresi analizi tarafından doğrulandı.

Protein sırası MDH protein (tandem MS analizi için parçası kalın olarak is):

MKVAVLGAAGGIGQALALLLKTQLPSGSELSLYDIAPVTPGVAVDLSHIPTAVKIKGFSGEDAT
PALEGADVVLISAGVARKPGMDRSDLFNVNAGIVKNLVQQVAKTCPKACIGIITNPVNTTVAIAA
EVLKKAGVYDKNKLFGVTTLDIIRSNTFVAELKGKQPGEVEVPVIGGHSGVTILPLLSQVPGV
SFTEQEVADLTKRIQNAGTEVVEAKAGGGSATLSMGQAAARFGLSLVRALQGEQGVVECAY
VEGDGQYARFFSQPLLLGKNGVEERKSIGTLSAFEQNALEGMLDTLKKDIALGEEFVNK

En iyi duruma getirilmiş acetyllysyl-tRNA sentetaz33: protein dizisi

MDKKPLDVLISATGLWMSRTGTLHKIKHYEISRSKIYIEMACGDHLVVNNSRSCRPARAFRYHKY
RKTCKRCRVSDEDINNFLTRSTEGKTSVKVKVVSEPKVKKAMPKSVSRAPKPLENPVSAKAST
DTSRSVPSPAKSTPNSPVPTSASAPALTKSQTDRLEVLLNPKDEISLNSGKPFRELESELLSRR
KKDLQQIYAEERENYLGKLEREITRFFVDRGFLEIKSPILIPLEYIERMGIDNDTELSKQIFRVDKN
FCLRPMMAPNLLNYARKLDRALPDPIKIFEIGPCYRKESDGKEHLEEFTMLNFFQMGSGCTRE
NLESIITDFLNHLGIDFKIVGDSCMVYGDTLDVMHGDLELSSAVVGPIPLDREWGIDKPWIGAGF
GLERLLKVKHDFKNIKRAARSESYYNGISTNL

En iyi duruma getirilmiş tRNA gen dizisiniPyl 32:

GGAAACGTGATCATGTAGATCGAATGGACTCTAAATCCGTTCAGTGGGGTTAGATTCCCC
ACGTTTCCGCCA

Figure 1
Resim 1 : Coomassie mavi lekeli SDS-sayfa jel arıtılmış tam uzunlukta MDH ve onun AcK içeren değişken. Kesirler SDS sayfaya yüklenen elüsyon aynı miktarda jel. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2 : Saf vahşi tipi MDH Batı kurutma, AcK içeren değişken. Elüsyon kesirler aynı miktarda doluydu. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3 : LC-MS/MS analiz AcK içeren MDH varyantın. Peptid (artıkları 135-142) AGVYDKACNK tandem kitle spektrum arıtılmış acetylated MDH değişken üzerinden. KAC AcK birleşme gösterir. AcK içeren peptid kısmi dizisi ek açıklama eklenen b veya y iyon seri okuyabilirsiniz. Eşleşen doruklarına kırmızı vardı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Meşru amino asitler (ncAAs) genetik birleşme ncAA tahsil tRNA tarafından atanan bir kodon, çoğunlukla sarı stop kodonu UAG36,37,38,39, bastırılması dayanmaktadır karşılık gelen antikodon içeren. Bilindiği gibi UAG kodon tarafından yayın faktör-1 (RF1) bakterilerde tanınır ve bu da tarafından soydaş tRNA kurallı amino asitler (cAAs) tarafından tahsil ana bilgisayarlardan yakınındaki lizin ve tirozin40,41gibi bastırılması. Yani, ncAA birleşme saflığı rekabet arasında tRNA ncAA kullanılıyorsa ve cAA-ücret soydaş tRNA yakınındaki kullanır iken ncAA birleşme UAG kodon, verimliliğini ncAA tahsil tRNA ve RF1, arasındaki rekabet bağlıdır. Düşük verim ve saflık acetylated hedef protein düşük birleşme verimliliği konak hücreleri tanıttı ortogonal çiftinin neden olabilir. Acetyllysine medya konsantrasyonu artırmak yoluyla bu sorunu çözmüş ve son zamanlarda kullanarak optimize UAG kodon bastırma 58 kez32,33tarafından artmış, acetyllysine birleşme sistemleri her ikisi de verimlilik ve saflık acetyllysine şirketleşme artacaktır. Olarak gösterildiği şekil 1 ve protein verimleri karşılaştırarak, acetyllysine birleşme verimliliğini yaklaşık % 50 ve AcK birleşme sistemi ve mutant gen MDH, ancak olmadan AcK içinde barındıran hücrelerden saf hiç tespit protein oldu büyüme medya, yüksek saflıkta acetyllysine şirketleşme belirtti. Ayrıca, kütle spektrometresi analiz de herhangi bir cAAs MDH, 140 konumunu, acetyllysine birleşme polimerlerin gösteren belli etmedi.

Bu yaklaşımın iki temel sınırlamalar vardır. İlk olarak, acetyllysine tahsil tRNA ile her iki RF1 ve cAA-ücret soydaş tRNA yukarıda açıklanan yakınındaki rekabet nedeniyle, şu anda, aynı anda tek bir protein dahil olmak acetyllysine artıkları üç sayısıdır 33,42. İkinci olarak, hücrelerin diğer hangi Nikotinamid karşı ve belirli hedef proteinler deacetylate uyku vardır. Yani, bu proteinlerine % 100 asetilasyon belirli sitelerde ulaşmıyor olabilir. Son zamanlarda, biz acetyllysine43deacetylable olmayan bir analog olarak kullanılabilecek bir thio-acetyllysine birleşme sistemi kurduk, böylece bu sistem iyi bir alternatif yaklaşım bu durumda olabilir.

Daha önce belirtildiği gibi biyokimyasal olarak lizin asetilasyon karakterize etmek için klasik yaklaşım site yönettiği mutagenesis kullanıyor. Glutamin acetyllysine taklit kullanılır ve arginin acetylated lizin taklit kullanılmaktadır. Ancak, her iki taklit eder gerçek isosteres değildir ve her zaman beklenen sonuçları30verir. Genetik kod genişleme stratejisi, belirli lizin artıkları, homojen acetylated protein acetylated proteinler karakterize etmek için en zorlu yolu olan üretebilir.

Genetik birleşme sistemi acetyllysine için pyrrolysyl-tRNA sentetaz türevleri ve onların soydaş tRNA da Ökaryotlar44dik olduğu bilinmektedir Methanosarcinaceae türlerden çifti üzerinden türetilmiştir. Önceki çalışmalar göstermiştir bu sistem memeli hücreleri ve bazı hayvanlarda protein asetilasyon çalışmalar39için uygulanan olabilir, böylece mevcut Protokolü memeli hücreleri ve daha geniş tıbbi uygulamalarda için bile hayvanlar için genişletilmiş araştırma ve sanayi. Ayrıca, bu da ncAAs, konak hücre tanıttı ortogonal eşleştirmek için basit bir değişiklik gerektiren farklı türde birleştirmek için kullanılan temelde aynı protokoldür.

Lizin uyku (KDACs) acetylated lizin kalıntı proteinler45içinde asetil grubu kaldırın. Sirtuin türü CobB olduğunu Nikotinamid27tarafından inhibe olabilir E. coli, sadece iyi bilinen deacetylase. Yani, acetylated protein hücre büyümesi ve protein arıtma sırasında oluşturulan deasetilasyonu önlemek için 20-50 mM Nikotinamid büyüme medya ve arıtma arabellekleri eklenmelidir. Saf asetilasyon lizin kalıntılarının deacetylase olmaması nedeniyle nispeten istikrarlı olacak. İkinci olarak, protein, BL21 diğer lizin kalıntılarında, nonspesifik asetilasyon arka düşürmek için (DE3) zorlanma ifade zorlanma nedeniyle önemli ölçüde düşük seviyesine protein asetilasyon daha yaygın olarak kullanılan K12-derived suşlar46 olarak kullanılmıştır . Şekil 2' de gösterildiði gibi BL21(DE3) hücrelerden ifade vahşi tipi MDH western Blot tarafından tespit yok asetilasyon vardı. Bu hedef protein asetilasyon saflığı artırmak için başka bir önemli faktördür.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Bu eser NIH (AI119813), Arkansas Üniversitesi start-up ve Arkansas Biosciences Enstitüsü'nden Ödülü tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bradford protein assay Bio-Rad 5000006 Protein concentration
4x Laemmli Sample Buffer Bio-Rad 1610747 SDS sample buffer
Coomassie G-250 Stain Bio-Rad 1610786 SDS-PAGE gel staining
4-20% SDS-PAGE ready gel Bio-Rad 4561093 Protein determination
Ac-K-100 (HRP Conjugate) Cell Signaling 6952 Antibody
IPTG CHEM-IMPEX 194 Expression inducer
Nε-Acetyl-L-lysine CHEM-IMPEX 5364 Noncanonical amino acid
PD-10 desalting column GE Healthcare 17085101 Desalting
Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit NEB E0554 Introducing the stop codon
BL21 (DE3) cells NEB C2527 Expressing strain
QIAprep Spin Miniprep Kit QIAGEN 27106 Extracting plasmids
Ni-NTA resin QIAGEN 30210 Affinity purification resin
nicotinamide Sigma-Aldrich N3376 Deacetylase inhibitor
β-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250 Reducing agent
BugBuster Protein Extraction Reagent Sigma-Aldrich 70584 Breaking cells
Benzonase nuclease Sigma-Aldrich E1014 DNase
ECL Western Blotting Substrate ThermoFisher 32106 Chemiluminescence
Premixed LB Broth VWR 97064 Cell growth medium
Bovine serum albumin VWR 97061-416 western blots blocking

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Krishna, R. G., Wold, F. Post-translational modification of proteins. Adv Enzymol Relat Areas Mol Biol. 67, 265-298 (1993).
  2. Lothrop, A. P., Torres, M. P., Fuchs, S. M. Deciphering post-translational modification codes. FEBS Lett. 587 (8), 1247-1257 (2013).
  3. Walsh, C. T. Posttranslational modification of proteins : expanding nature's inventory. , Roberts and Company Publishers. Englewood, Colorado. (2006).
  4. Khoury, G. A., Baliban, R. C., Floudas, C. A. Proteome-wide post-translational modification statistics: frequency analysis and curation of the swiss-prot database. Sci Rep. 1, (2011).
  5. Grotenbreg, G., Ploegh, H. Chemical biology: dressed-up proteins. Nature. 446 (7139), 993-995 (2007).
  6. Arif, M., Selvi, B. R., Kundu, T. K. Lysine acetylation: the tale of a modification from transcription regulation to metabolism. Chembiochem. 11 (11), 1501-1504 (2010).
  7. Cohen, T., Yao, T. P. AcK-knowledge reversible acetylation. Science's STKE : signal transduction knowledge environment. (245), pe42 (2004).
  8. Drazic, A., Myklebust, L. M., Ree, R., Arnesen, T. The world of protein acetylation. Biochim Biophys Acta. 1864 (10), 1372-1401 (2016).
  9. Escalante-Semerena, J. C. Nε-acetylation control conserved in all three life domains. Microbe. 5, 340-344 (2010).
  10. Kouzarides, T. Acetylation: a regulatory modification to rival phosphorylation? The EMBO journal. 19 (6), 1176-1179 (2000).
  11. Soppa, J. Protein acetylation in archaea, bacteria, and eukaryotes. Archaea. , (2010).
  12. Verdin, E., Ott, M. 50 years of protein acetylation: from gene regulation to epigenetics, metabolism and beyond. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (4), 258-264 (2015).
  13. Allfrey, V. G., Faulkner, R., Mirsky, A. E. Acetylation and Methylation of Histones and Their Possible Role in the Regulation of Rna Synthesis. P Natl Acad Sci USA. 51, 786-794 (1964).
  14. Phillips, D. M. The presence of acetyl groups of histones. Biochem j. 87, 258-263 (1963).
  15. Sterner, D. E., Berger, S. L. Acetylation of histones and transcription-related factors. Microbiology and molecular biology reviews: MMBR. 64 (2), 435-459 (2000).
  16. Glozak, M. A., Sengupta, N., Zhang, X., Seto, E. Acetylation and deacetylation of non-histone proteins. Gene. 363, 15-23 (2005).
  17. Close, P., et al. The emerging role of lysine acetylation of non-nuclear proteins. Cell Mol Life Sci. 67 (8), 1255-1264 (2010).
  18. Iyer, A., Fairlie, D. P., Brown, L. Lysine acetylation in obesity, diabetes and metabolic disease. Immunol Cell Biol. 90 (1), 39-46 (2012).
  19. You, L., Nie, J., Sun, W. J., Zheng, Z. Q., Yang, X. J. Lysine acetylation: enzymes, bromodomains and links to different diseases. Essays Biochem. 52, 1-12 (2012).
  20. Bonnaud, E. M., Suberbielle, E., Malnou, C. E. Histone acetylation in neuronal (dys)function. Biomol Concepts. 7 (2), 103-116 (2016).
  21. Fukushima, A., Lopaschuk, G. D. Acetylation control of cardiac fatty acid beta-oxidation and energy metabolism in obesity, diabetes, and heart failure. Biochim Biophys Acta. 1862 (12), 2211-2220 (2016).
  22. Kaypee, S., et al. Aberrant lysine acetylation in tumorigenesis: Implications in the development of therapeutics. Pharmacol Ther. 162, 98-119 (2016).
  23. Tapias, A., Wang, Z. Q. Lysine Acetylation and Deacetylation in Brain Development and Neuropathies. Genomics Proteomics Bioinformatics. 15 (1), 19-36 (2017).
  24. Hu, L. I., Lima, B. P., Wolfe, A. J. Bacterial protein acetylation: the dawning of a new age. Molecular microbiology. 77 (1), 15-21 (2010).
  25. Jones, J. D., O'Connor, C. D. Protein acetylation in prokaryotes. Proteomics. 11 (15), 3012-3022 (2011).
  26. Bernal, V., et al. Regulation of bacterial physiology by lysine acetylation of proteins. New biotechnol. 31 (6), 586-595 (2014).
  27. Hentchel, K. L., Escalante-Semerena, J. C. Acylation of Biomolecules in Prokaryotes: a Widespread Strategy for the Control of Biological Function and Metabolic Stress. Microbiology and molecular biology reviews : MMBR. 79 (3), 321-346 (2015).
  28. Ouidir, T., Kentache, T., Hardouin, J. Protein lysine acetylation in bacteria: Current state of the art. Proteomics. 16 (2), 301-309 (2016).
  29. Wolfe, A. J. Bacterial protein acetylation: new discoveries unanswered questions. Curr Genet. 62 (2), 335-341 (2016).
  30. Albaugh, B. N., Arnold, K. M., Lee, S., Denu, J. M. Autoacetylation of the histone acetyltransferase Rtt109. J Biol Chem. 286 (28), 24694-24701 (2011).
  31. Neumann, H., Peak-Chew, S. Y., Chin, J. W. Genetically encoding Nε-acetyllysine in recombinant proteins. Nat chem biol. 4 (4), 232-234 (2008).
  32. Fan, C., Xiong, H., Reynolds, N. M., Soll, D. Rationally evolving tRNAPyl for efficient incorporation of noncanonical amino acids. Nucleic Acids Res. 43 (22), e156 (2015).
  33. Bryson, D., et al. Continuous directed evolution of aminoacyl-tRNA synthetases to alter amino acid specificity and enhance activity. Nat Chem Biol. , (2017).
  34. Venkat, S., Gregory, C., Sturges, J., Gan, Q., Fan, C. Studying the Lysine Acetylation of Malate Dehydrogenase. J Mol Biol. 429 (9), 1396-1405 (2017).
  35. Venkat, S., Gregory, C., Gan, Q., Fan, C. Biochemical characterization of the lysine acetylation of tyrosyl-tRNA synthetase in Escherichia coli. Chembiochem. 18 (19), 1928-1934 (2017).
  36. Liu, C. C., Schultz, P. G. Adding new chemistries to the genetic code. Annu Rev Biochem. 79, 413-444 (2010).
  37. Mukai, T., Lajoie, M. J., Englert, M., Soll, D. Rewriting the Genetic Code. Annu Rev Microbiol. , (2017).
  38. O'Donoghue, P., Ling, J., Wang, Y. S., Soll, D. Upgrading protein synthesis for synthetic biology. Nat Chem Biol. 9 (10), 594-598 (2013).
  39. Chin, J. W. Expanding and reprogramming the genetic code of cells and animals. Annu Rev Biochem. 83, 379-408 (2014).
  40. O'Donoghue, P., et al. Near-cognate suppression of amber, opal and quadruplet codons competes with aminoacyl-tRNAPyl for genetic code expansion. FEBS Lett. 586 (21), 3931-3937 (2012).
  41. Aerni, H. R., Shifman, M. A., Rogulina, S., O'Donoghue, P., Rinehart, J. Revealing the amino acid composition of proteins within an expanded genetic code. Nucleic Acids Res. 43 (2), e8 (2015).
  42. Huang, Y., et al. A convenient method for genetic incorporation of multiple noncanonical amino acids into one protein in Escherichia coli. Mol Biosyst. 6 (4), 683-686 (2010).
  43. Venkat, S., et al. Genetically encoding thioacetyl-lysine as a nondeacetylatable analog of lysine acetylation in Escherichia coli. FEBS Open. , (2017).
  44. Wan, W., Tharp, J. M., Liu, W. R. Pyrrolysyl-tRNA synthetase: an ordinary enzyme but an outstanding genetic code expansion tool. Biochim Biophys Acta. 1844 (6), 1059-1070 (2014).
  45. Gregoretti, I. V., Lee, Y. M., Goodson, H. V. Molecular evolution of the histone deacetylase family: functional implications of phylogenetic analysis. J Mol Biol. 338 (1), 17-31 (2004).
  46. Weinert, B. T., et al. Acetyl-phosphate is a critical determinant of lysine acetylation in E. coli. Mol cell. 51 (2), 265-272 (2013).

Tags

İmmünoloji sayı: 130 Protein asetilasyon translasyon modifikasyon genetik kod genişleme meşru amino asitler malat dehidrogenaz sentetik Biyoloji
<em>Escherichia Coli</em> proteinler Site-Specifically oluşturmak için Facile iletişim kuralı Acetylated
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Venkat, S., Gregory, C., Meng, K.,… More

Venkat, S., Gregory, C., Meng, K., Gan, Q., Fan, C. A Facile Protocol to Generate Site-Specifically Acetylated Proteins in Escherichia Coli. J. Vis. Exp. (130), e57061, doi:10.3791/57061 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter