Summary
Dieser Artikel beschreibt eine einfache Protein Microarray Methode für Clostridium Difficile Antigene im menschlichen Serum Profilerstellung humorale Immunantworten auf einer 7-Plex Jury hoch gereinigt werden. Das Protokoll kann zur Bestimmung der spezifischen Antikörperantworten in die Vorbereitungen der polyklonalen intravenöses Immunglobulin erweitert werden.
Abstract
Wir bieten eine detaillierte Übersicht über ein neuartiges Hochdurchsatz-Protein-Microarray-Assay für die Bestimmung der Anti -Clostridium Difficile -Antikörpern im menschlichen Serum und in separaten Vorbereitungen von polyklonalen intravenöses Immunglobulin (IVIg). Das Protokoll beschreibt die methodischen Schritte zur Probenvorbereitung, Druck von Arrays, Testverfahren und Datenanalyse. Darüber hinaus könnte dieses Protokolls weiter ausgebaut werden, um vielfältigen klinischen Proben einschließlich Plasma und Zell-Kultur Überstände. Wir zeigen, wie Protein Microarray verwendet werden kann, um festzustellen, eine Kombination aus Isotype (IgG, IgA, IgM), Unterklasse (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2) und Stamm-spezifische Antikörper gegen hoch gereinigt ganze C. Difficile Toxin A und B (Toxinotype 0, Stamm VPI 10463, ribotyp 087), Toxin B aus einem C. Difficile Toxin-B-nur mit dem Ausdruck ihrer Stamm (CCUG 20309), eine Vorstufe-Form eines B-Fragments des binären Toxins, pCDTb, ribotyp-spezifische ganze Oberflächenschicht Proteine (SLPs, 001, 002, 027), und Steuern Proteine (Tetanus Toxoid und Candida Albicans). Während des Experiments sind Microarrays sondiert mit Sera von Einzelpersonen mit C. Difficile -Infektion (CDI), Einzelpersonen mit Cystischer Fibrose (CF) ohne Durchfall, gesunden Kontrollpersonen (HC), und von Einzelpersonen Pre- und Post-IVIg Therapie für die Behandlung von CDI, kombinierte Immundefizienz Unordnung und chronisch entzündliche demyelinisierende polyradikulopathie. Wir begegnen erhebliche Unterschiede in Toxin Neutralisation Wirksamkeiten und Multi-Isotype spezifischen Antikörpertiter Patientengruppen, kommerzielle Vorbereitung der IVIg, und Sera vor und nach IVIg Verabreichung. Außerdem gibt es eine signifikante Korrelation zwischen Microarray und Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay (ELISA) für Antitoxin-IgG-Werte in Serumproben. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass diese Microarray ein viel versprechendes Instrument für die Profilerstellung Antikörperantworten auf C.difficile Antigene in geimpften oder infizierten Menschen werden könnte. Mit der Verfeinerung der Antigen-Panels und eine Reduzierung der Produktionskosten rechnen wir Microarray-Technologie optimieren und wählen Sie die klinisch nützlichen Immuntherapien für C. Difficile Infektion in einer Patienten-spezifischen Weise helfen kann.
Introduction
Dieses Protokoll beschreibt die Entwicklung und Validierung eines neuartigen und kundenspezifische Protein Microarray Assays für die Erkennung und semi-Quantifizierung der Bakterienstamm und Isotype-spezifischen Antikörper-Reaktionen auf C. Difficile -Antigene. Wir nutzen erfolgreich unsere C. Difficile-spezifische Microarray-Assay als viel versprechende neue Werkzeug für die kompositorische Bioanalytik der spezifischen Antikörper Inhalte in Patientenseren1,2, Vorbereitungen von IVIg3, und Kennung der Antikörper-Besonderheiten, die mit schlechten Ergebnissen im CDI4korrelieren. Wir zeigen wie Biobanked Serumproben und kommerzielle Vorbereitung der IVIg auf Microarray Folien, analysiert werden können, ermöglicht qualitativ hochwertige reproduzierbare profiling von C. Difficile Erreger-spezifischen Antikörper-Reaktionen in diesem Assay.
Viele gesunde Kinder und Erwachsene haben nachweisbar Serum IgG und IgA Antikörper gegen C. Difficile Toxine A und B5,6. Diese werden gedacht, um nach vorübergehender Exposition in der Kindheit und nach Exposition gegenüber C. Difficile im Erwachsenenalter auftreten. Aus diesem Grund wurde polyklonale IVIg off-Label-zur Behandlung von wiederkehrenden und fulminanten CDI7,8,9verwendet. Seine endgültige Rolle und Wirkungsweise bleibt jedoch unklar. Mehrere Studien haben gezeigt, dass die Humorale Immunantwort auf C. Difficile Toxine in Krankheit Präsentation und das Ergebnis eine Rolle spielt. Insbesondere zeigen asymptomatische Patienten eine erhöhte Serum Anti-Toxin A IgG Konzentration im Vergleich zu Patienten, die Symptomen der Krankheit10zu entwickeln. Eine nachweisbare Verbindung wurde für mittlere Anti-Toxin-A IgG-Titer und 30-Tage Mortalität aller Ursachen11berichtet. Mehrere Berichte haben auch gezeigt, dass eine Vereinigung mit einem Schutz gegen Rezidive und Antikörper Reaktionen auf Toxin A, B und mehrere nicht-Toxin-Antigene (Cwp66, Cwp84, FliC, FliD und Oberflächenschicht Proteine (SLPs))12,13 , 14 , 15. diese Beobachtungen haben die Entwicklung der ersten passiven Immuntherapie Drug targeting C. Difficile Toxin B (Bezlotuxumab), die vor kurzem von der US Food and Drug Administration und die Europäische Arzneimittel-Agentur genehmigt wurde angespornt Agentur für die Prävention von wiederkehrenden CDI16. Impfstrategien mit inaktivierten Toxinen oder rekombinantes Toxin Fragmente sind auch derzeit in der Entwicklung17,18,19. Diese neue Therapieansätze werden zweifellos die Voraussetzung für die Bewertung der humoralen Immunantwort auf mehrere Antigene in große Stichprobenumfänge stimulieren.
Heute gibt es ein bemerkenswerten Mangel an handelsüblichen Hochdurchsatz-Assays in der Lage, gleichzeitig Bakterienstamm und Isotype-spezifischen Antikörper-Reaktionen auf C. Difficile -Antigene zu beurteilen. Es besteht ein ungedeckter Bedarf, solche Tests Erleichterung künftiger Forschung und klinische Anwendungen zu entwickeln. Protein Microarrays sind eine Methode, um große Anzahl von einzeln-gereinigte Proteine als räumlich organisierten Array von Flecken auf einer mikroskopischen folienbasierten Oberfläche zu immobilisieren, mit einem Robot-System, die entweder ein Kontakt20 oder ein berührungsloses sein kann Drucken Tool21. Die Spots können komplexe Mischungen wie Zelle Lysates, Antikörper, Gewebe Homogenates, endogenen oder rekombinante Proteine oder Peptide, Körperflüssigkeiten oder Drogen22,23darstellen.
Protein-Microarray-Technologie bietet deutliche Vorteile gegenüber standard im Haus ELISA-Techniken, die traditionell verwendet wurden, um Anti -C. Difficile Antikörperantworten zu beurteilen. Dazu gehören eine erhöhte Kapazität für eine Reihe von Multi-Isotype-spezifische Antikörper gegen eine umfangreichere Gruppe von Protein-Targets, geringerer Anforderungen für Antigene, Proben und Reagenzien, Erkennung und eine verbesserte Fähigkeit, eine größere integrieren Anzahl der technischen Replikationen, zusätzlich mehrere interne Qualitätskontrolle (QC) misst1. Microarrays sind daher sensibel, präzise und reproduzierbare und haben einen größeren Dynamikbereich. Diese Faktoren machen Microarrays eine billigere und potenziell günstige Alternative zu ELISAs für die groß angelegte Erkennung von bekannten Proteinen. Jedoch Nachteile der Microarray-Technologie resultieren im Wesentlichen aus der große Vorabkosten zugeordnet zur Gründung einer Gruppe von hochgereinigten Antigenen und die technologische Plattform einrichten.
Protein Microarrays haben in den letzten zwei Jahrzehnten als Diagnose- und grundlegende Recherche-Tool in der klinischen Anwendung intensiv genutzt. Spezielle Anwendungen sind Protein-Expression profiling, das Studium der Enzym-Substrat-Beziehungen, Biomarker Screening, Analyse von Host-Mikroben-Interaktionen und profiling Antikörper Spezifität23,24, 25,26,27,28. Viele neue Erreger Protein/Antigen Microarrays entstanden unter anderem Malaria (Plasmodium)29, HIV-130, Grippe31, schwere akute respiratorische Syndrom (SARS)32, virale hämorrhagische Fieber33, , Herpesviren34und Tuberkulose35.
Dieses Protokoll bezieht sich auf die Einrichtung eine einfach operative C. Difficile reaktive Antigen Microarray Assay, ermöglicht präzise, genaue und spezifische Quantifizierung der Multi-Isotype und Stamm-spezifischen Antikörper-Reaktionen auf C. Difficile Antigene in Sera und polyklonalen IVIg. Hier zählen wir repräsentative Ergebnisse in Bezug auf eine akzeptable Microarray Testleistung im Vergleich zu ELISA sowie Assay-Präzision und Reproduzierbarkeit Profile. Dieser Test könnte weiter entwickelt werden, um andere klinikmustern Profil und setzt einen neuen Standard für die Forschung in der molekularen Grundlagen des CDI.
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Protocol
1. Vorbereitung einer Microarray-Platte
- C. Difficile Antigene mit einem Drucken Puffer [PBS-Tween-Trehalose (50 mM)] bei der optimalen Konzentration (das vordefiniert wurde vor dem Ausführen der Patientenseren) verdünnen: Toxin ein (200 µg/mL) und Toxin B (100 µg/mL), pCDTb (200 µg/mL) und gereinigte Native ganze SLPs abgeleitet ribotypen 001 und 002 027 (200 µg/mL).
Hinweis: Toxin B war ein Toxin B exprimierenden Stamm CCUG 20309 (90 µg/mL) entnommen.- Die Positivkontrollen Lysates von C. Albicansund Tetanus-Toxoid mit dem Drucken Puffer bei 100 µg/mL zu verdünnen. Zu guter Letzt Verdünnen der gereinigten Immunglobulin vom Menschen passend getesteten Antikörper Isotype seriell, beginnend bei 50 µg/mL über 10 Verdünnungen im Drucken Puffer eine Kalibrierkurve erstellen.
- Übertragen Sie 10 µL Verdünnungen im Drucken Puffer in einem 384-Well-Platte.
- Die Platte mit einer Platte Dichtung und Zentrifuge bei 300 X g für 5 min abdecken.
2. Druck-Arrays mit einem Kontakt Roboter
- Hitze der Silizium-Pin mit der Hand Gasbrenner 3 x 2 s und spülen in sauberem Wasser 3 x 3 s.
- Platzieren Sie die Microarray-Platte, in die Patrone geladen von der Arrayer.
- Der Diahalter aminosilan Folien auflegen.
Hinweis: Der Diahalter fasst 27 Folien: drei Reihen von neun Folien. Die Folien sind im Hochformat, die ausgehend von der linken Seite der unteren Reihe angeordnet und der Rest der Räume sind bedeckt mit leeren Folien um sicherzustellen, dass die Löcher auf den Diahalter abgedeckt sind.- Drücken Sie "OK" und überprüfen Sie, dass ein Vakuum aktiviert wurde und alle Folien sicher sind. Verlassen Sie die Folien in der feuchten Umgebung für mindestens 1 h vor dem Start des Drucks.
Hinweis: Die aminosilan Folien sind in einem versiegelten Beutel mit Trockenmittel ausgestattet. Einmal geöffnet, sollten alle unbenutzten Folien sofort in den Exsikkator für Lagerung bis zum Verfallsdatum zurückgegeben werden.
- Drücken Sie "OK" und überprüfen Sie, dass ein Vakuum aktiviert wurde und alle Folien sicher sind. Verlassen Sie die Folien in der feuchten Umgebung für mindestens 1 h vor dem Start des Drucks.
- Clostridium Difficile Antigene Drucken geeignet Drucken Programm eingerichtet. Starten Sie die TAS-Anwendungs-Suite und öffnen Sie die erforderlichen Druckparameter laufen-Datei aus dem Verzeichnis "My Gridding läuft". Wählen Sie Clostridium Difficile -Datei für den Druck die Clostridium Difficile -Antigene in vervierfacht.
- Nach Doppelklick auf das MicroArray-Symbol im Hauptfenster erscheint ein Fenster mit drei Registerkarten genannt "MicroArraying Parameter". Die drei Registerkarten sind "Quelle", "Target" und "Optionen". Die Registerkarte "Quelle" zeigt Details die Anzahl der Stichproben in der Microarray-Platte verwendet. Registerkarte "Target" zeigt Details wie die Folien sind geladen werden, wo das Array auf die Folie gedruckt werden soll und das Folienlayout (16 Subarrays Formate) zu bearbeiten. Die Registerkarte "Optionen" zeigt Details der waschen Protokoll und Tool verwendet zBwerden. Waschen Sie nach jedem abgeschlossenen Probe. Reinigen Sie die Silizium-Pin zwischen Proben, Kreuzkontamination zwischen verschiedenen Proben zu vermeiden.
- Die Programmiermöglichkeiten befinden sich unter Optionen > führen Sie Einstellungen in der TAS-Anwendungs-Suite-Symbolleiste. Es gibt 9 Registerkarten in diesem Abschnitt durcharbeiten und wie Sie komplette ein Tab zum nächsten wechseln indem Sie darauf klicken. Klick auf "OK" Schaltfläche gelangen Sie aus "Run Vorlieben." Im Register "Allgemein" den "Run-Einstellungen" gibt es eine Reihe von Kontrollkästchen unter diesem Abschnitt in Bezug auf das Instrument Verhalten wird, wenn eine Programm gestartet wird. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen "Prime Bad vor Beginn der Ausführung" alle drei Waschstationen durchläuft eine kurze Priming-Sequenz vor laufen. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen "Waschen bei Beginn der Ausführung", das Stift-Werkzeug wird gewaschen werden, bevor die erste Quelle besuchen. "Wash am Ende des Laufs" das Kontrollkästchen, das Stift-Werkzeug wird gewaschen werden, nachdem die letzte Quelle zu besuchen. Der Benutzer kann die Anzahl der Waschgänge festlegen. Starten Sie im Register "Klima" der "Run-Einstellungen" die Befeuchtung. Die Einstellung, die wir verwenden sind wie folgt: start Preis 55 %, Ausführen von 55 %, minimum Luftfeuchtigkeit 55 %, Ziel Luftfeuchtigkeit 60 %. Starten Sie den Durchlauf nicht, bis die soll-Luftfeuchtigkeit erreicht wurde, ansonsten die Spots die falsche Größe werden und die Bibliothek wird schnell verdunsten.
- Klicken Sie in der Menü Bar des TAS auf grüne gehen. Starten Sie den Durchlauf und in regelmäßigen Abständen zu beobachten Sie, dass die Arrayer während der Auflage zu bestimmten alles in Ordnung ist.
Hinweis: Dies ermöglicht die Analyse von 15 Proben parallel auf jeder Folie ein Unterarray als Negativkontrolle verwendet wird. Das Design von Teilmatrizen richtet sich nach der Anzahl der gedruckten Proteine (Antigene) und die Anzahl der gedruckten biologischen repliziert.
Hinweis: Nach dem Drucken jede Probe, der Kopf bewegt sich in Richtung der waschbäder erlauben mehrere Eintauchen des Stiftes in zwei waschen Bäder mit destilliertem Wasser und 0,002 % Tween 20 für 1.5 s in jedem Bad, gefolgt von der Pin mit Reinstwasser Spülung und Trocknung den Stift im die wichtigsten Waschstation für 4 s.
3. Lagerung der Arrays
- Halten Sie die gedruckten Folien, die über Nacht bei Raumtemperatur in den Exsikkator gelagert.
Hinweis: Die bedruckten Folien können bis zu einer Woche aufbewahrt werden.
(4) Array sondieren
- Platzieren Sie sorgfältig gedruckte Folien in einen Diahalter 16 Multi-gut Kammern Format.
Hinweis: Die Kammern, mit einer Tiefe von ca. 7,5 mm bieten eine großzügige Fläche Volumen-Verhältnis zu mischen und Waschschritte. - Lassen Sie alle Reagenzien vor Gebrauch auf Zimmertemperatur erwärmen. Sofern nicht anders angegeben, führen Sie die folgenden Schritte bei Raumtemperatur.
- Fügen Sie 100 µL gefilterte 5 % Rinderserumalbumin Tweens (BSAT; Gebrauch einer 0,2 µm Spritze Filter), jeder block, decken die Folien und inkubieren sie mit Schütteln für 1 h.
- Waschen der Dias 5 x 1 min in 120 µL Phosphat gepufferte Kochsalzlösung mit Tween 20 (PBST; 0,1 % Tween) pro Bohrloch mit schütteln. Lassen Sie sich nicht die Folien austrocknen.
- Die Serumproben für 20 min auf Eis Auftauen und mit Hintergrund verringern Komponente jede Probe mit einem handelsüblichen Antikörper Verdünnungsmittel verdünnen (siehe Tabelle der Materialien).
- Optimieren Sie die Verdünnung die Serumproben nach der getesteten Immunglobulin, wie in Tabelle 2dargestellt.
- Alle Blöcke mit einer Ausnahme, die als Negativkontrolle verwendet werden übermitteln Sie 100 µL verdünnter Serumproben; dieser Block fügen Sie nur 100 µL Antikörper Verdünnungsmittel hinzu. Inkubieren Sie die Folien mit sanften Agitation für 1 h.
- Die Objektträger 5 x 3 min in 120 µL PBST waschen (0,1 % Tween) pro Bohrloch mit schütteln.
- Fügen Sie 100 µL eines biotinylierte Ziege Anti-Human-Antikörpers mit Antikörper Verdünnungsmittel verdünnt.
- Optimieren Sie die Verdünnung der Sekundärantikörper nach der getesteten Immunglobulin, wie in Tabelle 2beschrieben. Decken Sie die Folien und inkubieren sie mit sanft Schütteln für 1 h.
- Waschen Sie die Folien 5 x 3 min in 120 µL PBST pro Bohrloch mit zitternden.
- Jeder Block verdünnt 1: 2000 in 5 % BSA fügen Sie 100 µL Streptavidin Cy5 hinzu. Decken Sie die Folien mit einer Folie zum Schutz vor Licht, während 15 min. unter Rühren sanft schütteln.
- Waschen Sie die Dias 5 x 1 min in 120 µL der PBST pro Bohrloch mit schütteln, gefolgt von 2 Wäschen von 1 min in PBS nur mit zittern.
- Drehen Sie die Folien für 5 min bei 300 X g zu trocknen.
- Halten Sie die Folien in einer dunklen Box für Transport und Lagerung bei Raumtemperatur.
- Gehen Sie zum Scannen die Arrays sofort um Signal Konsistenz nach sondieren zu gewährleisten.
Hinweis: Allerdings sondierten Folien können im Dunkeln aufbewahrt und innerhalb einer Woche nach sondieren gescannt.
5. Scannen die Arrays
- Schalten Sie den Laserscanner (siehe Tabelle der Materialien) 30 min vor dem Scannen zum Aufwärmen des Lasers. Laden Sie die Scanner-Software und verbinden Sie den Computer mit dem Scanner.
- Legen Sie eine Folie mit der beschrifteten Seite nach oben in den Scanner, bis das Spiel leuchtet grün Lämpchen.
- Drücken Sie die Schaltfläche " Einstellungen " und passen Sie die folgenden Einstellungen beim Scannen von Dias wie folgt:-Scan-Modus, Median; Erwerb, 635 nur; Akquisitionsmodus, Handbuch; Gewinn, 20; Power, Low; Folie Typ, unbeschriftete Folie; Fokus, Autofokus. Deaktivieren Sie automatischer Bildlauf und Barcode Reading Pixel Größe 10 und Scannen 35.
- Speichern Sie die resultierenden Bilder als 16-Bit-Graustufen mehrere Bild-TIFF-Format. Drücken Sie die Schaltfläche " Import Grid " und wählen Sie die entsprechende Arrayliste.
Hinweis: Die Array-Liste beschreibt die Größe und Position von Teilmatrizen und die Namen der bedruckten Stoffe verbunden mit jedem Feature-Indikator.- Richten Sie das Gitter, um die Flecken auf der Folie.
- Analysieren Sie die Bilder durch Drücken der Taste Quantifizierung Prozess um die Fluoreszenz Signalintensitäten an jeder Stelle zu messen und die Ergebnisse in einem Textformat namens GenePix Ergebnisse (GPR) speichern.
Hinweis: Die GPR-Datei enthält die Lokalisierung und Identifizierung Variablen Antigen Ziele auf das Array und auch der mittlere Fluoreszenzintensität und lokalen Hintergrund, der die Antikörperbindung darstellt signalisieren Werte von jedem Fleck.
(6) Datenanalyse
- Den Median für die Wiederholungen der jedes Antigen nach Hintergrundabzug mit eine kostenlose Microarray-Analyse-Software namens reverse Phase Protein Arrays (RPPA) Analyzer, ein Modul innerhalb der statistischen Sprache auf CRAN36R zu berechnen.
- Plot der Standardkurve und interpolieren die Signale der jedes Antigen im Verhältnis zu der Immunglobulin-Standardkurve mit kommerziellen wissenschaftliche Grafik und Statistik-Software (siehe Tabelle der Materialien), die Antikörpertiter zu berechnen.
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Representative Results
Abbildung 1 zeigt ein Flussdiagramm, beschreibt die wichtigsten Schritte in der beschriebenen Protokoll. Abbildung 2 zeigt Spearman Korrelationstests zeigen bedeutende Abkommen zwischen Microarray und ELISA für IgG und IgA Anti-Toxin A und B im Patiententest Sera Ebenen. Abbildung 3 zeigt differenzierte IgG und IgA Antikörper-Klasse spezifische antikörperreaktionen auf Toxin A und Toxin B binäres Toxin (pCDTb) in Patienten mit CF ohne Durchfall, CDI Patienten mit Durchfall und in HC. Abbildung 4 zeigt C. Difficile Antitoxin neutralisierende antikörperreaktionen in der Patientenseren. Abbildung 5 zeigt die immune Reaktivität (gegen C. Difficile Toxine und SLPs) und neutralisierende Wirkung (gegen C. Difficile Toxine) von IVIg. Abbildung 6 zeigt die immune Reaktivität (gegen C. Difficile Toxine und SLPs) und neutralisierende Wirkung (gegen C. Difficile Toxine) der Patientenseren Pre- und Post-IVIg-Verwaltung. Tabelle 1 zeigt akzeptable Intra - und inter - assay Koeffizienten der Variabilität der Microarray mit Testseren. Tabelle 2 zeigt eine Liste der Immunglobuline, die in dieser Studie mit relevanten Konzentrationen der gereinigten Proteine sowie optimierte Verdünnungen für Sera und Sekundärantikörper verwendet.
Abbildung 1 : Allgemeine Übersicht über wichtige Schritte der Microarray-Protokolls beteiligt. Der erste Schritt ist die Vorbereitung der Antigene und Steuerelemente. Die anschließende Probe Verdünnungen sind in Bereitschaft für den Druck im Quadruplicates auf die aminosilan Folien auf 384-Platte übertragen. Nach Trocknung und Sperrung von Folien, werden die Arrays mit Patientenserum inkubiert. Nach dem weiter waschen, wird die biotinylierte Anti-Human-Immunglobulin (Ig) der angegebenen Isotype hinzugefügt. Nach dem letzten Waschen und Trocknen Schritte die Dias gescannt und die daraus resultierenden Bilder mit einem Microarray Bildanalyse-Software verarbeitet. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : Korrelation zwischen Microarray und ELISA-Ergebnisse. Der Korrelationskoeffizient Spearman wurde verwendet, um den Grad an Übereinstimmung zwischen den beiden Plattformen zu beurteilen. Vergleicht man die Microarray-Leistung mit einem hauseigenen Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay (ELISA), A. eine gute Korrelationskoeffizient wurde für Toxin A beobachtet (R = 0.7051; P < 0,0001), B. und eine mäßig gute Korrelation für Toxin B (R = 0.5809; P < 0,0001). Das vollständige Protokoll ELISA wurde detailliert an anderer Stelle37. Diese Zahl hat aus Negm Et Al. nachgedruckt 1 mit freundlicher Genehmigung. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Isotype-spezifische Antikörper-Reaktionen auf Clostridium Difficile Toxine. Dieses Bild sät die Serum Anti-Toxin IgG und IgA Reaktionen (Toxinotype 0, Stamm VPI 10463, ribotyp 087; Toxin A bei 200 µg/mL, Toxin B 100 µg/ml), Toxin B (C. Difficile Toxin B-produzierenden Stamm CCUG 20309; Toxin B 90 µg/ml) und die Form der Vorläufer einer b Fragment des binären Toxins, pCDTb (200 µg/mL), bei Patienten mit zystischer Fibrose (CF) ohne Durchfall, Patienten mit C. Difficile -Infektion (CDI) mit Durchfall, und bei gesunden Kontrollpersonen (HC). Die Serum-Verdünnung für IgG und IgA sind 1: 500 und 1: 100, beziehungsweise. Die Unterschiede zwischen den Gruppen wurden anhand des Kruskal-Wallis-Tests, gefolgt von Dunns post-hoc-Test für mehrere Antworten. Im Vergleich mit dem HC (n = 17) und Patienten mit symptomatischer CDI (n = 16), die Erwachsenen CF-Patienten (n = 16) ausgestellt, deutlich höhere Serum IgA Anti-Toxin A und B Level; P ≤0.05. Das gleiche Muster setzte sich für IgG, außer, dass es keinen Unterschied in den Anti-Toxin A IgG Ebenen zwischen den Gruppen. Die Box und Whisker-Plots repräsentieren den Median, Reichweite und Quartile. P ≤0.0001; P ≤0.01; P ≤0.05. Die standardisierte Signale sind auf der Immunglobulin-Standardkurve normalisiert. Diese Zahl hat aus Monaghan Et Al. nachgedruckt 2 mit Genehmigung. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: neutralisieren Antikörper Wirksamkeiten, C. Difficile Toxin A und B im Patienten Sera. Diese Abbildung zeigt die schützende neutralisierende Antikörper (NAb) Antworten auf C. Difficile Toxin A und B [Toxinotype 0, Stamm VPI 10463, ribotyp 087, verwendet um eine 50 % tödliche Dosis (LD50)] im Sera (1: 100 Verdünnung; Toxin A 2,5 ng/mL, Toxin B 0,5 ng/mL) aus der HC , die CF-Patienten ohne Durchfall und die Patienten mit CDI mit Durchfall. Die Seren von CF-Patienten zeigten deutlich stärkere schützende Anti-Toxin NAb Antworten im Vergleich mit dem Sera von HC (Toxin A und B) und von den Patienten mit CDI (Toxin A). Die Unterschiede zwischen den Gruppen wurden anhand des Kruskal-Wallis-Tests, gefolgt von Dunns post-hoc-Test für mehrere Antworten. Die Box und Whisker-Plots repräsentieren den Median, Reichweite und Quartile. P ≤0.01; P ≤0.05. Diese Zahl hat aus Monaghan Et Al. nachgedruckt 2 mit Genehmigung. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5 : Immune Reaktivität und neutralisierende Wirkung von IVIg, C.difficile Antigene. A. dieses Bild zeigt die Reaktivität des Multi-Isotype spezifische Antikörper gegen Antigene von C. Difficile in kommerziellen intravenöses Immunglobulin (IVIg) Vorbereitungen. Die Heatmap zeigt das Niveau der Klassen spezifischer Antikörper (IgG, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgA1, IgA2 und IgM) in drei handelsübliche Präparate (siehe Tabelle der Materialien) gegen sieben C. Difficile -Antigene [Toxin ein (200 µg /mL), Toxin B (100 µg/mL), pCDTb (200 µg/mL), Toxin B (CCUG 20309; 90 µg/mL), und der Oberfläche Schicht Proteine (SLPs) 001 und 002 027 (alle 200 µg/mL)] mit Protein-Microarray-Technologie. Der Farbcode der Heat map ist wie folgt: grün (niedrig) bis rot (hoch) Signalintensität. Die Signalwerte auf der Farbskala für die Heatmap vertreten sind log2 von willkürlichen Fluoreszenz-Einheiten (AFU) umgewandelt. Bitte signalisiert beachten Sie, dass die AFU vor kurzem durch den Deskriptor standardisiert abgelöst wurde2. Die gesamten IgG und IgG1, IgG2 Klassen gab die höchsten Bindung Reaktivitäten gegen Toxin A, Toxin B, binäres Toxin (pCDTb) und Toxin B (CCUG 20309). B. diese Diagramme zeigen die IVIg Neutralisation Wirksamkeit gegen die native C. Difficile ganze Toxin A und B. Sie geben den Prozentsatz des Effekts schützende Neutralisation von Handelsprodukten IVIg gegen C. Difficile Toxine A und B. Jedes Grundstück stellt den Median der dreifacher Experimente bei 1: 100 Verdünnung. IVIg Vorbereitung 1 weist die niedrigste Schutzwirkung gegenüber IVIg-Präparate 2 und 3, insbesondere gegen Toxin A. *** P ≤0.0001; P ≤0.05 (One-Way Varianzanalyse). Diese Zahl wurde von Negm Et Al. modifiziert 3 mit Erlaubnis. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 6 : Immune Reaktivität und neutralisierende Wirkung des Patienten Sera auf C. Difficile -Antigene. A. diese Abbildung zeigt einen Vergleich der Reaktivitäten Antikörper gegen C. Difficile Proteine im Serum von Patienten vor und nach der IVIg-Infusion. Die Heatmap zeigt die Expression von Klassen (IgG, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgA1, IgA2 und IgM) im Serumproben bei sieben Patienten vor und nach der IVIg-Infusion gegen sieben C. Difficile -Antigene [Toxin ein (200 µg/mL), Toxin B (100 µg / (mL), pCDTb (200 µg/mL), Toxin B (CCUG 20309; 90 µg/mL), und SLPs 001 und 002 027 (alle 200 µg/mL)] mit Protein-Microarray-Technologie. Der Farbcode der Heat map ist wie folgt: grün (niedrig) bis rot (hoch) Signalintensität. Die Signalwerte auf der Farbskala für die Heatmap vertreten sind von der AFU log2 umgewandelt. Bitte beachten Sie, dass die AFU jüngerer durch standardisierte Signale2abgelöst wurde. Es war eine nach dem Aufguss Erweiterung der gesamten IgG, IgG1, IgG2 und IgG3 Reaktivitäten Toxin A und Toxin B pCDTb. B. dieses Bild zeigt die IgG-Reaktionen auf Toxin A, Toxin B, und binäres Toxin (pCDTb), Pre- und Post-IVIg-Verwaltung. Die Gesamt-IgG-Werte gegen alle Gifte zeigen einen deutlichen Anstieg nach der IVIg-Administration (mit dem Wilcoxon-unterzeichnet-Rank-Test). Jedes Grundstück stellt den Median der dreifacher Experimente am 01:10 Verdünnung. C. diese Diagramme zeigen die Neutralisation Wirkung gegen native C. Difficile Toxin A und B nach Gabe von IVIg. Ein Vergleich der Prä- und Post-Infusion neutralisierende Antikörper Aktivitäten zeigt eine verbesserte Schutzwirkung nach IVIg Infusionen gegen die Native C. Difficile Toxin A und B. Jedes Grundstück stellt den Median der dreifacher Experimente am 01:10 Verdünnung. Eine signifikante Erhöhung der Schutzwirkung gegen Toxine A und B wurde in der Patientenseren getestet-Post-IVIg-Infusion (mit dem Wilcoxon-unterzeichnet-Rank-Test) festgestellt. Diese Zahl hat aus Negm Et al.nachgedruckt. 3 mit Erlaubnis. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
| Reproduzierbarkeit | Toxin A | Toxin B | SLP001 | SLP002 | SLP027 | Toxin B CCUG 20309 | pCDTb |
| Intra-assay | 7,70 % | 6.40 % | 7,40 % | 5,10 % | 7.60 % | 7 % | 3,70 % |
| Inter-assay | 9.10 % | 9.10 % | 7,40 % | 11.20 % | 12.8 | 9.70 % | 12,50 % |
Tabelle 1: Microarray-Intra-Assay und Inter-Assay-Präzision 1. Microarray Intra - und inter - assay Variabilitäten wurden mit dem Sera von 7 Patienten berechnet. Identische Proben wurden auf jedem der beiden Folien zu zwei unabhängigen Zeitpunkten untersucht. Alle Antigene (n = 7 Test und n = 2 steuert) wurden in Wiederholungen von fünf auf jedem Array entdeckt.
| Gereinigtes Protein-Konzentration | Serum-Verdünnung | Sekundärantikörper Verdünnung | |
| IgG | 50 μg/ml | 1/500 | 1/20000 |
| IgG1 | 200 μg/ml | 1/100 | 1/5000 |
| IgG2 | 200 μg/ml | 1/100 | 1/10000 |
| IgG3 | 200 μg/ml | 1/100 | 1/5000 |
| IgG4 | 200 μg/ml | 1/100 | 1/5000 |
| IgA | 50 μg/ml | 1/100 | 1/5000 |
| IgA1 | 200 μg/ml | 1/100 | 1/10000 |
| IgA2 | 200 μg/ml | 1/100 | 1/5000 |
| IgM | 50 μg/ml | 1/500 | 1/20000 |
Tabelle 2: Liste der in dieser Studie verwendeten Immunglobuline. Die Igs sind mit den relevanten gereinigtes proteinkonzentrationen (µg/mL) und Verdünnungen für Serum und Sekundärantikörper gezeigt.
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Discussion
In diesem Protokoll haben wir gezeigt, dass diese Microarray eine geeignete Plattform für die Humorale Immunantwort auf C. Difficile -Protein-Antigene in Patientenseren (Abbildungen 3 und 6) und kommerzielle Vorbereitung der IVIg (Abbildung 5) Definition ist. Wir haben auch gezeigt, dass die Microarray-Technik führt auch im Vergleich zu konventionellen ELISA (Abbildung 2) und zeigt hervorragende Reproduzierbarkeit mit Intra - und inter - assay Variabilitäten in zulässigen Grenzen der Präzision ( fallen Tabelle 1).
Wichtige Schritte:
Eine Reihe von kritischen Schritte muss befolgt werden, wenn jeder erfolgreichen Antigen-Microarray-Plattform zu erstellen. Zunächst ist es extrem wichtig, QC Experimente laufen. In den QC-Experimenten sollten verschiedene Parameter wie die Auswahl des geeigneten Oberflächenchemie, Drucken Puffer, blockierende Puffer Verdünnungen der Serumproben und die sekundäre Antikörper evaluiert werden. Diese Experimente müssen mit dem Ziel der Bereitstellung einer gut validierte und zuverlässige Technik38,39durchgeführt werden.
Die Auswahl eines geeigneten Protein Immobilisierung Prozesses ist einer der wichtigsten Schritte in Microarray Analysen, um eine qualitativ hochwertige Leistung der getesteten aminosilan Folien zu gewährleisten, wie in dieser Studie zu sehen. Es ist wichtig, regelmäßige und kreisförmigen Fleck Morphologie, hohen und speziellen Signalintensität und einen klaren Hintergrund zu beobachten. Ein weiterer Faktor, der die Microarray-Leistung ist der Druck Puffer, der ebenso wichtig für die Erreichung die gewünschten Oberflächenchemie um einheitliche und regelmäßige Flecken auf der Folie zu produzieren ist.
Es ist wichtig, die richtigen Einstellungen für den Druck zu wählen, da dies die optimale Größe und Form eines Spots, die gedruckt werden kann. Beispielsweise sollte die Luftfeuchtigkeit rund 55 % während des Druckens beibehalten werden weil ohne Feuchtigkeit die Rate von Verdampfung in der Microarray-Kammer steigt und weniger Flecken werden gedruckt.
Unspezifische Proteinbindung ist ein weiterer Faktor, der Auswirkungen auf den Hintergrund und spot Signale; Daher könnten geeignete Auswahl eines blockierenden Puffers unspezifische Bindung, was zu verbesserten Empfindlichkeit und Genauigkeit der Array Daten39reduzieren.
Modifikationen und Fehlerbehebung:
Antigene und Serumproben müssen sein regelmäñig und kleinere Speicher-Röhren in der Tiefkühltruhe gelagert bis zur Verwendung, die hilft zu vermeiden wiederholt mehrere Gefrier-tau-Zyklen, die die Signalstärke des Arrays verschlechtern können. Um die Chancen für ein erfolgreiches Experiment zu erhöhen, die Reagenzien müssen frisch zubereitet und gefiltert werden. Reinigung der Arrayer vor dem Drucken und überprüfen die Einstellungen erforderlich sind. Darüber hinaus muss der Diahalter Hintergrundgeräusche minimiert sauber sein.
Einschränkungen:
Die Anwendung von Protein Microarrays wird derzeit durch die strengen Anforderungen an Oberflächenchemie in Protein Microarray Herstellung behindert. Hier erfordert die große Variation in den chemischen und physikalischen Eigenschaften der Proteinmoleküle Custom-Design einzigartige Oberflächenchemie für verschiedene Klassen von Protein und Antikörper-Moleküle40. Andere technische Herausforderungen für die weit verbreitete Implementierung einer solchen Technologie gehört die Notwendigkeit für teure Spezialausrüstung und Software mit Bank-Platz sowie Berücksichtigung der Wartungsgebühren, komplexe Datenanalyse, relative Protein Quantifizierung und kritisch Zugriff auf gereinigten Antigene.
Bedeutung der Methode in Bezug auf bestehende/Alternative Methoden:
Microarray-Technologie ist im Prinzip ähnlich Luminex Immunoassays, ELISA oder Meso Scale Entdeckung aber ist anpassbar, kann ausgeweitet werden, um statistische Trennschärfe zu erreichen, stützt sich auf nur Mikroliter Mengen an wertvollen Proben und hat die Fähigkeit, Bildschirm sera für mehrere Protein Reaktivitäten. Es eignet sich daher besonders für großflächige, historische Serum Banken und Entdeckung von Biomarkern und Screening.
Zukünftige Anwendungen oder Richtungen der Methode:
Zukünftige Anstrengungen zur Optimierung der Assay für andere Proben (Zelle Überstände), mit der Assay als prognostische Werkzeug für Patienten Schichtung, extern validieren potenzielle Biomarker mit großer Kohorten in einer Doppelblind-Mode gerichtet werden und Vorhersage und Optimierung der Reaktion auf Immuntherapie (mAb, Impfstoffe). In Zukunft könnte die Microarray-Technologie in einem Krankenhaus als ein nützliches Diagnose-Tool oder einen Medikament Behandlungsplan über einen bestimmten Zeitraum hinweg überwachen verwendet werden.
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Disclosures
Keine.
Acknowledgments
Diese Forschung wurde durch eine Hermes-Fellowship Ola Negm und Tanya Monaghan und durch gesonderte Finanzierung von Nottingham verdauungsfördernden Krankheiten Zentrum und die NIHR Nottingham verdauungsfördernden Krankheiten Biomedical Research Centre unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BioRobotics MicroGrid II arrayer | Digilab, Malborough, MA, USA | N/A | Contact arrayer used to automated spotting of the antigens onto the slides. |
| Scanner InnoScan 710. | Innopsys | N/A | A fluorescent microarray slide scanner with a red (Cy5) laser to read the reaction. |
| MAPIX software version 7.2.0 | Innopsys | N/A | Measure signal intensities of the spots. |
| Silicon contact pin | Parallel Synthesis Technologies | SMT-P75 | Print the samples onto the slides. |
| Thermo Scientific Nalgene Desiccator | Thermo Scientific | 41102426 | To store the new and printed slides. |
| 384-well plate | Genetix | X7022UN | To prepare the antigens. |
| Plate cover | Sigma Aldrich, UK | CLS6570-100EA | To reduce evaporation of the samples. |
| Aminosilane slides | Schott, Germany | 1064875 | The slide of choice for printing the antigens. |
| Slide holders | GraceBio Labs, USA | 204862 | Divide the slides into identical 16 subarrays. These holders are re-usable, removable, leak-proof wells . |
| Candida albicans lysate | NIBSC | PR-BA117-S | Positive control |
| Tetanus Toxoid | Athens Research and Technology | 04/150 | Positive control |
| Immunoglobulin G (IgG), Normal Human Plasma | Athens research and technology | 16-16-090707 | Purified Native Human Immunoglobulin G IgG, Human Plasma. |
| Immunoglobulin G1 (IgG1), Normal Human Plasma | Athens research and technology | 16-16-090707-1 | Purified Native Human Immunoglobulin G1 IgG1, Human Plasma. |
| Immunoglobulin G2 (IgG2), Normal Human Plasma | Athens research and technology | 16-16-090707-2 | Purified Native Human Immunoglobulin G2 IgG2, Human Plasma. |
| Immunoglobulin G3 (IgG3), Normal Human Plasma | Athens research and technology | 16-16-090707-3 | Purified Native Human Immunoglobulin G3 IgG3, Human Plasma. |
| Immunoglobulin G4 (IgG4), Normal Human Plasma | Athens research and technology | 16-16-090707-4 | Purified Native Human Immunoglobulin G4 IgG4, Human Plasma. |
| Immunoglobulin A (IgA), Human Plasma | Athens research and technology | 16-16-090701 | Purified Native Human Immunoglobulin A (IgA), Human Plasma. |
| Immunoglobulin A1 (IgA1), Human Myeloma Plasma | Athens research and technology | 16-16-090701-1M | Purified Native Human Immunoglobulin A1 (IgA1), Human Plasma. |
| Immunoglobulin A2 (IgA2), Human Myeloma Plasma | Athens research and technology | 16-16-090701-2M | Purified Native Human Immunoglobulin A2 (IgA2), Human Plasma. |
| Immunoglobulin M (IgM), Human Plasma | Athens research and technology | 16-16-090713 | Purified Native Human Immunoglobulin M (IgM), Human Plasma. |
| Biotinylated Goat Anti-Human IgG Antibody, gamma chain specific | Vector Labs | BA-3080 | Goat anti- human IgG (γ-chain specific)-biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins. |
| Mouse Anti-Human IgG1 Hinge-BIOT | Southern Biotec | 9052-08 | Goat anti- human IgG1 biotin antibody reacts specifically with human IgG1 but not with other immunoglobulins. |
| Mouse Anti-Human IgG2 Fc-BIOT | Southern Biotec | 9060-08 | Goat anti- human IgG2 -biotin antibody reacts specifically with human IgG 2but not with other immunoglobulins. |
| Mouse Anti-Human IgG3 Hinge-BIOT | Southern Biotec | 9210-08 | Goat anti- human IgG3-biotin antibody reacts specifically with human IgG3 but not with other immunoglobulins. |
| Mouse Anti-Human IgG4 pFc'-BIOT | Southern Biotec | 9190-08 | Goat anti- human IgG-biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins. |
| Anti-Human IgA, alpha chain specific, made in goat - Biotinylated | Vector Labs | BA-3030 | Goat anti- human IgG -biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins. |
| Mouse Anti-Human IgA1-BIOT | Southern Biotec | 9130-08 | Goat anti- human IgG -biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins. |
| Mouse Anti-Human IgA2-BIOT | Southern Biotec | 9140-08 | Goat anti- human IgG -biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins. |
| Mouse Anti-Human IgM-BIOT | Southern Biotec | 9020-08 | Goat anti- human IgG-biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins. |
| 0.2 mm syringe filter | Thermo scientific | 723-2520 | Filter the 5% BSA. |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich, UK | A7284 | Use 5% BSA for blocking the slides. |
| Antibody diluent | Dako, UK | S3022 | To dilute the serum and the secondary antibody. |
| Streptavidin Cy5 | eBioscience | SA1011 | Detection of the immune reaction. |
| Purified whole C. difficile toxins A and B (toxinotype 0, strain VPI 10463, ribotype 087) | Toxins Group, Public Health England | NA | |
| Purified whole C. difficile toxin B (CCUG 20309 toxin B only expressing strain) | Toxins Group, Public Health England | NA | |
| Precursor form of B fragment of binary toxin, pCDTb | University of Bath | NA | Produced in E. Coli from wholly synthetic recombinant gene construct. Amino acid sequence based on published sequence from 027 ribotype (http:www.uniprot.org/uniprot/A8DS70) |
| Purified native whole ribotype-specific (001, 002, 027) surface layer proteins | Dublin City University | NA | |
| Vigam (IVIg preparation 1) | Nottingham University Hospitals NHS Trust | N/A | |
| Privigen (IVIg preparation 2) | Nottingham University Hospitals NHS Trust | N/A | |
| Intratect (IVIg preparation 3) | Nottingham University Hospitals NHS Trust | N/A |
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