Summary
Bir 7-plex panel humoral bağışıklık yanıtlarını yüksek profil oluşturma saf insan sera içinde Clostridium difficile antijenleri için bu makalede basit protein mikroarray yöntemi açıklanır. Protokol spesifik antikor yanıt müstahzarları poliklonal intravenöz immünglobulin belirlenmesi için genişletilebilir.
Abstract
Clostridium difficile antikor düzeyleri insan sera ve poliklonal intravenöz immünglobulin (IVIG) ayrı hazırlıklar belirlenmesi anti - için bir roman yüksek üretilen iş protein mikroarray tahlil ayrıntılı bir özetini sağlar. Protokol numune hazırlama, diziler, tahlil yordam ve veri analizi yazdırma ilgili metodolojik adımları açıklar. Ayrıca, bu iletişim kuralı plazma dahil olmak üzere çeşitli klinik örnekler dahil ve kültür supernatants hücre için daha fazla geliştirilebilir. Protein mikroarray izotip (IgA, IgG, IgM), alt sınıf (Igg1, Igg2, Igg3, Igg4, Iga1, Iga2) bir arada belirlemek için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir ve zorlanma özel antikorlar için son derece saf tüm C. difficile toksinler A ve B (toxinotype 0, zorlanma VPI 10463, ribotype 087), toksin B bir C. difficile toksin B yalnızca ifade zorlanma (CCUG 20309), ikili toksin, pCDTb, ribotype özgü tüm yüzey katman protein B parçası habercisi şeklinde (SLPs; 001 002, 027) ve kontrol proteinler (tetanoz toksoidi ve Candida albicans). Deneme sırasında microarrays sera C. difficile enfeksiyon (CDI), kistik fibrozis (CF) ishal, sağlıklı kontrol (HC), olmadan kişilerle olan bireyler ve bireyler öncesi ve sonrası-IVIG tedavisi ile probed tedavi CDI, kombine immün yetmezlik hastalığı ve kronik inflamatuvar demiyelinizan polyradiculopathy. Hasta grupları, IVIG, ve sera önce ticari hazırlıkları ve aşağıdaki IVIG yönetim arasında önemli farklılıklar toksini nötralize efficacies ve multi-izotip spesifik antikor düzeyleri karşılaşıyoruz. Ayrıca, serum örneklerinde antitoksin IgG düzeyleri için Mikroarray ve enzim bağlı immunosorbent assay (ELISA) arasında önemli bir ilişki yoktur. Bu sonuçlar bu Mikroarray antikor yanıt C.difficile antijenleri aşı veya enfekte insanlar için profil oluşturma için umut verici bir araç haline gelebilir öneririz. İle arıtma antijen panelleri ve üretim maliyetleri azaltma biz Mikroarray teknoloji optimize etmek ve C. difficile enfeksiyon için en klinik olarak yararlı immunotherapies bir hastaya özgü şekilde seçin yardımcı olabilir tahmin.
Introduction
Bu iletişim kuralı geliştirme ve tespiti için bir roman ve özelleştirilmiş protein mikroarray testin geçerliliği ve bakteriyel zorlanma ve C. difficile antijenleri izotip özgü antikor yanıt yarı miktar açıklanmaktadır. Başarılı bir şekilde bizim C. difficilekullanmak-belirli Mikroarray tahlil Kompozisyon bioanalysis hasta sera1,2, hazırlıklar IVIG3, spesifik antikor içerik için umut verici yeni bir araç olarak ve CDI4yoksul sonuçları ile ilişkili antikor özelliklerine tanımlaması. Biobanked serum numuneleri ve IVIG ticari hazırlıkları Mikroarray slaytlarda nasıl çözümlenebilir C. difficile patojen özgü antikor yanıt bu tahlil tekrarlanabilir yüksek kaliteli profilleme izin göstermektedir.
Birçok sağlıklı çocuk ve yetişkin tespit serum IgG ve IgA antikorları C. difficile toksinler A ve B5,6var. Bunlar bebeklik ve C. difficile maruz yetişkinlikte takip sırasında geçici pozlama ardından ortaya çıkan düşünülmektedir. Bu nedenle, poliklonal IVIG olmuştur dışı tekrarlayan ve fulminan CDI7,8,9tedavi etmek için kullanılır. Ancak, onun kesin rolünü ve eylem kalır belirsiz. C. difficile toksinler humoral bağışıklık yanıtı hastalığı sunum ve sonucu bir rol oynar çeşitli çalışmalar göstermiştir. Özellikle, asemptomatik Hastalar semptomatik hastalık10geliştirmek hastalara göre bir artan serum Anti-toksin A IgG konsantrasyon göster. Kanıtlanabilir bir dernek medyan Anti-toksin A IgG titreleri ve 30 günlük all-neden ölüm11için rapor edildi. Çeşitli raporlar da yineleme ve antikor yanıt toksin A, B ve birkaç sigara toksin antijenleri (Cwp66, Cwp84, FliC, hızlı ve yüzey katman proteinleri (SLPs)) karşı bir koruma ile bir ilişki ortaya koymuştur12,13 , 14 , 15. bu gözlemler son zamanlarda ABD Gıda ve ilaç idaresi ve Avrupa İlaç tarafından onaylanıp gelişme ilk pasif immünoterapi uyuşturucu hedefleme C. difficile toksini B (bezlotuxumab), mahmuzlu Tekrarlayan CDI16önlenmesi için Ajansı. Inaktif toksinler, uyuşturucu ve rekombinant toksin parçaları kullanarak aşılama stratejileri de vardır şu anda altında geliştirme17,18,19. Bu yeni tedavi yaklaşımları şüphesiz örneklerin boyutu büyük içinde birden çok antijenleri humoral bağışıklık yanıtlarını değerlendirmek için gereksinimin teşvik edecek.
Bugün, aynı anda bakteriyel zorlanma ve C. difficile antijenleri izotip özgü antikor yanıt değerlendirirken yetenekli ticari olarak mevcut yüksek üretilen iş deneyleri önemli bir eksikliği var. Gelecekteki araştırma çabalarını ve klinik uygulamaları kolaylaştırmak için bu tür deneyleri geliştirmek için bir karşılanmamış ihtiyaç vardır. Protein microarrays kişi20 veya olmayan bir kişi olabilir bir robotik sistem kullanarak çok sayıda tek tek saf protein lekelerin mikroskobik bir slayt tabanlı yüzeye dağınık şekilde organize bir dizi olarak hareketsiz için bir yöntemdir baskı aracı21. Noktalar hücre lysates, antikor, doku homogenates, endojen veya rekombinant proteinler veya peptidler, vücut sıvıları veya uyuşturucu22,23gibi karmaşık karışımlar temsil edebilir.
Protein mikroarray teknolojisi standart kurum içi ELISA ayrı avantaj geleneksel anti -C. difficile antikor yanıt değerlendirmek için kullanılan teknikleri sunar. Bunlar çok izotip özel antikorlar hedeflerinden protein, düşük hacim gereksinimleri antijenleri, örnekleri ve reaktifler, daha geniş bir panel karşı bir dizi tespit için artan bir kapasite dahil ve bir daha büyük dahil etmek için geliştirilmiş bir yetenek birden çok iç kalite kontrol (QC) yanı sıra teknik çoğaltır sayısı1ölçer. Microarrays bu nedenle daha doğru duyarlı ve tekrarlanabilir ve büyük bir dinamik alana sahip. Bu faktörler microarrays bilinen proteinler büyük ölçekli tespiti için ELISAs için potansiyel olarak uygun ve ucuz bir alternatif olun. Ancak, esas olarak bir panel yüksek oranda saflaştırılmış antijenleri kurulması ve teknolojik platformu kurma ile ilgili büyük ön maliyetleri Mikroarray teknoloji dezavantajları sonucu.
Protein microarrays klinik uygulamalarında tanılama ve temel araştırma aracı olarak son yirmi yılda yoğun olarak kullanılmaktadır. Belirli uygulamaları, enzim-substrat ilişkileri, biyomarker tarama, ana bilgisayar-mikrop etkileşimlerin analizi çalışma profil oluşturma ve antikor özgüllük23,24, profil oluşturma protein ifade 25,26,27,28. Birçok yeni patojen protein/antijen microarrays, sıtma (Plasmodium)29, HIV-130, grip31, şiddetli akut solunum Sendromu (SARS)32, viral kanamalı ateşi33 de dahil olmak üzere kurulmuş olan , herpesviruses34ve tüberküloz35.
Mevcut Protokolü doru, hassas ve belirli miktar multi-izotip ve C. zorlanma özgü antikor yanıt sağlayan bir kolay işletim C. difficile reaktif antijen Mikroarray yöntemi, kurulması ile ilgilidir difficile sera ve poliklonal IVIG antijenleri. Burada, ELISA yanı sıra tahlil hassasiyet ve tekrarlanabilirlik için profilleri karşılaştırıldığında bir kabul edilebilir Mikroarray tahlil performans için ilgili temsilcisi sonuçları içerir. Bu tahlil diğer klinik örnekler profil için daha fazla geliştirilebilir ve CDI moleküler temeli araştırma için yeni bir standart ayarlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. hazırlanması Mikroarray plaka
- C. difficile antijenleri Yazdırma arabelleği [PBS-ara-trehalose (50 mM)] ile (ki hasta sera çalıştırmadan önce önceden tanımlanmış) en iyi konsantrasyon, seyreltik: toksin bir (200 µg/mL) ve toksin B (100 µg/mL), pCDTb (200 µg/mL) ve arıtılmış yerli Tüm SLPs elde edilen ribotypes 001, 002 ve 027 (200 µg/mL).
Not: Toksin B bir toksin B ifade zorlanma CCUG 20309 (90 µg/mL) elde edildi.- Pozitif denetimleri, lysates C. albicansve tetanoz toksoidi 100 µg/mL, Yazdırma arabelleği ile sulandırmak. Son olarak, seri olarak test edilmiş antikor izotip eşleştirme, 50 µg/mL bir kalibrasyon eğrisi oluşturmak için Yazdırma arabelleği 10 dilutions arasında başlayan arıtılmış insan immünoglobulin oranında seyreltin.
- Yazdırma arabelleği dilutions 10 µL 384-şey plaka aktarın.
- Bir plaka mühür ve 5 min için 300 x g, santrifüj ile plaka kapak.
2. kişi bir Robot dizilerle yazdırma
- Isı her el gaz brülörlü 3 x 2 s kullanarak silikon PIN ve temiz su 3 x 3 s durulama.
- Mikrodizi plaka arrayer yükleme kartuşu yerleştirin.
- Aminosilane Slaytları Slayt tepsiye yerleştirin.
Not: 27 Slaytları Slayt tepsi tutabilir: dokuz slayt üç sıra. Slaytları dikey yönlendirmeli alttaki sol taraftan başlayarak halinde düzenlenir ve alanlarda diğer slayt tepsisindeki tüm delikleri kapalı olduğunu emin olmak için boş slaytlar ile kaplıdır.- OK tuşuna basın ve bir vakum açık durumda ve tüm slaytlara güvenli kontrol. Slaytları Yazdır başlamadan önce en az 1 h için nemli ortamda bırakın.
Not: Aminosilane slaytlar mühürlü bir çantada kurutucu ile sağlanır. Bir kez açıldı, kullanılmayan herhangi bir slayt için depolama sona erme tarihine kadar desiccator hemen döndürülmelidir.
- OK tuşuna basın ve bir vakum açık durumda ve tüm slaytlara güvenli kontrol. Slaytları Yazdır başlamadan önce en az 1 h için nemli ortamda bırakın.
- Uygun yazdırma programı Clostridium difficile antijenleri yazdıracak şekilde ayarlayın. TAS Application Suite başlatmak ve gerekli yazdırma çalışma parametreleri dosya 'My uygun çalışır' dizininden açın. Clostridium difficile dosya quadruplicate içinde Clostridium difficile antijenleri yazdırmak için seçin.
- Ana penceresinde Mikroarray simgesini çift tıklatarak üzerine üç sekmeli bir pencere-ecek gözükmek denilen 'MicroArraying parametreler'. "Kaynak,"Hedef"ve"Seçenekler"" üç sekme vardır "Kaynak" sekmesini ayrıntıları Mikroarray tabak içinde kullanılan örnek sayısını gösterir. "Hedef" sekmesi slaytları dizi slayt üzerinde yazılı olmalı ve slayt düzenini (16 THUMBNAIL biçimleri) düzenlemek nerede yüklenmesi şeklini ayrıntılarını gösterir. "Seçenekler" sekmesini yıkama Protokolü ve kullanılan Örneğinaraç ayrıntılarını gösterir. sonra tamamlanmış her örnek yıkayın. Silikon PIN farklı örnekleri arasında herhangi bir çapraz bulaşma kaçınmak için örnek arasında temiz.
- Programlama seçenekleri Seçenekler'in altında yer alır > çalıştırmak tercihleri TAS Application Suite araç çubuğunda. Bu bölümde ile çalışmak 9 sekme vardır ve siz tam bir sekmeyi taşımak sonraki tıklayarak. "Tamam" düğmesine tıklayarak "Çalıştır tercihleri dışında." götürecek "Çalışma tercihleri" "Genel" sekmesinde, bir program başladığında nasıl araç davranacaktır için ilgili bu bölüm altında birkaç onay kutusu vardır. "Prime banyo önce başlamak-in koşmak" kutuyu tüm üç yıkama istasyonları kısa astar sıra önce çalışma başına geçirecek. İlk kaynak ziyaret etmeden önce yıkanmış onay kutusunu "Çalıştır başında yıka", PIN aracı. Onay kutusunu "Çalıştır sonunda yıkama" son kaynak ziyaret ettikten sonra PIN aracı yıkanmış. Kullanıcı yıkama döngüleri sayısını ayarlayabilirsiniz. "İklim" sekmesinde "Çalıştır tercihleri" nemlendirme başlatın. Kullandığımız ayarı aşağıdaki gibidir: oranı % 55, Başlat Çalıştır oranı %55, en düşük nem oranı % 55, hedef nem oranı % 60. Koşmak kadar hedef nem ulaşıldı, aksi takdirde belgili tanımlık yer-ecek var olmak yanlış beden ve Kütüphane hızla buharlaşır gider başlatmayın.
- Menü çubuğu TAS, yeşil Git düğmesini tıklatın. Çalıştır başlatın ve düzenli aralıklarla belirli her şey olmak arrayer yazdırma çalışma sırasında sorun değil gözlemlemek.
Not: bir THUMBNAIL bir negatif kontrol kullanıldığı gibi bu analiz paralel her bir slayt üzerinde 15 örnekleri sağlar. Subarrays tasarım yazdırılan proteinler (antijen) sayısına göre belirlenir ve yazdırılan biyolojik sayısını çoğaltır.
Not: her örnek yazdırdıktan sonra kafa doğru Yıkama banyolar birden çok PIN distile su ve %0,002 içeren iki yıkama banyo daldırma izin vermek için hamle ara 20 1,5 için PIN ultra saf su ile durulama ve kurutma iğne tarafından takip her banyoda s 4 ana yıkama istasyonu s.
3. depolama dizileri
- Yazdırılmış slaytlar gecede desiccator oda sıcaklığında saklanan tutmak.
Not: Bir hafta kadar yazdırılmış slaytlar depolanabilir.
4. dizi sondalama
- Dikkatle yazdırılmış slaytlar 16 çok iyi odaları biçimi bir slayt tutucu içinde yer.
Not: yaklaşık 7.5 mm derinliğe sahip odalar, karıştırma ve adımları yıkama kolaylaştırmak için hacim oranı için cömert bir yüzey sağlar. - Oda sıcaklığında kullanmadan önce ısıtmak tüm reaktifler izin. Aksi belirtilmediği sürece, oda sıcaklığında tüm aşağıdaki adımları gerçekleştirin.
- Filtre uygulanmış %5 Sığır serum albümin aranın (BSAT; kullanım 0.2 µm şırınga filtre) her blok ve slaytlar kapağı için 1 h sallayarak ile kuluçkaya 100 µL ekleyin.
- Slayt 5 x 1 dk her tamponlanmış fosfat 120 µL içinde ara 20 ile serum fizyolojik yıkayın (PBST; % 0,1 ara) başına sallayarak ile iyi. Slaytlar kurumasına izin vermeyin.
- Serum numuneleri 20 dk için buz çözme ve her örnek ile piyasada bulunan antikor Dilüent bileşen azaltarak arka plan ile seyreltik ( Tablo malzemelerigörmek).
- Serum örnekleri test immünglobulin göre seyreltme Tablo 2' de gösterildiği gibi optimize edin.
- Biri, bir negatif kontrol kullanılan hariç tüm blokları için 100 µL seyreltik serum örneklerinin transfer; Bu blok, antikor Dilüent 100 µL sadece eklemek. 1s için nazik ajitasyon ile slaytlar kuluçkaya.
- Slayt 5 x 3 dk PBST 120 µL içinde yıkayın (% 0,1 ara) başına sallayarak ile iyi.
- Bir biotinylated keçi anti-insan antikor antikor Dilüent ile seyreltilmiş 100 µL ekleyin.
- İkincil antikor test immünglobulin göre seyreltme Tablo 2' de açıklandığı gibi en iyi duruma getirme. Onlara nazik için 1 h sallayarak ile kuluçkaya ve slaytları kapsar.
- Slayt 5 x 3 dk PBST 120 µL başına sallayarak ile iyi yıkayın.
- Streptavidin Cy5 100 µL % 5 BSA içinde 1:2000, seyreltilmiş her blok için ekleyin. Nazik ajitasyon ile 15 dakika sallayarak iken ışıktan korumaya folyo ile slaytlar kapağı.
- Sadece sallayarak ile 1 dk her birinin PBS 2 yıkama ardından sallayarak ile iyi başına slayt 5 x 1 dk her 120 µL içinde PBST yıkayın.
- 300 x g kuru onları de 5 min için slaytlar spin.
- Slaytları koyu bir kutu nakliye ve depolama için oda sıcaklığında tutmak.
- Hemen sondalama sonra sinyal tutarlılığı sağlamak için diziler inceden inceye gözden geçirmek için devam edin.
Not: Ancak, problu slaytlar karanlıkta saklanabilir ve problama üzerinden bir hafta içinde inceden inceye gözden geçirmek.
5. tarama diziler
- Lazer tarayıcıya geçiş ( Tablo malzemelerigörmek) lazer kadar ısıtmak için taramadan önce 30 dak. Tarayıcı yazılımı yüklemek ve tarayıcıya bağlayın.
- Oyun ışık sürekli yeşil olana yazılı tarafı yüzünü ile bir slayt tarayıcı içine yerleştirin.
- Ayarlar düğmesine basın ve aşağıdaki gibi slaytları tarama yaparken aşağıdaki ayarları yapın: tarama modu, medyan; Satın alma, sadece 635; Toplama modu, Kılavuzu; Kazanç, 20; Güç, düşük; Kayma tipi, etiketlenmemiş slayt; Odak, otomatik odaklama. Otomatik kaydırmayı devre dışı bırakmak ve Barkod okuma piksel boyutu 10 ve tarama 35 olarak ayarlayın.
- Sonuç görüntüleri 16-bit gri tonlama birden çok görüntü TIFF formatında kaydedin. Alma kılavuz düğmesine basın ve uygun dizi listesinden seçin.
Not: Dizi liste boyutu ve subarrays konumunu ve her özellik gösterge ile ilişkili basılı maddeler adlarını açıklar.- Slayt üzerindeki noktalar kılavuza hizalayın.
- Görüntüleri floresans sinyal yoğunluklarda her spot ölçmek ve sonuçları GenePix sonuçları (GPR) olarak adlandırılan bir metin biçiminde kaydetmek için Miktar işlem düğmeye basarak analiz.
Not: GPR dosya dizi üzerinde antijen hedeflerinden yerelleştirme ve kimlik değişkenleri içerir ve ayrıca her nokta değerlerini medyan floresan yoğunluğu ve antikor bağlama temsil eden yerel arka sinyal.
6. veri analizi
- Ters faz protein dizi (RPPA) Çözümleyicisi, R istatistiksel dil CRAN36üzerinde bir modül olarak adlandırılan bir ücretsiz Mikroarray analiz yazılımı kullanarak arka plan çıkarma sonra orta her antijen çoğaltır için hesaplama.
- Standart eğri çizmek ve her antijen-antikor düzeyleri hesaplamak için (bkz: Malzemeler tablo) istatistik yazılım ticari bilimsel grafik ve kullanma immünglobulin standart eğri göre sinyalleri tanımlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Açıklanan protokolünde önemli adımları açıklayan bir akış çizelgesi Şekil 1 gösterir. Şekil 2 Spearman korelasyon testleri anti-toksin A ve B hasta test sera seviyeleri önemli arasındaki anlaşma Mikroarray ve ELISA IgG ve IgA gösteren gösterir. Şekil 3 fark IgG ve IgA antikor-sınıf CF olmadan ishal olan hastalar, ishal olan CDI hastalar ve HC spesifik antikor yanıt toksin A, toksin B ve ikili toksin (pCDTb) gösterir. Şekil 4 antikor yanıt hasta sera içinde nötralize C. difficile antitoksin gösterir. Şekil 5 ( C. difficile toksinler ve SLPs karşı) bağışıklık reaktivite ve IVIG (karşı C. difficile toksinler) nötralize etkisi gösterir. Şekil 6 ( C. difficile toksinler ve SLPs karşı) bağışıklık reaktivite ve hasta sera öncesi ve sonrası-IVIG Yönetim (karşı C. difficile toksinler) nötralize etkisi gösterir. Tablo 1 kabul edilebilir içi ve arası assay katsayıları kullanarak test sera Mikroarray değişkenlik gösterir. Tablo 2 immünglobulin saf protein hem de en iyi duruma getirilmiş dilutions ilgili konsantrasyonları ile bu çalışmada sera ve ikincil antikorlar için kullanılan bir liste gösterir.
Resim 1 : Büyük adımları Mikroarray protokolünde yer genel bakış. Antijenleri ve denetimleri hazırlanması için ilk adımdır. Sonraki örnek dilutions 384 plakasına hazır quadruplicates aminosilane slaytlar üzerine baskı için transfer edilir. Kurutma ve slayt engelleme takiben, diziler hasta sera ile inkübe. Daha fazla yıkadıktan sonra belirtilen izotip biotinylated anti-insan immünglobulin (Ig) eklenir. Son yıkama ve kurutma adımları sonra slaytları taranır ve sonuç görüntüleri Mikroarray görüntü analiz yazılımı ile işlenebilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : Mikroarray ve ELISA sonuçları arasında korelasyon. Spearman korelasyon katsayısı iki platform arasında anlaşma düzeyini değerlendirmek için kullanıldı. Ne zaman bir kurum içi enzim bağlı immunosorbent assay (ELISA), Aile Mikroarray performans karşılaştırma. iyi bir korelasyon katsayısı toksin A gözlenmiştir (r = 0.7051; P < 0.0001), B. ve toksin B için orta derecede iyi bir korelasyon (r = 0.5809; P < 0.0001). Tam ELISA Protokolü oldu başka bir yerde37ayrıntılı. Bu rakam Negm vd. yayımlanmaktadır 1 iznine sahip. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: özel izotip antikor yanıt-e doğru Clostridium difficile toksinler. Serum Anti-toksin IgG ve IgA yanıtları (toxinotype 0, zorlanma VPI 10463, ribotype 087; 200 µg/mL, toksin B 100 µg/mL, toksin A), bu görüntü sows toksin B (C. difficile toksin B üreten zorlanma CCUG 20309; toksin B, 90 µg/mL) ve bir B habercisi şeklinde ikili toksin, pCDTb (200 µg/mL), kistik fibrozis (CF) ishal, ishal ile C. difficile enfeksiyon (CDI) olan hastalar olmadan olan hastalar ve sağlıklı kontrol (HC) parçası. IgG ve IgA için serum seyreltme are 1:500 ve 1: 100, anılan sıraya göre. Gruplar arasındaki farklar Dunn'ın öğleden hoc testi için birden çok yanıta ardından Kruskal-Wallis testi kullanılarak değerlendirildi. HC ile karşılaştırıldığında (n = 17) ve semptomatik CDI olan hastalar (n = 16), Yetişkin CF hastalarda (n = 16) sergilenen önemli ölçüde yüksek düzeyde serum IgA Anti-toksin A ve B düzeyleri; P ≤0.05. Anti-toksin A IgG düzeyleri gruplar arasında hiçbir fark olduğu dışında aynı model IgG için galip geldi. Kutusu ve bıyık araziler medyan, aralığı ve Dörttebirlikler temsil eder. P ≤0.0001; P ≤0.01; P ≤0.05. Standart sinyalleri immünglobulin standart eğri için normalleştirilmiş. Bu rakam Monaghan ve ark. yayımlanmaktadır 2 iznine sahip. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: Neutralizing antikor efficacies için C. difficile toksin A ve B hastaların sera. Bu şekilde koruyucu nötralize antikor C. difficile toksinler A ve B [% 50 Öldürücü doz (LD50) kullanılan toxinotype 0, zorlanma VPI 10463, ribotype 087,] (NAb) yanıt sera içinde gösterilmiştir (1: 100 seyreltme; toksin A 2.5 ng/mL, toksin B 0,5 ng/mL) üzerinden HC , CF hastalarda ishal olmadan ve CDI hastalarda ishal ile. CF hastalarda sera sera HC (toksinler A ve B) ve CDI (a toksini) olan hastalar ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde daha güçlü koruyucu Anti-toksin NAb yanıt sergiledi. Gruplar arasındaki farklar Dunn'ın öğleden hoc testi için birden çok yanıta ardından Kruskal-Wallis testi kullanılarak değerlendirildi. Kutusu ve bıyık araziler medyan, aralığı ve Dörttebirlikler temsil eder. P ≤0.01; P ≤0.05. Bu rakam Monaghan ve ark. yayımlanmaktadır 2 iznine sahip. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5 : Bağışıklık reaktivite ve C.difficile antijenleri için IVIG etkisi nötralize. A. bu resimde multi-izotip reaktivite C. difficile antijenleri için özel antikorlar ticari intravenöz immünglobulin (IVIG) hazırlıkları içinde gösterir. Isı haritası ( Tablo malzemelerigörmek) üç piyasada bulunan müstahzarları yedi C. difficile antijenleri [toksin (200 µg karşı spesifik antikor isotypes (IgG, Igg1, Igg2, Igg3, Igg4, IgA, Iga1, Iga2 ve IgM) düzeyleri gösterilmiştir /mL), toksin B (100 µg/mL), pCDTb (200 µg/mL), toksin B (CCUG 20309; 90 µg/mL) ve yüzey katman proteinleri (SLPs) 001, 002 ve 027 (tüm 200 µg/mL)] protein mikroarray teknolojisini kullanarak. Isı haritası renk kodu şöyledir: yeşil (düşük) kırmızı (yüksek) sinyal yoğunluğu için. Renk ölçeği için ısı haritası üzerinde temsil sinyal log2 (AFU) rasgele floresans birimlerinden dönüştürülmüş değerlerdir. Lütfen Not AFU son zamanlarda standart tanıtıcısı ile almıştır2sinyalleri. Toplam IgG, Igg1 ve Igg2 isotypes toksin A, toksin B, ikili toksin (pCDTb), karşı en yüksek bağlama ayrıntıları verdi ve toksin B (CCUG 20309). B. bu araziler IVIG nötralizasyon etkinliği yerli C. difficile karşı tüm göstermek toksinler A ve b Ticari IVIG ürünleri C. difficile toksinler A ve b karşı koruyucu nötralizasyon etkisini yüzdesi veriyorlar Her çizim 1: 100 seyreltme, ineklemek deneyler sayılarının temsil eder. IVIG hazırlık 1 sergileyen IVIG ürünleri 2 ve 3, özellikle karşı toksin A. göre en düşük koruyucu etkisi *** P ≤0.0001; P ≤0.05 (tek yönlü varyans analizi). Bu rakam Negm vd değiştirildi 3 iznine sahip. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 6 : Bağışıklık reaktivite ve C. difficile antijenleri için hastanın sera etkisini nötralize. A. bu şekilde önce ve sonra IVIG infüzyon C. difficile proteinler karşı antikor ayrıntıları karşılaştırılması hastaların sera içinde gösterilmektedir. Isı haritası önce ve sonra IVIG infüzyon yedi C. difficile antijenlere karşı yedi hastalarda serum örneklerinde isotypes (IgG, Igg1, Igg2, Igg3, Igg4, IgA, Iga1, Iga2 ve IgM) ifade düzeyini göstermektedir [toksin bir (200 µg/mL), toksin B (100 µg / mL), pCDTb (200 µg/mL), toksin B (CCUG 20309; 90 µg/mL) ve SLPs 001, 002 ve 027 (tüm 200 µg/mL)] protein mikroarray teknolojisini kullanarak. Isı haritası renk kodu şöyledir: yeşil (düşük) kırmızı (yüksek) sinyal yoğunluğu için. Renk ölçeği için ısı haritası üzerinde temsil sinyal log2 dönüştürülmüş-AFU değerlerdir. Unutmayın ki AFU standart sinyalleri2tarafından son zamanlarda almıştır. Bir sonrası infüzyon enhancement-in toplam IgG, Igg1, Igg2 ve Igg3 ayrıntıları toksin A, toksin B ve pCDTb yapıldı. B. bu resim toksin A, toksin B ve ikili toksin (pCDTb), öncesi ve sonrası-IVIG yönetim IgG yanıtlarını gösterir. Toplam IgG düzeyleri tüm toksinler karşı (Wilcoxon imzaladı-rank testi kullanma) IVIG yönetim aşağıdaki önemli bir artış gösteriyor. Her arsa onaylatılacak deneyler sayılarının 1:10 temsil seyreltme. C. bu araziler yerli C. difficile karşı nötralizasyon etkisini göstermek toksinler A ve B IVIG yönetim takip. Sonra IVIG infüzyon yerli karşı gelişmiş bir koruyucu etkisi öncesi ve sonrası infüzyon nötralize antikor faaliyetleri bir karşılaştırmasını gösterir C. difficile toksinler A ve b Her arsa onaylatılacak deneyler sayılarının 1:10 temsil seyreltme. A ve B toksinler karşı koruyucu etkisi önemli bir artış (Wilcoxon imzaladı-rank testi kullanma) hasta sera test sonrası-IVIG infüzyon belirtilmişti. Bu rakam Negm ve arkyeniden basıldı. 3 iznine sahip. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Tekrarlanabilirlik | Toksin A | Toksin B | SLP001 | SLP002 | SLP027 | Toksin B CCUG 20309 | pCDTb |
| Intra-tahlil | %7,70 | %6,40 | %7,40 | %5.10 | %7.60 | % 7 | %3,70 |
| Arası tahlil | %9,10 | %9,10 | %7,40 | %11,20 | 12,8 | %9,70 | %12,50 |
Tablo 1: Mikroarray Intra-tahlil ve arası tahlil hassas 1. Mikroarray içi ve arası assay variabilities hesaplanan 7 hastaların sera kullanarak. Aynı örnekleri her iki bağımsız zaman noktalarda iki slayt üzerinde denenecektir. Tüm antijenleri (n = 7 test ve n = 2 kontrol) çoğaltır beş her dizi olarak tespit edildi.
| Saf protein konsantrasyonu | Serum seyreltme | İkincil antikor seyreltme | |
| IgG | 50 μg/ml | 1/500 | 1/20000 |
| Igg1 | 200 μg/ml | 1/100 | 1/5000 |
| Igg2 | 200 μg/ml | 1/100 | 1/10000 |
| Igg3 | 200 μg/ml | 1/100 | 1/5000 |
| Igg4 | 200 μg/ml | 1/100 | 1/5000 |
| IgA | 50 μg/ml | 1/100 | 1/5000 |
| Iga1 | 200 μg/ml | 1/100 | 1/10000 |
| Iga2 | 200 μg/ml | 1/100 | 1/5000 |
| IgM | 50 μg/ml | 1/500 | 1/20000 |
Tablo 2: listesi bu çalışmada kullanılan immünglobulin. IGS ilgili saf protein konsantrasyonları (µg/mL) ve serum ve ikincil antikorlar için dilutions ile gösterilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol için o Mikroarray C. difficile protein antijenleri (rakamlar 3 ve 6) hasta sera ve IVIG (Şekil 5) ticari hazırlıkları için humoral bağışıklık yanıtı tanımlamak için uygun bir platform olduğunu göstermiştir. Biz de Mikroarray tekniği de geleneksel ELISA (Şekil 2) karşılaştırıldığında gerçekleştirir ve hassas ( kabul edilebilir sınırlar içinde düşen içi ve arası assay variabilities ile mükemmel tekrarlanabilirlik, gösterir göstermiştir Tablo 1).
Kritik adımlar:
Birkaç kritik adım herhangi bir başarılı antijen Mikroarray platformu oluştururken izlenmesi gerekir. Başlangıçta, QC deneyler çalıştırmak son derece önemlidir. QC deneylerde farklı parametreleri değerlendirilmelidir, örneğin uygun yüzey kimyası, yazdırma arabellekleri, engelleme arabellekleri, serum numuneleri ve ikincil antikorlar dilutions seçimi. Bu deneylerin bir iyi doğrulanmış ve güvenilir teknik38,39teslim etmek amacı ile yapılması gerekiyor.
Uygun protein immobilizasyon işlem yelpazesi Mikroarray analizler, bu çalışmada görüldüğü gibi yüksek kaliteli performans test aminosilane slaytların emin olmak için en önemli adımlardan biridir. Açık arka plan düzenli ve dairesel spot Morfoloji ve yüksek ve belirli bir sinyal şiddeti gözlemlemek çok önemlidir. Mikroarray performansını etkileyen başka bir slayt üzerinde düzgün ve düzenli noktalar üretmek için istenilen yüzey kimyası ulaşmak eşit derecede önemli Yazdırma arabelleği faktördür.
Bu en uygun boyutu ve şekli yazdırılacak bir hale sağlayacak gibi yazdırma için doğru ayarları seçmek önemlidir. Örneğin, nem seviyesi yaklaşık % 55 yazdırma sırasında nem buharlaşma Mikroarray odasında oranı artar ve daha az noktalar yazdırılır çünkü sağlanmalıdır.
Spesifik olmayan protein bağlayıcı arka plan ve spot sinyalleri etkileyen ek bir faktördür; Bu nedenle, bir engelleme arabellek uygun seçimi geliştirilmiş hassasiyet ve doğruluk dizi veri39giden herhangi bir non-spesifik bağlama azaltmak olabilir.
Değişiklikler ve sorun giderme:
Antijenleri ve serum numuneleri önlemek yardımcı olur kullanımı kadar dizi sinyal gücü bozulmaya birden çok donma-çözülme döngüsü tekrarlanan bölünmemeli ve daha küçük depolama tüpler dondurucu içinde saklı olmalı. Başarılı bir deneme şansını artırmak için tüm reaktifler taze hazırlanmalıdır ve filtre. Arrayer baskı ve gerekli ayarları kontrol önce temizlik. Ayrıca, slayt tutucu arka plan gürültü en aza indirmek için temiz tutulmalıdır.
Sınırlamalar:
Protein microarrays uygulama şu anda sıkı isteğe bağlı olarak protein mikroarray imalat yüzey kimyası tarafından engel oluyor. Burada protein moleküllerinin kimyasal ve fiziksel özellikleri büyük varyasyon protein ve antikor molekülleri40farklı sınıflar için özel tasarım benzersiz yüzey kimyası gerektirir. Böyle bir teknoloji yaygın uygulanmasına karşı karşıya diğer teknik sorunları pahalı özel ekipman ve yazılım ayrılan tezgah-alan, hem de dikkate alınarak bakım ücretleri, karmaşık veri analizi, akraba ile ihtiyacını dahil protein miktar ve eleştirel arıtılmış antijenleri erişim.
Yöntemi mevcut/alternatif yöntemleri açısından önemi:
Mikrodizi teknoloji ELISA, mezo ölçek bulma veya Luminex uzun, prensip olarak benzer ama özelleştirilebilir, istatistiksel güç elde etmek için ölçeklenebilir, değerli örnekleri tek microliter miktarda dayanır ve ekran sera yeteneği vardır birden fazla protein ayrıntıları için. Bu nedenle büyük çaplı, tarihsel serum bankalar ve biyomarker keşif ve tarama için özellikle uygundur.
Gelecekteki uygulamalar veya yöntem yönleri:
Gelecekteki çabalar-var yönetmen tahlil bir prognostik hasta stratifikasyon için büyük tabur bir çift-kör biçimde kullanarak harici doğrulama potansiyel biyolojik aracıyla tahlil için diğer örnekleri (hücre supernatants), en iyi duruma getirme doğru ve tahmin ve immünoterapi (mAb, aşı) yanıt en iyi duruma getirme. Gelecekte, Mikroarray teknoloji bir hastane ortamında yararlı bir tanı aracı olarak veya bir uyuşturucu tedavi planı bir süre izlemek için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Hiçbiri.
Acknowledgments
Bu araştırma bir Hermes bursu Ola Negm ve Tanya Monaghan ve ayrı Nottingham Sindirim Hastalıkları Merkezi ve NIHR Nottingham sindirim hastalıkları Biyomedikal Araştırma Merkezi fon aracılığıyla tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BioRobotics MicroGrid II arrayer | Digilab, Malborough, MA, USA | N/A | Contact arrayer used to automated spotting of the antigens onto the slides. |
| Scanner InnoScan 710. | Innopsys | N/A | A fluorescent microarray slide scanner with a red (Cy5) laser to read the reaction. |
| MAPIX software version 7.2.0 | Innopsys | N/A | Measure signal intensities of the spots. |
| Silicon contact pin | Parallel Synthesis Technologies | SMT-P75 | Print the samples onto the slides. |
| Thermo Scientific Nalgene Desiccator | Thermo Scientific | 41102426 | To store the new and printed slides. |
| 384-well plate | Genetix | X7022UN | To prepare the antigens. |
| Plate cover | Sigma Aldrich, UK | CLS6570-100EA | To reduce evaporation of the samples. |
| Aminosilane slides | Schott, Germany | 1064875 | The slide of choice for printing the antigens. |
| Slide holders | GraceBio Labs, USA | 204862 | Divide the slides into identical 16 subarrays. These holders are re-usable, removable, leak-proof wells . |
| Candida albicans lysate | NIBSC | PR-BA117-S | Positive control |
| Tetanus Toxoid | Athens Research and Technology | 04/150 | Positive control |
| Immunoglobulin G (IgG), Normal Human Plasma | Athens research and technology | 16-16-090707 | Purified Native Human Immunoglobulin G IgG, Human Plasma. |
| Immunoglobulin G1 (IgG1), Normal Human Plasma | Athens research and technology | 16-16-090707-1 | Purified Native Human Immunoglobulin G1 IgG1, Human Plasma. |
| Immunoglobulin G2 (IgG2), Normal Human Plasma | Athens research and technology | 16-16-090707-2 | Purified Native Human Immunoglobulin G2 IgG2, Human Plasma. |
| Immunoglobulin G3 (IgG3), Normal Human Plasma | Athens research and technology | 16-16-090707-3 | Purified Native Human Immunoglobulin G3 IgG3, Human Plasma. |
| Immunoglobulin G4 (IgG4), Normal Human Plasma | Athens research and technology | 16-16-090707-4 | Purified Native Human Immunoglobulin G4 IgG4, Human Plasma. |
| Immunoglobulin A (IgA), Human Plasma | Athens research and technology | 16-16-090701 | Purified Native Human Immunoglobulin A (IgA), Human Plasma. |
| Immunoglobulin A1 (IgA1), Human Myeloma Plasma | Athens research and technology | 16-16-090701-1M | Purified Native Human Immunoglobulin A1 (IgA1), Human Plasma. |
| Immunoglobulin A2 (IgA2), Human Myeloma Plasma | Athens research and technology | 16-16-090701-2M | Purified Native Human Immunoglobulin A2 (IgA2), Human Plasma. |
| Immunoglobulin M (IgM), Human Plasma | Athens research and technology | 16-16-090713 | Purified Native Human Immunoglobulin M (IgM), Human Plasma. |
| Biotinylated Goat Anti-Human IgG Antibody, gamma chain specific | Vector Labs | BA-3080 | Goat anti- human IgG (γ-chain specific)-biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins. |
| Mouse Anti-Human IgG1 Hinge-BIOT | Southern Biotec | 9052-08 | Goat anti- human IgG1 biotin antibody reacts specifically with human IgG1 but not with other immunoglobulins. |
| Mouse Anti-Human IgG2 Fc-BIOT | Southern Biotec | 9060-08 | Goat anti- human IgG2 -biotin antibody reacts specifically with human IgG 2but not with other immunoglobulins. |
| Mouse Anti-Human IgG3 Hinge-BIOT | Southern Biotec | 9210-08 | Goat anti- human IgG3-biotin antibody reacts specifically with human IgG3 but not with other immunoglobulins. |
| Mouse Anti-Human IgG4 pFc'-BIOT | Southern Biotec | 9190-08 | Goat anti- human IgG-biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins. |
| Anti-Human IgA, alpha chain specific, made in goat - Biotinylated | Vector Labs | BA-3030 | Goat anti- human IgG -biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins. |
| Mouse Anti-Human IgA1-BIOT | Southern Biotec | 9130-08 | Goat anti- human IgG -biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins. |
| Mouse Anti-Human IgA2-BIOT | Southern Biotec | 9140-08 | Goat anti- human IgG -biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins. |
| Mouse Anti-Human IgM-BIOT | Southern Biotec | 9020-08 | Goat anti- human IgG-biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins. |
| 0.2 mm syringe filter | Thermo scientific | 723-2520 | Filter the 5% BSA. |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich, UK | A7284 | Use 5% BSA for blocking the slides. |
| Antibody diluent | Dako, UK | S3022 | To dilute the serum and the secondary antibody. |
| Streptavidin Cy5 | eBioscience | SA1011 | Detection of the immune reaction. |
| Purified whole C. difficile toxins A and B (toxinotype 0, strain VPI 10463, ribotype 087) | Toxins Group, Public Health England | NA | |
| Purified whole C. difficile toxin B (CCUG 20309 toxin B only expressing strain) | Toxins Group, Public Health England | NA | |
| Precursor form of B fragment of binary toxin, pCDTb | University of Bath | NA | Produced in E. Coli from wholly synthetic recombinant gene construct. Amino acid sequence based on published sequence from 027 ribotype (http:www.uniprot.org/uniprot/A8DS70) |
| Purified native whole ribotype-specific (001, 002, 027) surface layer proteins | Dublin City University | NA | |
| Vigam (IVIg preparation 1) | Nottingham University Hospitals NHS Trust | N/A | |
| Privigen (IVIg preparation 2) | Nottingham University Hospitals NHS Trust | N/A | |
| Intratect (IVIg preparation 3) | Nottingham University Hospitals NHS Trust | N/A |
References
- Negm, O. H., et al. Profiling humoral immune responses to Clostridium difficile.-specific antigens by protein microarray analysis. Clinical and Vaccine Immunology. 22 (9), 1033-1039 (2015).
- Monaghan, T. M., et al. High prevalence of subclass-specific binding and neutralizing antibodies against Clostridium difficile. toxins in adult cystic fibrosis sera: possible mode of immunoprotection against symptomatic C. difficile infection. Clinical and Experimental Gastroenterology. 10, 169-175 (2017).
- Negm, O. H., et al. Protective antibodies against Clostridium difficile. are present in intravenous immunoglobulin and are retained in humans following its administration. Clinical & Experimental Immunology. 188 (3), 437-443 (2017).
- Monaghan, T., et al. OC-058 A protein microarray assay for predicting severe outcomes in Clostridium difficile infection. Gut. 66, Suppl. 2 31 (2017).
- Bacon, A. E. Immunoglobulin G directed against toxins A and B of Clostridium difficile in the general population and patients with antibiotic-associated diarrhea. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 18 (4), 205-209 (1994).
- Viscidi, R., et al. Serum antibody response to toxins A and B of Clostridium difficile. The Journal of Infectious Diseases. 148 (1), 93-100 (1983).
- Salcedo, J., et al. Intravenous immunoglobulin therapy for severe Clostridium difficile colitis. Gut. 41 (3), 366-370 (1997).
- Abougergi, M. S., Kwon, J. H. Intravenous immunoglobulin for the treatment of Clostridium difficile infection: a review. Digestive Diseases and Sciences. 56 (1), 19-26 (2011).
- Shah, N., Shaaban, H., Spira, R., Slim, J., Boghossian, J. Intravenous immunoglobulin in the treatment of severe Clostridium difficile colitis. Journal of Global Infectious Diseases. 6 (2), 82-85 (2014).
- Kyne, L., Warny, M., Qamar, A., Kelly, C. P. Asymptomatic carriage of Clostridium difficile and serum levels of IgG antibody against toxin A. The New England Journal of Medicine. 342 (6), 390-397 (2000).
- Solomon, K., et al. Mortality in patients with Clostridium difficile infection correlates with host pro-inflammatory and humoral immune responses. Journal of Medical Microbiology. 62, Pt 9 1453-1460 (2013).
- Kyne, L., Warny, M., Qamar, A., Kelly, C. P. Association between antibody response to toxin A and protection against recurrent Clostridium difficile diarrhoea. Lancet. 357 (9251), 189-193 (2001).
- Leav, B. A., et al. Serum anti-toxin B antibody correlates with protection from recurrent Clostridium difficile infection (CDI). Vaccine. 28 (4), 965-969 (2010).
- Drudy, D., et al. Human antibody response to surface layer proteins in Clostridium difficile infection. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 41 (3), 237-242 (2004).
- Bauer, M. P., Nibbering, P. H., Poxton, I. R., Kuijper, E. J., van Dissel, J. T. Humoral immune response as predictor of recurrence in Clostridium difficile infection. Clinical Microbiology and Infection. 20 (12), 1323-1328 (2014).
- Wilcox, M. H., et al. Bezlotoxumab for prevention of recurrent Clostridium difficile infection. The New England Journal of Medicine. 376 (4), 305-317 (2017).
- Leuzzi, R., Adamo, R., Scarselli, M. Vaccines against Clostridium difficile. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 10 (6), 1466-1477 (2014).
- Ghose, C., Kelly, C. P. The prospect for vaccines to prevent Clostridium difficile infection. Infectious Disease Clinics of North America. 29 (1), 145-162 (2015).
- Henderson, M., Bragg, A., Fahim, G., Shah, M., Hermes-DeSantis, E. R. A review of the safety and efficacy of vaccines as prophylaxis for Clostridium difficile infections. Vaccines. 5 (3), Basel. (2017).
- Zhu, H., et al. Global analysis of protein activities using proteome chips. Science. 293 (5537), 2101-2105 (2001).
- Delehanty, J. B., Ligler, F. S. Method for printing functional protein microarrays. BioTechniques. 34 (2), 380-385 (2003).
- Sutandy, F. X., Qian, J., Chen, C. S., Zhu, H. Overview of protein microarrays. Current Protocols in Protein Science. , Chapter 27 (Unit 27) 21 (2013).
- Huang, Y., Zhu, H. Protein array-based approaches for biomarker discovery in cancer. Genomics, Proteomics & Bioinformatics. 15 (2), 73-81 (2017).
- Vigil, A., Davies, D. H., Felgner, P. L. Defining the humoral immune response to infectious agents using high-density protein microarrays. Future Microbiology. 5 (2), 241-251 (2010).
- Bacarese-Hamilton, T., Mezzasoma, L., Ardizzoni, A., Bistoni, F., Crisanti, A. Serodiagnosis of infectious diseases with antigen microarrays. Journal of Applied Microbiology. 96 (1), 10-17 (2004).
- Davies, D. H., et al. Profiling the humoral immune response to infection by using proteome microarrays: high-throughput vaccine and diagnostic antigen discovery. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (3), 547-552 (2005).
- Wadia, P. P., Sahaf, B., Miklos, D. B. Recombinant antigen microarrays for serum/plasma antibody detection. Methods in Molecular Biology. 723, 81-104 (2011).
- Moore, C. D., Ajala, O. Z., Zhu, H. Applications in high-content functional protein microarrays. Current Opinion in Chemical Biology. 30, 21-27 (2016).
- Crompton, P. D., et al. A prospective analysis of the Ab response to Plasmodium falciparum before and after a malaria season by protein microarray. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (15), 6958-6963 (2010).
- Khodakov, D. A., et al. An oligonucleotide microarray for multiplex real-time PCR identification of HIV-1, HBV, and HCV. BioTechniques. 44 (2), 241-246 (2008).
- Ryabinin, V. A., et al. Universal oligonucleotide microarray for sub-typing of Influenza A virus. PLoS One. 6 (4), 17529 (2011).
- Zhu, H., et al. Severe acute respiratory syndrome diagnostics using a coronavirus protein microarray. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (11), 4011-4016 (2006).
- Cleton, N. B., et al. Spot the difference: development of a syndrome based protein microarray for specific serological detection of multiple flavivirus infections in travelers. PloS Neglected Tropical Diseases. 9 (3), 0003580 (2015).
- Liu, Y., Yu, F., Huang, H., Han, J. Development of recombinant antigen array for simultaneous detection of viral antibodies. PLoS One. 8 (9), 73842 (2013).
- Zhou, F., et al. Protein array identification of protein markers for serodiagnosis of Mycobacterium tuberculosis infection. Scientific Reports. 5, 15349 (2015).
- Mannsperger, H. A., Gade, S., Henjes, F., Beissbarth, T., Korf, U. RPPanalyzer: analysis of reverse-phase protein array data. Bioinformatics. 26 (17), 2202-2203 (2010).
- Monaghan, T. M., et al. Circulating antibody and memory B-cell responses to C. difficile-associated diarrhoea, inflammatory bowel disease and cystic fibrosis. PLoS One. 8 (9), 74452 (2013).
- Grainger, D. W., Greef, C. H., Gong, P., Lochhead, M. J. Current microarray surface chemistries. Methods in Molecular Biology. 381, 37-75 (2007).
- Wellhausen, R., Seitz, H. Facing current quantification challenges in protein microarrays. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, article ID 831347 (2012).
- Guo, A., Zhu, X. -Y. The critical role of surface chemistry in protein microarrays. Functional Protein Microarrays in Drug Discovery. , CRC Press. Boca Raton. (2007).
