Name: 항 원 특정 항 체 응답 다음 Clostridium 남과 어울리지 않 는 감염의 혈 청 학적인 결정에 대 한 단백질 Microarray 분석 결과 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: 배우세요 Clostridium difficile 감염에 대한 단백질 마이크로어레이 방법으로 다중 아이소타입 및 균주 특이적 항체 반응을 정량화하는 기술입니다. 이 방법은 환자 맞춤형 면역요법 최적화와 체액성 면역 반응 연구에 활용됩니다.

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이 연구는 헤르메스 친목 올라요 Negm 타 냐 모나 고 노팅엄 소화 질환 센터와 NIHR 노팅엄 소화 질병 생물 의학 연구 센터에서 별도 자금을 통해 지원 했다.

1. 준비 Microarray 플레이트
<ol><li>(이 환자 세라를 실행 하기 전에 미리 정의 된) 최적 농도에서 인쇄 버퍼 [PBS-트윈-트 레 할 로스 (50mm)] C. 남과 어울리지 않는 항 원 희석: 독 소는 (200 µ g/mL) 및 독 소 B (100 µ g/mL), pCDTb (200 µ g/mL), 및 순화 된 네이티브 전체 SLPs ribotypes 001, 002, 027 (200 µ g/mL)에서 파생 된. 참고: 독 소 B 독 소 B 표현 스트레인 CCUG 20309 (90 µ g/mL)에서 얻은 것입니다.<ol>
<li>긍정적인 컨트롤, C. albicans, 및 100 µ g/mL에서 인쇄 버퍼와 파상풍 사망 toxoid lysates 희석. 마지막으로, 일치 시험된 항 체 isotype 직렬, 10 희석 한 교정 커브를 생성 인쇄 버퍼에 걸쳐 50 µ g/mL에서 시작 순화 인간 면역 글로불린 희석.</li>
	</ol>
</li>
	<li>384 잘 격판덮개로 인쇄 버퍼에 희석의 10 µ L를 전송 합니다.</li>
	<li>커버 플레이트 플레이트 물개 및 5 분에 대 한 300 x g에서 원심 분리기와.</li>
</ol>2. 인쇄 연락처 로봇 배열
<ol><li>열 휴대용 가스 버너 3 x 2 각 s를 사용 하 여 실리콘 핀 하 고 깨끗 한 물 3 x 3 s에 린스.</li>
	<li>arrayer의 로드 카트리지에 microarray 접시를 놓습니다.</li>
	<li>Aminosilane 슬라이드 슬라이드 트레이에 놓습니다. 참고: 슬라이드 트레이 27 슬라이드를 저장할 수: 9 슬라이드의 세 행. 슬라이드 아래쪽 행의 왼쪽에서 시작 하는 세로 방향으로 배열 되 고 공간의 나머지 빈 슬라이드에 슬라이드 트레이에서 모든 구멍 커버는 되도록 덮여 있다.<ol>
<li>확인 누르고 진공 켜져 있고 모든 슬라이드는 보안 확인. 인쇄를 시작 하기 전에 적어도 1 시간에 대 한 습 한 환경에서 슬라이드를 둡니다. 참고: aminosilane 슬라이드는 방 습 제로 밀봉된 주머니에 제공 됩니다. 일단, 어떤 사용 되지 않는 슬라이드 만료 날짜까지 저장용 desiccator에 즉시 반환 되어야 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Clostridium 남과 어울리지 않는 항 원 인쇄에 적합 한 인쇄 프로그램을 설정 합니다. TAS 응용 프로그램 제품군을 실행 하 고 ' 내 Gridding 실행 ' 디렉터리에서 필요한 인쇄 실행된 매개 변수 파일을 엽니다. 모든 Clostridium 남과 어울리지 않는 항 원에 quadruplicate 인쇄 Clostridium 남과 어울리지 않 는 파일을 선택 합니다.</li>
	<li>주 창에 MicroArray 아이콘을 두 번 클릭 시 3 탭 창 라는 'MicroArraying 파라미터' 표시 됩니다.  세 개의 탭은 "원본," "대상"과 "옵션." "소스" 탭 내용을 microarray 접시에서 사용 되는 샘플의 수를 나타냅니다. "대상" 탭 어떻게 슬라이드는 로드, 배열 슬라이드 인쇄 하 고 슬라이드 레이아웃 (16 하위 형식) 편집의 세부 정보를 표시 합니다. "옵션" 탭에는 세척 프로토콜 및 도구 사용된 예를 보여 줍니다. 모든 완성 된 샘플 후 씻어. 다른 샘플 사이 어떤 상호 오염 든 지 피하기 위하여 샘플 사이의 실리콘 핀을 청소 하십시오.</li>
	<li>프로그래밍 옵션은 옵션 아래에 있는 > TAS 스위트 도구 모음에서 환경 설정을 실행. 통해이 섹션에서 작업을 9 탭이 있습니다 그리고 당신이 완전 한 하나의 탭에 클릭 하 여 다음 이동. "확인" 버튼을 클릭 하면 "실행 환경 설정." 밖으로 이동 됩니다. "실행 환경 설정"의 "일반" 탭에서 어떻게 악기는 프로그램이 시작 될 때 동작에 관련 된이 섹션에서 사용할 수 있는 확인란 수가 있다. "실행의 시작 전에 프라임 목욕" 확인란을 모든 3 개의 세척 스테이션 실행된 시작 전에 짧은 못쓰게 시퀀스를 받게 될 것 이다. 첫 번째 소스 방문 전에 확인 "실행의 시작에 세척" 상자, 핀 도구 세척 될 것 이다. "세척 실행의 끝에" 체크 박스를 선택 후 마지막 소스 방문 핀 도구 세척 될 것 이다. 사용자는 세척 주기의 수를 설정할 수 있습니다. "실행 환경 설정"의 "기후" 탭에는 습기를 시작 합니다. 우리가 사용 하는 설정에는 다음과 같습니다: 율 55%, 최소 습도 55%, 대상 습도 60% 실행 시작 속도 55%. 대상 습도 도달 했습니다, 그렇지 않으면 관광 명소 잘못 된 크기 및 도서관 것 이다 급속 하 게 증발 때까지 실행을 시작 하지 마십시오.</li>
	<li>TAS의 메뉴 모음에서 녹색 이동 버튼을 클릭 합니다.  실행을 시작 하 고 주기적으로 특정 다 수 인쇄 실행 하는 동안 arrayer는 확인 합니다. 참고: 수 있습니다 각 슬라이드에 병렬로 15 샘플의 분석을 한 하위 부정적인 컨트롤으로 사용 됩니다. 배열의 디자인 인쇄 된 단백질 (항 원)의 수에 의해 결정 되 고 인쇄 된 생물의 수 복제 합니다. 참고: 각 샘플 인쇄 후 머리 진행 세척 목욕 증류수 및 0.002% 포함 하는 2 개의 세척 목욕으로 핀을 여러 찍기 수 있도록 1.5 트윈 20 각 목욕에 s 뒤에 핀 초 순수한 물으로 헹 구 고 건조에 핀 4 주요 워시 역 s.</li>
</ol>3입니다. 스토리지 배열
<ol><li>인쇄 된 슬라이드는 desiccator에서 실내 온도에 밤새 껏 저장 하십시오. 참고: 인쇄 된 슬라이드는 최대 1 주일까지 저장할 수 있습니다.</li>
</ol>4. 배열 검색
<ol><li>조심 스럽게 16 다 잘 실 형식의 슬라이드 홀더 인쇄 슬라이드 장소. 참고: 챔버, 약 7.5 m m의 깊이 갖는 혼합 및 세척 단계 볼륨 비율에 관대 한 표면 제공.</li>
	<li>모든 시 약을 사용 하기 전에 실내 온도를 따뜻하게 수 있습니다. 달리 지정 하지 않는 한 실 온에서 모든 다음 단계를 수행 합니다.</li>
	<li>필터링 된 5% 소 혈 청 알 부 민 트윈 (BSAT; 사용 필터 주사기 0.2 µ m) 각 블록, 슬라이드, 커버와 함께 1 시간 동안 흔들어 그들을 품 어를 100 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>슬라이드 5 x 1 분 인산 염 버퍼의 120 µ L에 트윈 20 식 염 수 세척 (PBST; 0.1% 트윈) 동요와 당. 슬라이드를 밖으로 건조 하지 마십시오.</li>
	<li>20 분 동안 얼음에 혈 청 샘플을 해 동 하 고 배경 구성 요소 감소와 희석제를 상업적으로 사용할 수 있는 항 체와 각 샘플을 희석 ( 재료의 표참조).<ol>
<li>표 2와 같이 테스트 면역 글로불린에 따라 혈 청 샘플의 희석을 최적화 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>하나, 부정적인 컨트롤;로 사용 될 것입니다를 제외 하 고 모든 블록을 희석된 혈 청 샘플의 100 µ L를 전송 이 블록에만 항 체 희석제의 100 µ L를 추가 합니다. 1 시간에 대 한 부드러운 동요와 함께 슬라이드를 품 어.</li>
	<li>PBST의 120 µ L에서 슬라이드 5 x 3 분을 세척 (0.1% 트윈) 동요와 당.</li>
	<li>biotinylated 염소 반대로 인간 항 체 항 체 희석제로 희석의 100 µ L를 추가 합니다.<ol>
<li>표 2에 설명 된 대로 테스트 면역 글로불린에 따라 이차 항 체의 희석을 최적화 합니다. 슬라이드 커버 하 고 1 시간 동안 부드러운 흔들어으로 그들을 품 어.</li>
	</ol>
</li>
	<li>잘 흔들어 당 PBST의 120 µ L에서 슬라이드 5 x 3 분을 씻어.</li>
	<li>각 블록 5 %BSA 1: 2000에서 희석 streptavidin Cy5의 100 µ L를 추가 합니다. 부드러운 동요와 15 분 동안 흔들어 동안 빛에서 그들을 보호 하기 위해 호 일 슬라이드 커버.</li>
	<li>슬라이드 5 x 1 분 각 120 µ L에서 PBST의를 씻고 잘 떨고, 당 각 PBS에 1 분의 2 세척만 떨고 다음.</li>
	<li>그들을 건조 300g x 5 분에 대 한 슬라이드를 회전 합니다.</li>
	<li>실내 온도에 전송 및 저장에 대 한 어두운 상자에 슬라이드를 유지.</li>
	<li>프로 빙 후 신호 일관성을 보장 하기 위해 즉시 배열 검사를 진행 합니다. 참고: 그러나, 탐지 슬라이드 수 어둠 속에 저장 되며 프로 빙에서 1 주일 이내 스캔.</li>
</ol>5. 배열 검색
<ol><li>레이저 스캐너에 전환 ( 재료의 표참조) 워밍업 레이저 스캔 하기 전에 30 분. 스캐너 소프트웨어를 업로드 하 고 스캐너를 컴퓨터에 연결 합니다.</li>
	<li>플레이 빛 녹색 변할 때까지 슬라이드 인쇄 된 쪽 얼굴을 스캐너에 놓습니다.</li>
	<li>설정 단추를 누르고 다음 설정을 조정 할 때 다음과 같은 슬라이드를 스캔: 스캔 모드, 중간; 수집, 635만; 수집 모드, 수동; 이득, 20; 전력, 낮은; 슬라이드 유형, 레이블 없는 슬라이드; 초점, 자동 초점입니다. 자동 스크롤을 끄고 픽셀 크기 10와 35 스캔 바코드 읽기 설정.</li>
	<li>여러 이미지를 TIFF 형식 16 비트 회색조로 결과 이미지를 저장 합니다. 가져오기 격자 단추를 누르고 적절 한 배열 목록 선택. 참고: 배열 목록 크기와 배열의의 위치와 각 기능 표시기와 관련 된 인쇄 된 물질의 이름을 설명 합니다.<ol>
<li>슬라이드에 반점에 그리드를 정렬 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>각 명소의 형광 신호 강도 측정 하 고 GenePix 결과 (GPR)를 호출 하는 텍스트 형식으로 결과 저장을 정량화 과정 버튼을 눌러 이미지를 분석 합니다. 참고: GPR 파일 배열에 항 원 대상의 현지화 및 식별 변수를 포함 하 고 또한 항 체 바인딩을 나타내는 로컬 배경과 중간 형광 강도 신호 각 자리 값.</li>
</ol>6. 데이터 분석
<ol><li>배경 빼기 라는 역 상 단백질 배열 (RPPA) 분석기, 크 랑36R 통계 언어 모듈 무료 microarray 분석 소프트웨어를 사용 하 여 후 각 항의 복제에 대 한 중앙값을 계산 합니다.</li>
	<li>표준 곡선을 플롯 하 고 각 항 원 항 체 수준을 계산 하 상업 과학 그래프 및 통계 소프트웨어 ( 재료의 표참조)를 사용 하 여 면역 글로불린 표준 곡선을 기준으로 신호 보간.</li>
</ol>

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없음입니다.

이 프로토콜에서 우리는 microarray C. 남과 어울리지 않 는 단백질 항 원 환자 세라 (그림 3 과 6)와 IVIg (그림 5)의 상업적인 준비에 체액 성 면역 응답을 정의 하기 위한 적합 한 플랫폼입니다 것으로 나타났습니다. 우리는 또한 microarray 기술은 기존의 ELISA (그림 2)에 비교 될 때 잘 수행 하 고 내부 및 남북 assay variabilities 정밀 ( 의 허용 한계 내로 우수한 재현성을 보여줍니다 증명 하고있다 표 1).
중요 한 단계: 어떤 성공적인 항 원 microarray 플랫폼을 구축할 때 중요 한 단계 수를 다음 합니다. 처음에, 그것은 매우 품질 실험을 실행 하는 것이 중요입니다. ...

이 프로토콜 개발 및 검출을 위한 소설과 맞춤형 단백질 microarray 분석 결과의 검증 및 세균성 긴장 및 C. 남과 어울리지 않는 항 원에 항 체 isotype-특정 응답의 반 정량화에 설명합니다. 우리는 성공적으로 우리의 C. 남과 어울리지 않는 사용-특정 항 체 환자 세라1,2, IVIg3, 준비에에서 콘텐츠 구성 bioanalysis 유망한 새로운 툴으로 서 분석 결과 특정 microarray 및 CDI4가난한 결과 연관 항 체 특이성의 식별. 시연 어떻게 biobanked 혈 청 샘플 및 IVIg의 상업적인 준비 microarray 슬라이드에 분석 될 수 있다 C. 남과 어울리지 않는 병원 체 특정 항 체 반응을이 분석 결과의 높은-품질 프로 파일링를 재현할 수 있도록 합니다.
많은 건강 한 아이 들 및 성인 있고 C. 남과 어울리지 않는 독 소 A에 감지 혈 청 IgG와 IgA 항 체 B5,6. 이러한 초기와 성인에서 C. 남과 어울리지 않 는 노출 다음 중 과도 노출 다음 발생 생각 된다. 이러한 이유로, polyclonal IVIg 되었습니다 재발 및 fulminant CDI7,,89치료에 오프 라벨을 사용. 그러나, 그것의 확실 한 역할 그리고 행동의 모드 불분명 남아 있습니다. 몇 가지 연구는 C. 남과 어울리지 않는 독 소를 체액 면역 반응에서 역할을 질병 프레 젠 테이 션 및 결과 나타났습니다. 특히, 무 증상 환자 증상 질병10을 개발 하는 환자에 비해는 증가 혈 청 항 독 소 A IgG 농도 표시. 명백한 협회 중간 항 독 소 A IgG titers 및 30 일 모든 원인 사망11보고 되었습니다. 여러 보고서 또한 독 소 A, B, 그리고 여러 비 독 소 항 (Cwp66, Cwp84, 플, FliD, 및 표면 층 단백질 (SLPs)) 재발과 항 체 응답에 대 한 보호와 연결을 계시 했다12,13 , 14 , 15. 이러한 관측을가 했다가 개발의 첫 번째 수동 immunotherapy 마약 대상 C. 남과 어울리지 않는 독 소 B (bezlotuxumab)는 최근 미국 식품 의약품 안전 청 및 유럽 의약품에 의해 승인 되었습니다 재발 CDI16의 예방을 위한 기관. 사 독 소 또는 재조합 독 소 조각을 사용 하 여 예방 접종 전략은 또한 현재 개발17,,1819에서. 이러한 새로운 치료 접근 의심할 여 지 없이 큰 샘플 크기에 여러 항 원에 체액 성 면역 반응 평가 대 한 요구를 자극할 것 이다.
오늘날, 세균성 긴장 및 C. 남과 어울리지 않는 항 원에 항 체 isotype-특정 응답을 동시에 평가 가능 상업적으로 사용 가능한 높은 처리량 분석 실험의 주목할 만한 부족이 있다. 미래 연구 및 임상 응용을 촉진 하기 위하여 이러한 분석을 개발 하는 충족 되지 필요가 있다. 단백질 microarrays는 현미경 슬라이드 기반 표면에 반점의 공간적 조직 배열로20 접촉 또는 비 접촉 될 수 있는 로봇 시스템을 사용 하 여 개별적으로 순화 된 단백질의 많은 수를 무력화 하는 방법 인쇄 도구21. 관광 명소는 세포 lysates, 항 체, 조직 homogenates, 내 인 성 또는 재조합 형 단백질 또는 펩 티 드, 체액 또는 약물22,23등 복잡 한 혼합물을 나타낼 수 있습니다.
단백질 microarray 기술 표준 사내 ELISA 뚜렷한 장점이 안티-C. 남과 어울리지 않는 항 체 응답을 평가 하기 위해 전통적으로 사용 된 기술을 제공 합니다. 이들은 다양 한 단백질 목표, 항 원, 예제 및 시 약에 대 한 요구 사항 감소 볼륨의 더 광범위 한 패널에 대 한 멀티-isotype-특정 항 체를 탐지 하기 위한 용량 증가 및 더 큰 통합 향상된 된 능력 기술 복제 뿐만 아니라 여러 내부 품질 관리 (QC)의 수1를 측정합니다. Microarrays는 따라서 더 정확한, 과민 하 고 재현할 수 있고 큰 동적 범위. 이러한 요인 microarrays는 저렴 하 고 잠재적으로 유리한 대안 ELISAs 알려진된 단백질의 대규모 검색에 대 한 확인합니다. 그러나, microarray 기술의 단점 매우 순화 된 항 원의 패널 구축 및 기술 플랫폼을 설정 관련 된 큰 초기 비용에서 주로 유래한 다.
단백질 microarrays 임상 응용 프로그램에 진단 및 기본 연구 공구로 지난 2 년간 광범위 하 게 사용 되었습니다. 단백질 발현 프로 파일링, 효소-기질 관계, 바이오 마커 검사, 호스트-미생물 상호작용의 분석의 연구 및 항 체 특이성23,24, 프로 파일링을 포함 하는 특정 응용 프로그램 25,26,,2728. 말라리아 (변형 체)29, 에이즈-130,31독감, 중증 급성 호흡기 증후군 (SARS)32, 바이러스 성 출혈 성 열33 포함 하 여 많은 새로운 병원 체 단백질/항 microarrays 설립 되었습니다. , herpesviruses34및 결핵35.
현재 프로토콜 쉬운 운영 C. 남과 어울리지 않 는 반응 항 원 microarray 분석 결과, 멀티 isotype 및 c.에 대 한 스트레인 특정 항 체 응답의 정밀, 정확 하 고 특정 정량화를 가능 하 게의 설립에 관한 남과 어울리지 않는 세라와 IVIg polyclonal 항 원. 여기, 우리는 프로필 ELISA 분석 결과 정밀도 및 재현성에 비해 허용 microarray 분석 결과 성능에 관한 대표적인 결과 포함 합니다. 이 분석 결과 다른 임상 샘플 프로 파일링에 더 개발 될 수 있습니다 고 CDI의 분자 기준으로 연구에 대 한 새로운 표준을 설정 합니다.

<table><tbody><tr><td>BioRobotics MicroGrid II 어레이어</td><td>Digilab, Malborough, MA, USA</td><td>N/A</td><td>슬라이드에 항원을 자동으로 발견하는 데 사용되는 Contact 어레이어.</td></tr><tr><td>스캐너 InnoScan 710.</td><td>Innopsys</td><td>N/A</td><td>반응을 판독하기 위한 적색(Cy5) 레이저가 있는 형광 마이크로어레이 슬라이드 스캐너.</td></tr><tr><td>MAPIX 소프트웨어 버전 7.2.0</td><td>Innopsys</td><td>N/A</td><td>스폿의 신호 강도를 측정합니다.</td></tr><tr><td>실리콘 접촉 핀</td><td>Parallel Synthesis Technologies</td><td>SMT-P75</td><td>샘플을 슬라이드에 인쇄합니다.</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Nalgene Desiccator</td><td>Thermo Scientific</td><td>41102426</td><td>새 슬라이드와 인쇄된 슬라이드를 보관합니다.</td></tr><tr><td>384웰 플레이트</td><td>Genetix</td><td>X7022UN</td><td>항원을 제조합니다.</td></tr><tr><td>플레이트 커버</td><td>Sigma Aldrich, 영국</td><td>CLS6570-100EA</td><td>샘플의 증발을 줄이기 위해.</td></tr><tr><td>아미노실란 슬라이드</td><td>쇼트,&nbsp; 독일</td><td>1064875</td><td>항원 인쇄를 위해 선택한 슬라이드.</td></tr><tr><td>슬라이드 홀더</td><td>GraceBio Labs, 미국</td><td>204862</td><td>슬라이드를 동일한 16개의 서브 어레이로 나눕니다. 이 홀더는 재사용이 가능하고 탈착식이며 누출 방지 우물입니다.</td></tr><tr><td>칸디다 알비칸스 용해물</td><td>NIBSC</td><td>PR-BA117-S</td><td>양성 대조군</td></tr><tr><td>파상풍 톡소이드&nbsp;</td><td>Athens Research and Technology</td><td>04/150</td><td>양성 대조군</td></tr><tr><td>면역글로불린 G(IgG), 정상 인간 혈장</td><td>&nbsp; 아테네 연구 및&nbsp; 기술&nbsp; &nbsp;</td><td>16-16-090707</td><td>정제된 네이티브 인간 면역글로불린 G IgG, 인간 혈장.&nbsp;</td></tr><tr><td>면역글로불린 G1 (IgG1), 정상 인간 혈장</td><td>&nbsp; 아테네 연구 및&nbsp; 기술&nbsp; &nbsp;</td><td>16-16-090707-1</td><td>정제된 네이티브 인간 면역글로불린 G1 IgG1, 인간 플라즈마.&nbsp;</td></tr><tr><td>면역글로불린 G2 (IgG2), 정상 인간 혈장</td><td>&nbsp; 아테네 연구 및&nbsp; 기술&nbsp; &nbsp;</td><td>16-16-090707-2</td><td>정제된 네이티브 인간 면역글로불린 G2 IgG2, 인간 플라즈마.&nbsp;</td></tr><tr><td>면역글로불린 G3 (IgG3), 정상 인간 혈장</td><td>&nbsp; 아테네 연구 및&nbsp; 기술&nbsp; &nbsp;</td><td>16-16-090707-3</td><td>정제된 네이티브 인간 면역글로불린 G3 IgG3, 인간 플라즈마.&nbsp;</td></tr><tr><td>면역글로불린 G4 (IgG4), 정상 인간 혈장</td><td>&nbsp; 아테네 연구 및&nbsp; 기술&nbsp; &nbsp;</td><td>16-16-090707-4</td><td>정제된 네이티브 인간 면역글로불린 G4 IgG4, 인간 플라즈마.&nbsp;</td></tr><tr><td>면역글로불린 A(IgA), 인간 혈장</td><td>&nbsp; 아테네 연구 및&nbsp; 기술&nbsp; &nbsp;</td><td>16-16-090701</td><td>정제 토종 인간 면역글로불린 A(IgA), 인간 혈장.</td></tr><tr><td>면역글로불린 A1 (IgA1), 인간 골수종 혈장</td><td>&nbsp; 아테네 연구 및&nbsp; 기술&nbsp; &nbsp;</td><td>16-16-090701-1M</td><td>정제 토종 인간 면역글로불린 A1(IgA1), 인간 플라즈마.</td></tr><tr><td>면역글로불린 A2 (IgA2), 인간 골수종 혈장</td><td>&nbsp; 아테네 연구 및&nbsp; 기술&nbsp; &nbsp;</td><td>16-16-090701-2M</td><td>정제 토종 인간 면역글로불린 A2(IgA2), 인간 혈장.</td></tr><tr><td>면역글로불린 M(IgM), 인간 혈장</td><td>&nbsp; 아테네 연구 및&nbsp; 기술&nbsp; &nbsp;</td><td>16-16-090713</td><td>정제 토종 인간 면역글로불린 M(IgM), 인간 혈장.</td></tr><tr><td>Biotinylated Goat Anti-Human IgG 항체, 감마사슬 특이적</td><td>Vector Labs</td><td>BA-3080</td><td>염소 항-인간 IgG(&gamma;-chain specific)-비오틴 항체는 인간 IgG와 특이적으로 반응하지만 다른 면역글로불린과는 특이적으로 반응하지 않습니다.</td></tr><tr><td>마우스 안티 휴먼 IgG1 힌지 - BIOT</td><td>Southern Biotec</td><td>9052-08&nbsp;</td><td>염소 항인간 IgG1 비오틴 항체는 인간 IgG1과 특이적으로 반응하지만 다른 면역글로불린과는 반응하지 않습니다.</td></tr><tr><td>마우스 안티-휴먼 IgG2 Fc-BIOT</td><td>Southern Biotec</td><td>9060-08&nbsp; &nbsp;</td><td>염소 항인간 IgG2-비오틴 항체는 인간 IgG 2와 특이적으로 반응하지만 다른 면역글로불린과는 반응하지 않습니다.</td></tr><tr><td>마우스 안티-휴먼 IgG3 힌지-BIOT</td><td>Southern Biotec</td><td>9210-08&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>염소 항인간 IgG3-비오틴 항체는 인간 IgG3와 특이적으로 반응하지만 다른 면역글로불린과는 반응하지 않습니다.</td></tr><tr><td>마우스 안티-휴먼 IgG4 pFc'-BIOT</td><td>Southern Biotec</td><td>9190-08&nbsp; &nbsp;</td><td>염소 항인간 IgG-비오틴 항체는 인간 IgG와 특이적으로 반응하지만 다른 면역글로불린과는 반응하지 않습니다.</td></tr><tr><td>염소에서 만든 안티 휴먼 IgA, 알파 체인 특이적 - Biotinylated</td><td>Vector Labs</td><td>BA-3030</td><td>염소 항 인간 IgG - 비오틴 항체는 인간 IgG와 특이적으로 반응하지만 다른 면역 글로불린과는 반응하지 않습니다.</td></tr><tr><td>마우스 항-인간 IgA1-BIOT</td><td>Southern Biotec</td><td>9130-08</td><td>염소 항-인간 IgG-비오틴 항체는 인간 IgG와 특이적으로 반응하지만 다른 면역글로불린과는 반응하지 않습니다.</td></tr><tr><td>마우스 안티-휴먼 IgA2-BIOT</td><td>Southern Biotec</td><td>9140-08&nbsp; &nbsp;</td><td>염소 항인간 IgG 비오틴 항체는 인간 IgG와 특이적으로 반응하지만 다른 면역글로불린과는 반응하지 않습니다.</td></tr><tr><td>마우스 안티-휴먼 IgM-BIOT</td><td>Southern Biotec</td><td>9020-08&nbsp;</td><td>염소 항인간 IgG-비오틴 항체는 인간 IgG와 특이적으로 반응하지만 다른 면역글로불린과는 반응하지 않습니다.</td></tr><tr><td>0.2 mm 주사기 필터</td><td>Thermo scientific</td><td>723-2520</td><td>필터 5 % BSA.</td></tr><tr><td>소 혈청 알부민 (BSA)</td><td>Sigma Aldrich, UK</td><td>A7284</td><td>슬라이드 차단에 5% BSA를 사용하십시오.</td></tr><tr><td>항체 희석제</td><td>Dako, UK</td><td>S3022</td><td>혈청과 2차 항체를 희석합니다.</td></tr><tr><td>Streptavidin Cy5</td><td>eBioscience</td><td>SA1011</td><td>면역 반응 검출</td></tr><tr><td>정제 된 전체 C. 디피실 독소 A 및 B (독소 유형 0, 균주 VPI 10463, 리보 타입 087)</td> <td>독소 그룹, 공중 보건 영국</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>정제 된 전체 C. 디피실 독소 B (CCUG 20309 독소 B 만 발현 균주)</td> <td>독소 그룹, 공중 보건 영국</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>이진 독소 B 단편의 전구체 형태, pCDTb</td><td>목욕 대학&nbsp;</td><td>NA</td>: <td>완전 합성 재조합 유전자 구조체에서 E. Coli에서 생산됩니다. 027 리보타입(http:www.uniprot.org/uniprot/A8DS70)에서 공개된 서열을 기반으로 한 아미노산 서열정제</td></tr>된 <tr><td>천연 전체 리보타입 특이적(001, 002, 027) 표층 단백질</td><td>Dublin City University&nbsp;</td><td></td><td></td>NA</tr><tr><td>Vigam (IVIg 준비 1)</td><td>Nottingham University Hospitals NHS Trust</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Privigen (IVIg 준비 2)</td><td>Nottingham University Hospitals NHS Trust</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Intratect (IVIg 준비 3)</td><td>Nottingham University Hospitals NHS Trust</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

항 원 특정 항 체 응답 다음 clostridium 남과 어울리지 않 는 감염의 혈 청 학적인 결정에 대 한 단백질 microarray 분석 결과

A Protein Microarray Assay for Serological Determination of Antigen-specific Antibody Responses Following Clostridium difficile Infection

우리Clostridium 남과 어울리지 않는 항 체 수준의 polyclonal 정 맥 면역 글로불린 (IVIg)의 별도 준비와 인간의 세라에서의 안티-결정에 대 한 소설 높은 처리량 단백질 microarray 분석 결과 대 한 자세한 개요를 제공합니다. 프로토콜 샘플 준비, 배열, 시험 절차, 및 데이터 분석의 인쇄에 관련 된 방법론 단계를 설명합니다. 또한,이 프로토콜 플라즈마를 포함 한 다양 한 임상 샘플을 통합 하 고 문화 supernatants 셀을 더 개발 될 수 있습니다. 우리는 단백질 microarray를 사용 하 여 isotype (IgG, IgA, IgM), 서브 클래스 (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2)의 조합을 결정 하는 방법을 보여 및 스트레인-특정 항 체를 매우 전체 C. 남과 어울리지 않 는 정화 독 소 A와 B (toxinotype 0, 스트레인 VPI 10463, ribotype 087), C. 남과 어울리지 않는 독 소 B만 표현 스트레인 (CCUG 20309)에서 독 소 B, 이진 독 소, pCDTb, ribotype 특정 전체 표면 층 단백질 B 조각의 선구자 형태 (SLPs; 001, 002, 027), 단백질 (파상풍을 제어 사망 toxoid 그리고 Candida albicans)입니다. 실험 기간 동안 microarrays 세라 C. 감염과 (CDI), 낭 성 섬유 증 (CF) 설사, 건강 한 컨트롤 (HC), 없이 개인으로 개인 및 개인 사전 및 포스트 IVIg 치료와 함께 조사 됩니다는 CDI, 결합 된 면역 결핍 장애 및 만성 염증 demyelinating polyradiculopathy의 치료. 우리 환자 단체, IVIg, 그리고 전에 세라의 상업적인 준비와 다음 IVIg 관리 사이 독 소 중립화 신진대사 및 멀티 isotype 특정 항 체 수준에 큰 차이가 발생합니다. 또한, 있다 microarray 및 효소 연결 된 immunosorbent 분석 결과 (ELISA) 사이의 중요 한 상관 관계 항 독 소 IgG 수준에 대 한 혈 청 샘플에서. 이러한 결과 microarray 예방 접종 또는 감염 된 인간 C.difficile 항 원에 항 체 응답을 프로 파일링 하기 위해 유망한 도구가 될 수 것이 좋습니다. 항 원 패널과 생산 비용에 있는 감소의 더 수정, 우리는 microarray 기술을 최적화 하 고 환자 별로 C. 감염과 대 한 가장 임상적으로 유용한 immunotherapies를 선택 도움이 될 수 있습니다 예상.

그림 1 설명된 프로토콜의 주요 단계를 설명 하는 순서도를 보여 줍니다. 그림 2 는 상당한 사이 계약 microarray ELISA IgG와 IgA 항 독 소 A와 B 환자 테스트 세라 수준을 보여주는 Spearman 상관 관계 테스트. 그림 3 설사 없이 CF 환자, 설사, CDI 환자와 HC에서 독 소 A, B, 독 소 및 이진 독 (pCDTb)에 대 한 특정 항 체 응답 차동 IgG와 IgA 항 체-클래스를 보여준다. 그림 4 는 C. 남과 어울리지 않는 항 독 소 중화 항 체 응답 환자 세라. 그림 5 ( C. 남과 어울리지 않는 독 소 및 Slp)에 대하여 면역 반...

이 문서 Clostridium 남과 어울리지 않는 항 원에 인간 세라 정화 7-플렉스 패널의 체액 면역 반응 높은 프로 파일링에 대 한 간단한 단백질 microarray 메서드를 설명 합니다. Polyclonal 정 맥 면역 글로불린의 준비에 특정 항 체 반응의 결정에 대 한 프로토콜을 확장할 수 있습니다.

항 원 특정 항 체 응답 다음 Clostridium 남과 어울리지 않 는 감염의 혈 청 학적인 결정에 대 한 단백질 Microarray 분석 결과

We provide a detailed overview of a novel high-throughput protein microarray assay for the determination of anti-Clostridium difficile antibody levels in ...

이 방법은 환자 특이적 방식으로 클로스트리듐 디피실 감염에 대한 임상적으로 유용한 면역 요법을 최적화 및 선택하고 클로스트리듐 디피실에 대한 인간 면역 반응을 규명하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 C.difficile 항원에 대한 다중 동형과 균주 특이적 항체 반응을 정확하고 동시에 정량화할 수 있다는 것입니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 고도로 정제된 항원 패널을 설정 및 최적화하고 기술 플랫폼을 설정하는 데 전문 지식이 필요하기 때문에 어려움을 겪을 것입니다.마이크로파 플레이트, 어레이 인쇄, 안전한 절차 및 데이터 분석을 준비하는 데 관련된 방법론적 목록 유형에는 세부 사항에 대한 주의가 필요하기 때문에 이 방법을 시각적으로 시연하는 것이 중요합니다. 일부 절차는 제 연구실의 기술자인 Sam Greenwood가 시연할 것입니다. 먼저 Clostridium difficile 항원과 인쇄 버퍼를 최적의 농도로 희석합니다.다음으로, 10마이크로리터의 항원 용액을 384웰 플레이트로 옮깁니다. 플레이트를 플레이트 씰로 덮고 실온에서 5분 동안 300배 중력으로 원심분리합니다. 마이크로어레이 인쇄의 경우 휴대용 가스 버너를 사용하여 실리콘 PIN을 각각 2초씩 세 번 가열합니다.그런 다음 실리콘 핀을 깨끗한 물에 각각 3초씩 세 번 헹굽니다. 마이크로어레이 플레이트를 어레이어의 로딩 카트리지에 놓습니다. 트레이를 꺼낸 다음 아미노 실란 슬라이드를 슬라이드 트레이에 넣고 OK 버튼을 눌러 진공 청소기를 켭니다.모든 슬라이드가 고정되었는지 확인하고 확인을 클릭합니다. 트레이를 원점으로 되돌리고 뚜껑을 닫습니다. 그런 다음 적절한 프로그램을 실행하고 파일, Microarraying Parameters, Open으로 이동합니다. Clostridium difficile 파일을 선택하여 모든 항원을 4배로 인쇄합니다.이 창에서 Source 탭을 열어 샘플 저장을 표시하고 Target 탭을 열어 마이크로어레이 세부 정보를 입력합니다. 그런 다음 옵션 탭을 열어 세탁 도구를 선택합니다. Run Preferences의 General 탭에 있는 TAS Applications Suite 도구 모음에서 Wash at start of run을 선택하고 Wash at end of run을 선택합니다.기후 탭을 열고 습도 수준을 55%에서 60% 사이로 설정하십시오.이제 실행을 시작하고 어레이어를 주기적

a-protein-microarray-assay-for-serological-determination-antigen

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

특발성 질환에 적응 면역의 미생물 목표 식별은 효소 연결된 immunospot 분석을 사용하여 수행할 수 있습니다.

효소 링크된 Immunospot 분석 (ELISPOT) : 미생물 항원 반대 예뻐 - 1 세포 면역 반응의 부량

그러면 표면 항원 (DotScan CRC microarray)를 인식 맞춤 항체 microarrays에 캡처되어 가능한 단일 세포를 생산하는 대장암 (CRC)의 disaggregation에 대한 절차를 설명했다. microarray에 바인딩된 세포의 하위 인구는 형​​광 염료와 태그 단클론 항체를 사용하여 형광 멀티플렉싱하여 프로파일 수 있습니다.

항체 Microarray 및 형광 멀티플렉싱을 사용하여 대장암 세포 표면 단백질 프로파일

출처: Al Ahmar, R., et al. 녹농균 의 작은 군집 변종의 배양 및 알지네이트의 정량화. J. Vis. 경험. (2020년)이 비디오는 녹농균에 의해 생성되는 보호용 엑소다당류인 알긴산염을 정량화하기 위한 비색 면역분석법을 보여줍니다. 이 절차에는 마이크로플레이트를 샘플로 코팅하고, 특정 항체를 적용하고, 효소-기질 반응을 사용하여 측정 가능한 색상 변화를 생성하는 작업이 포함됩니다. 그런 다음 표준 곡선을 사용하여 샘플의 색상 강도에 따라 알지네이트 농도를 결정합니다.

항체 기반 효소 결합 면역흡착 분석을 사용한 박테리아 알지네이트 정량

이 비디오에서는 인플루엔자 바이러스 균주의 항원 아형이 인쇄된 마이크로어레이 슬라이드를 사용하여 여러 인간 혈청 샘플에서 항체 동형을 검출하는 프로세스를 보여줍니다.

바이러스 항원에 대한 혈청 내 항체 동형을 검출하기 위한 바이러스 항원 마이크로어레이 분석

이 비디오는 항체 마이크로어레이 칩을 사용하여 환경 샘플에서 시아노박테리아 균주를 검출하는 방법을 보여줍니다. 다양한 박테리아를 운반하는 샘플은 인쇄된 항체와 상호 작용하며, 형광단으로 표지된 항시아노박테리아 균주 항체로 면역염색하면 뚜렷한 반점에서 형광을 통해 특정 시아노박테리아 균주의 존재를 확인할 수 있습니다.

항체 마이크로어레이 칩을 이용하여 시아노박테리아 균주를 검출하는 기술

사람이 소비하는 담수 저장고에 시아노박테리아 독소가 존재하는 것은 물 관리 당국의 주요 관심사입니다. 수질 오염의 위험을 평가하기 위해 이 문서에서는 항체 마이크로어레이 칩을 사용하여 액체 및 고체 샘플에서 시아노박테리아 균주를 현장에서 검출하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다.

검출 실험 프로토콜 시아 노 박테리아 항체 마이크로 어레이 칩과 액체 및 고체 시료에

두 슬라이드를 간단 하 게 스냅 하 여 교차 reactivity 무료 다중화 샌드위치 immunoassays를 수행 하기 위한 스냅 칩 기술을 설명 합니다. 스냅 기구 시 약 microarray microarray에서 안정적으로 전송 하는 데 사용 됩니다. 어떤 생 화 확 적인 반응을 교차 오염 없이 다른 시 약의 colocalization를 요구에 대 한 스냅 칩을 사용할 수 있습니다.

교차 reactivity 무료 및 정찰 병 무료 스냅 칩 샌드위치 Immunoassays 다중화

여기 우리는 개발 및 유효성 검사는 단일 분자 배열 디지털 ELISA 분석 결과의 인간의 샘플에서 모든 IFN-α의 매우 민감한 탐지를 가능 하 게 설명 하는 프로토콜을 제시.

개발 및 검증 磁 단일 분자의 배열 디지털 효소 연결 된 Immunosorbent 분석 결과 인간 인터페론-α에 대 한

여기, 우리는 높은 처리량 프로토콜 화면 extracellular 단백질 microarrays 소설 수용 체 ligand 상호 작용의 식별을 제시. 우리는 또한 단백질 microbead 복합물을 사용 하 여 일시적인 단백질-단백질 상호 작용의 탐지를 강화 하는 방법을 설명 합니다.

세포 외 단백질 Microarray 기술은 낮은 친 화력 수용 체 Ligand 상호 작용의 높은 처리량 검색

우리는 다른 바이러스 긴장에서 250개 이상의 항원에 대하여 다중 항체 이소타입을 위한 혈청을 동시에 조사하기 위하여 니트로셀룰로오스 코팅된 슬라이드에 인플루엔자 항원을 인쇄해서 건설된 단백질 마이크로어레이를 이용하기 위한 프로토콜을 제시합니다, 이렇게 바이러스 특수형에 걸쳐 혈청 항체의 폭의 측정을 허용.

바이러스 특수형에 걸쳐 혈청 항체의 폭을 측정하기 위해 인플루엔자 항원 마이크로어레이의 사용

배우세요 Clostridium difficile 감염에 대한 단백질 마이크로어레이 방법으로 다중 아이소타입 및 균주 특이적 항체 반응을 정량화하는 기술입니다. 이 방법은 환자 맞춤형 면역요법 최적화와 체액성 면역 반응 연구에 활용됩니다.

항 원 특정 항 체 응답 다음 Clostridium 남과 어울리지 않 는 감염의 혈 청 학적인 결정에 대 한 단백질 Microarray 분석 결과

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