항 원 특정 항 체 응답 다음 Clostridium 남과 어울리지 않 는 감염의 혈 청 학적인 결정에 대 한 단백질 Microarray 분석 결과

이 방법은 환자 특이적 방식으로 클로스트리듐 디피실 감염에 대한 임상적으로 유용한 면역 요법을 최적화 및 선택하고 클로스트리듐 디피실에 대한 인간 면역 반응을 규명하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 C.difficile 항원에 대한 다중 동형과 균주 특이적 항체 반응을 정확하고 동시에 정량화할 수 있다는 것입니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 고도로 정제된 항원 패널을 설정 및 최적화하고 기술 플랫폼을 설정하는 데 전문 지식이 필요하기 때문에 어려움을 겪을 것입니다.

마이크로파 플레이트, 어레이 인쇄, 안전한 절차 및 데이터 분석을 준비하는 데 관련된 방법론적 목록 유형에는 세부 사항에 대한 주의가 필요하기 때문에 이 방법을 시각적으로 시연하는 것이 중요합니다. 일부 절차는 제 연구실의 기술자인 Sam Greenwood가 시연할 것입니다. 먼저 Clostridium difficile 항원과 인쇄 버퍼를 최적의 농도로 희석합니다.

다음으로, 10마이크로리터의 항원 용액을 384웰 플레이트로 옮깁니다. 플레이트를 플레이트 씰로 덮고 실온에서 5분 동안 300배 중력으로 원심분리합니다. 마이크로어레이 인쇄의 경우 휴대용 가스 버너를 사용하여 실리콘 PIN을 각각 2초씩 세 번 가열합니다.

그런 다음 실리콘 핀을 깨끗한 물에 각각 3초씩 세 번 헹굽니다. 마이크로어레이 플레이트를 어레이어의 로딩 카트리지에 놓습니다. 트레이를 꺼낸 다음 아미노 실란 슬라이드를 슬라이드 트레이에 넣고 OK 버튼을 눌러 진공 청소기를 켭니다.

모든 슬라이드가 고정되었는지 확인하고 확인을 클릭합니다. 트레이를 원점으로 되돌리고 뚜껑을 닫습니다. 그런 다음 적절한 프로그램을 실행하고 파일, Microarraying Parameters, Open으로 이동합니다. Clostridium difficile 파일을 선택하여 모든 항원을 4배로 인쇄합니다.

이 창에서 Source 탭을 열어 샘플 저장을 표시하고 Target 탭을 열어 마이크로어레이 세부 정보를 입력합니다. 그런 다음 옵션 탭을 열어 세탁 도구를 선택합니다. Run Preferences의 General 탭에 있는 TAS Applications Suite 도구 모음에서 Wash at start of run을 선택하고 Wash at end of run을 선택합니다.

기후 탭을 열고 습도 수준을 55%에서 60% 사이로 설정하십시오.이제 실행을 시작하고 어레이어를 주기적으로 점검하여 적절한 기능을 보장하십시오. 인쇄 후 인쇄된 슬라이드를 16개의 멀티웰 챔버가 있는 슬라이드 홀더에 조심스럽게 놓습니다. 그런 다음 각 블록에 100마이크로리터의 5%BSAT를 추가합니다.

슬라이드를 덮고 흔들면서 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 120마이크로리터의 PBST를 사용하여 각 블록을 1분씩 5회 흔들어 세척합니다. 다음으로, C 디피실에 감염된 환자와 건강한 대조군에서 얻은 혈청 샘플을 얼음에서 20분 동안 해동합니다.

마스터 블록에 시판되는 항체 희석제를 첨가한 다음 마스터 블록에 샘플을 추가하고 혼합합니다. 세척 버퍼를 버리고 희석된 각 시료 100마이크로리터를 실험 블록에 추가합니다. 음성 대조군 블록의 경우 항체 희석제만 100마이크로리터를 추가합니다.

그런 다음 슬라이드를 실온에서 부드럽게 흔들어 1시간 동안 배양합니다. 다음으로, 120마이크로리터의 PBST를 사용하여 각 블록을 3분씩 5회 흔들어 세척합니다. 그런 다음 항체 희석제로 희석된 비오틴화된 염소 항인간 항체 100마이크로리터를 각 블록에 추가합니다.

슬라이드를 덮고 실온에서 1시간 동안 부드럽게 흔들어 배양합니다. 120마이크로리터의 PBST를 사용하여 각 블록을 3분씩 5회 흔들어 세척합니다. 다음으로, 5% BSAT에 희석된 streptavidin SY5 접합체 100마이크로리터를 각 블록에 1-2,000의 비율로 첨가합니다.

슬라이드를 호일로 덮고 실온에서 15분 동안 부드럽게 흔들어 배양합니다. 먼저 120마이크로리터의 PBST로 슬라이드를 1분씩 5회 세척한 다음 PBS로 각각 1분씩 2회 더 세척합니다. 슬라이드를 말리려면 300배 중력에서 5분 동안 회전시킵니다.

스캔하기 30분 전에 레이저 스캐너를 켜서 예열할 수 있도록 합니다. 그런 다음 플레이트 표시등이 녹색으로 고정될 때까지 인쇄된 표면이 위를 향하도록 슬라이드를 스캐너에 놓습니다. 그런 다음 설정 버튼을 누릅니다.

첫 번째 탭에서 자동 스크롤 및 바코드가 선택 해제되어 있는지 확인합니다. 그런 다음 픽셀 크기를 10으로, 스캔 모드를 중간으로, 획득을 635로만, 획득 모드를 수동으로, 게인을 20으로, 전력을 낮음으로 설정합니다. 두 번째 탭에서 슬라이드 유형에 레이블이 지정되지 않았는지 확인합니다.

세 번째 탭에서 초점 설정을 자동 초점으로 설정합니다. 가져오기 그리드 버튼을 눌러 스캔한 이미지와 연결된 적절한 어레이 목록을 선택합니다. 그런 다음 자동 찾기 버튼을 눌러 그리드를 슬라이드의 지점에 정렬합니다.

마지막으로 Quantification Process 버튼을 눌러 각 스폿의 형광 강도를 측정합니다. 그런 다음 추가 분석을 위해 결과를 적절한 형식으로 저장합니다. 이 프로토콜에서는 단백질 마이크로어레이를 ELISA와 비교하여 이러한 두 기술 간의 재현성을 평가합니다.

Spearman 상관 계수 분석은 혈청 샘플에서 IgG 항독소 A 및 항독소 B 수준을 검출하기 위해 마이크로어레이와 ELISA 간의 상당한 일치를 보여줍니다. 단백질 마이크로 어레이의 도입 분석 및 분석 간 재현성은 7명의 환자의 혈청 샘플을 사용하여 계산됩니다. 독소 A, 독소 B, SLP001, SLP002, SLP027, 독소 B의 독소 B에 대해 분석한 두 개의 서로 다른 어레이 슬라이드에서 분석된 샘플은 균주 CCUG만 생성하고 pCDTb 항원은 우수한 재현성을 보여줍니다.

단백질 마이크로어레이는 클로스트리듐 디피실 독소에 대한 동종 특이적 항체 반응을 검출하기 위해 수행됩니다. 환자 및 건강한 개인의 혈청 샘플은 독소 A, 독소 B, 균주만 발현하는 클로스트리듐 디피실 독소 B의 독소 B 및 이진 독소 B 단편의 전구체 형태에 대한 IgG 및 IgA 수치를 감지하는 데 사용됩니다. 이 기술을 숙달하면 7시간 안에 완료할 수 있습니다.

품질 관리 실험, 적절한 표면 화학적 성질 선택, 인쇄 버퍼, 차단 버퍼, 혈청 샘플 및 2차 항체의 희석과 같은 다양한 매개변수는 샘플을 실행하기 전에 평가해야 합니다. 고품질 어레이를 인쇄하려면 실험 프로토콜에 따라 매개변수 인쇄를 조정하기 위해 어레이 또는 소프트웨어에 대한 충분한 이해가 필요합니다. 실험 전반에 걸쳐 어레이의 최적 성능과 먼지가 없는 환경을 유지하는 것이 중요합니다.

이 기술은 감염에 대한 체액성 면역 반응을 특성화하고 혈청 진단 항원을 발견하는 측면에서 면역학 및 분자 생물학 분야의 연구자들에게 길을 열어줄 것입니다. 감염된 혈액 샘플과 박테리아 독소를 가지고 작업하는 것은 위험할 수 있다는 것을 잊지 마십시오. 일반적으로 실험실에서는 이 절차를 수행하는 동안 항상 안전 및 표준 예방 조치를 고려해야 합니다.