Summary
In situ bioindications aktiverer bestemmelse af egnetheden af en miljø for truede musling arter. Vi beskrive to metoder baseret på ferskvands perle muslinger i bure juvenile eksponering for oligotrophic floden levesteder. Begge metoder er implementeret i varianter til åbent vand og hyporheic vand miljøer.
Abstract
Viden om habitat egnethed for ferskvand muslinger er et vigtigt skridt i bevarelsen af denne truede arter-gruppen. Vi beskriver en protokol til at udføre i situ juvenile eksponering test i oligotrophic floden afvandingsområder en måned og tre-måneders perioder. To metoder (i både ændringer) præsenteres for at evaluere den juvenile vækst og overlevelse sats. Metoder og ændringer har forskellig værdi for lokalitet bioindication og hver har dens fordele samt begrænsninger. Den sandede bur metode anlæg med en lang række enkeltpersoner, men kun nogle af personerne, der er målt og resultaterne evalueres i bulk. I metoden mesh bur enkeltpersoner holdes og måles separat, men et lavt individuelle tal er evalueret. Åbent vand eksponering ændring er relativt lette at anvende; Det viser den juvenile vækst potentiale af websteder og kan også være effektive for vand toksicitetstest. Inden for bed eksponering ændring har brug for en stor arbejdsbyrde men er tættere på betingelserne af en juvenil natur og det er bedre for rapportering virkelige egnetheden af lokaliteter. På den anden side er mere replikationer nødvendige i denne ændring på grund af dens high-hyporheic miljø variabilitet.
Introduction
Eksponering af eksperimentelle organismer i situ med den efterfølgende evaluering af deres tilstand er en mulig måde at få oplysninger om miljøkvalitet og (især) websted egnethed til en art. Inden for dyr kan sådan en bioindication anvendes primært til små hvirvelløse dyr, som er i stand til at leve i en begrænset afgrænset rum. Unge stadier af muslinger (Bivalvia) er en sådan egnet organisme gruppe1.
Muslinger af slægten Unionidae er en meget vigtig del af vandøkosystemer2. Disse arter er imidlertid ofte kritisk truet, især i vandløb og floder. Nogle af dem er karakteriseret som 'paraply arter' hvis bevaring er nært beslægtet med bevarelse af den hele strøm biotop og som kræver en omfattende tilgang3. Disse dyr har en livscyklus, der er forbundet med mange miljø komponenter, fra vand kemi4,5 til ændringer i bestandene af fisk, der tjener som mussel larver værter6. Fordi mussel ungfisk ofte repræsenterer en kritisk fase af livscyklus mussel site egnethed for deres udvikling på dette stadium er afgørende for en vellykket arter befolkning udvikling i et lokalområde.
Ferskvands perle muslingen (FWPM, Margaritifera margaritifera; Unionida, Bivalvia) er et kritisk truede toskallede forekommende i oligotrophic europæiske vandløb. Deres antal er faldet drastisk i løbet af 20århundrede på tværs af området forekomst . Det lader til, at den nuværende nedgang i arter reproduktion i fleste af de centrale europæiske befolkninger er primært forårsaget af meget lav nul overlevelse af ungfisk under de første år af deres liv. Det antages, at unge FWPMs lever i mange år i lavvandede hyporheic zone7, hvoraf betingelserne og deres variation ikke er stadig godt beskrevet. Desuden, indtil deres andet år af livet, unge kun har en dimension af op til ca. 1 mm, så de er meget svære at finde i store mængder sediment under naturlige forhold8. Det er derfor nødvendigt for studiet af deres økologi eksperimenter med fangenskab ungfisk.
Inden for den tjekkiske handlingsplan for ferskvands perle Mussel9, der er tusindvis af unge stigende hvert år fra en semi-naturlige avlsprogram. Der er dog et spørgsmål som lokaliteter og levesteder er egnet til vellykket befolkning støtte af disse ungfisk eller eventuel arter genindførelse. In situ bioindications præsentere en måde at finde svaret.
På trods af at inkonsekvent overlevelsesprocenten af unge muslinger i eksponering bure blev observeret i nogle tidligere værker, der satte spørgsmålstegn ved egnetheden af unge muslinger som bioindikatorerne10, flere nyere undersøgelser har bekræftet den anvendeligheden af juvenile eksponering metoder for vandkvaliteten test11,12,13. Det er desuden påvist, at flere faktorer skal tages i betragtning ved fortolkningen af disse særlige undersøgelser, som bestanden oprindelse14 og de vedvarende virkninger af larve vilkår15.
Spørgsmålet er hvordan du installerer eksperimentelle ungfisk i testet lokaliteter og hvordan man mest effektivt evaluere deres tilstand. Den første strenge anvendelse af i situ eksponering metoder med juvenil FWPMs blev udgivet af Buddensiek16. Juvenile FWPM personer blev holdt i ark bure, udsat i frit strømmende vand fra vandløb, og deres overlevelse og vækst blev kvantificerede efter flere ugers udsættelse. Metoden blev oprindeligt udviklet som en semi-kunstig avl metode, men forfatteren også fremhævet dens anvendelighed for vurdering af habitat krav og vandkvalitet. Selv om den FWPM ungdoms overlevelse er naturligt meget lavt på en skala fra måneder/år og kun et meget lille antal dyr vil overleve, overlevelsesraten kan være en god markør for den miljømæssige virkning på en skala fra flere uger16. Over års forskning, blev eksponering metoder udviklet efter hold eksperimentelle juvenile mussel i stream levesteder og evaluere deres vækst og overlevelse satser; Disse omfatter sandede rubrik17, mussel siloer baseret på en upwelling princippet18, og forskellige andre eksponering bure (sammenfattet af tyggegummi og kolleger)11. Fordi yngel forekommer naturligt i lavvandede hyporheic zone7, er anvendelse af eksperimentelle enheder inden for stream bunden meget ønskeligt.
I vores artikel, vi beskriver brugen af to eksponering enheder til FWPMs: Jeg) ændret Buddensiek ark bure ("mesh bure") også aktivering bioindication test i hyporheal betingelser; og ii) Hruška sandstrand bokse ("sandede bure"). Protokollen beskriver anvendelsen af begge metoder i åbent vand og hyporheic betingelser (dvs.fire varianter af eksponering er beskrevet). Metoderne blev gradvist ændret og udvidet i mere end 15 år i programmet i den tjekkiske handlingsplan for ferskvands perle Mussel9 og kontrolleret af et sæt af forsøg.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. mesh bur
Bemærk: Se figur 1.
- Forberede materiale
- Forberede materiale til den i laboratorie del af forsøget: ~ 1-2 L-flodens vand pr. mesh bur, mesh bure (1 vigtigste plastik krop, 2 plastkabinetter, 2 plader af særlige tekniske sigter med 340 µm porer, 4 skruer og 4 møtrikker pr. bur), tænger , en kæp, Pasteur pipetter, en si, et digitalt kamera, en trinocular dissekere zoom stereo-mikroskop, en kalibrering gitter (mikroskop udstyr), 5 petriskåle af 50 mm diameter, bægre, 2 plast retter (~ 25 cm x 15 cm x 3 - 5 cm), og en plastik kasse.
- For at udføre hyporheal installation, forberede en gummislange, og en 100-µm-pore maske og en sprøjte flaske. Opførelsen af enheden, finder du i supplerende fil 1: S.1. Mesh bure konstruktion.
- Samle bunden og centrale del af trådnet burene. Samle del af buret, der holder personerne. Indsæt en plastik cover først, derefter sigtes, et ark af plast, og endelig vigtigste organ på toppen. Bruge fire bolte til at fastgøre den.
- Forberede biologisk materiale
- Sætte trådnet bur til den plastik skål indeholdende flodvand. Sikre, at afdelingerne er halvt fyldt. Tage FWPM ungfisk (Se supplerende fil 1: S.6. Biologisk materiale) ud for boksen termisk isoleret og sætte dem i petriskålen.
Bemærk: Sikre, at pludselige temperaturændringer ikke overstiger ~ 2 ° C. - Ved hjælp af en sprøjte flaske og si, støvtætte gennem den unge til at klare efterladenskaber.
- Sætte trådnet bur til den plastik skål indeholdende flodvand. Sikre, at afdelingerne er halvt fyldt. Tage FWPM ungfisk (Se supplerende fil 1: S.6. Biologisk materiale) ud for boksen termisk isoleret og sætte dem i petriskålen.
- Konfigurer mikroskop og kamera. Udføre en kalibrering af instrumenter (Se supplerende fil1: S. 5. Mikroskop og phototechnics). Placer en petriskål, som indeholder lidt vand under mikroskop.
- Sætte de unge fugle i bure (forsøgslaboratorium arbejde)
- Bruge Pasteur pipette til at fjerne en person fra en petriskål og omhyggeligt placere det i petriskålen under mikroskop.
- Tjekke den enkelte fitness ved at kigge i okularet (~ 40 X forstørrelse).
Bemærk: "God" fitness betyder at enkelt flytter, roterer fra side til side, skubber foden ud af skallen m.m. fjerner døde eller lav fitness enkeltpersoner med en Pasteur afpipetteres og placere dem i en separat petriskål (FWPM unge med en åbnet Shell, ingen bevægelse, foden er ikke trukket ud, en fragmenteret shell, ungfisk, der flyder ukontrollabelt i vandet, en synlig nedbrydning af shell, delvis afkalkning). - Tage to billeder af en FWPM individuelle viser god fitness ved hjælp af en konstant forstørrelse af ~ 80 X. Se supplerende fil 1: S.5. Mikroskop og phototechnics. Gemme billederne.
Bemærk: En god måling af dens længde, unge skal lægges på langs (lateral udsigt). Det vigtigste mål er at tage en høj kvalitet billede af den maksimale shell længde godt nok til at aktivere et billede analyse bagefter. - Indsætte unge i den relevante afdeling i buret, så snart billederne er taget. Registrere antallet af billeder og kammer.
- Gentag dette trin med hver enkelt for alle de anvendte kamre i trådnet bur.
Bemærk: Se supplerende fil 1: S.1. Mesh bure konstruktion. - Når alle anvendte afdelingerne har perle muslinger, lægger plasten sigtes på buret, så blidt sætte den plast dække og sikre alle dele sammen med nødder.
- I tilfælde af en installation i en hyporheic zone, passerer en af slange ender gennem en af afdelingerne og ordne det i denne position, og derefter tage den anti-tilstopning mesh og binde det på den nederste ende (Se supplerende fil 1: S.1. Mesh bure konstruktion).
- Butik yngel
- Sætte buret i plastboks med flodvand, således at unge er helt nedsænket, og holde det i thermobox. Før installationen, lad den unge tilpasses i situ -floden vandtemperaturen på stedet af installation (gradvis afkøling, max. 5 ° C i 24 timer).
- Installere mesh bure
- Forberede området materiale herunder trådnet burene med unge, stål pigge, bolte og metal nødder, en kæp, feltet temperatur dataloggers (Se Tabel af materialer og supplerende fil 1: S.4.2. Vand måling), en streng, en kamera, felt-protokollen, en hammer, og en spade.
- Transport FWPM ungfisk til webstedet i et felt thermobox (isoleret boks), at holde en stabil vandtemperatur variationer < ~ 2 ° C. Sætte thermobox med mesh bure i floden på stedet for at lade de unge fugle tilpasning til de lokale miljøforhold (pH, ledningsevne, osv.).
- Installere trådnet bur.
- Fjerne trådnet bur fra feltet thermobox. Give det med to stål pigge og fastgør felt datalogger. Anker buret i en levesteder med betingelser, der er typiske for FWPMs i det undersøgte område (f.eks.på kanten af main-stream flow, ikke i direkte vandflow, ikke i stillestående vand, ikke i direkte sollys).
- For åbent vand, ved hjælp af et par af stål pigge, fastsætte bur til floden bunden; lægge den på sin side og niveau med floden bunden, downstream i en vinkel på 45° til floden flow, mod midten af floden. Den nederste vandrette kant skal være omkring 10-15 cm over floden bunden overflade. Opretholde en minimumafstand på 2 m mellem hvert bur på en lokalitet (Se supplerende fil 1: S.4. Bure vedligeholdelse).
- For hyporheic zonen, grave bure i floden bunden i en vinkelret landskab holdning, vinkelret på strømmen af vand, således at den øverste vandrette kant af buret er parallelt med floden bunden overfladen og afdelingerne er placeret på hyporheic dybde, der skal testes. Tag ud i den øvre ende af gummislange over den nederste overflade mulighed for vand prøvetagning under eksperimentet (Se supplerende fil 1: S.4.2. Vand måling).
Bemærk: Det anbefales at foretage regelmæssig kontrol og vedligeholdelse på bure (Se supplerende fil 1: S. 4. Bure vedligeholdelse).
- Fjerne trådnet bur fra feltet thermobox. Give det med to stål pigge og fastgør felt datalogger. Anker buret i en levesteder med betingelser, der er typiske for FWPMs i det undersøgte område (f.eks.på kanten af main-stream flow, ikke i direkte vandflow, ikke i stillestående vand, ikke i direkte sollys).
- Afinstallere bure og transportere unge efter eksponering. For dette, trække bure ud af vandet, klare dem af fint sediment samt i fygende materiale og sætte dem ind i feltet thermobox fyldt med flodvand. Transport bure straks til laboratoriet og starte dødelighed og vækst sats vurdering.
Bemærk: Se supplerende fil 1: S.3. Udsættelsens varighed. For en temperaturforskel på mere end 5 ° C mellem bure og laboratoriemiljø er det nødvendigt først at lade temperaturen udligne. - Evaluere forsøget ved at kontrollere liv/fitness af hver juvenile (Se trin 1.5.2 og 1.5.3) og tage 2 billeder af hver live ungdomskriminalitet i en petriskål ved hjælp af en konstant forstørrelse af ~ 80 X. Optage egnethed og antallet af billeder og kamre.
- Komplet eksperiment (fælles for alle metoder)
- Udføre målingerne i billed analyse software. Brug billede analyse software til kroppen størrelsesbestemmelse af hver evaluerede juvenile på både input billeder (trin 1.5.3) og output billeder (trin 1.9). Brug den maksimale samlede shell længde registreret i begge fotografier som krop størrelse værdier i både input og output.
- Indsæt de målte værdier i tabel processor og beregne den vækst tilvækst (%) for hver enkelt overlevende juvenile.
- Anslå overlevelsesrate (%) pr. mesh bur ved hjælp af forholdet mellem antallet af overlevende personer til alle eksperimentelle individer i trådnet bur.
Bemærk: Efter eksperimentet, returnere overlevende til avlsprogram
(Se supplerende fil 1: S.6. Biologisk materiale).
2. Sandy bur
Bemærk: Se figur 2.
- Forberede materiale
- Forberede materiale til den i laboratorie del af forsøget: 2 petriskåle (diameter ~8.5 cm), Pasteur pipetter, en si, 25 L af flodvand, en plastik kasse, sier (mesh størrelse 1 og 2 mm), en stor plastik kasse (25 L), en sandstrand bur (Se supplerende fil 1 : S.2. Sandy bure konstruktion), et digitalt kamera, en trinocular dissekere zoom stereo-mikroskop, en kalibrering gitter (mikroskop udstyr), sorteret floden sand fra området undersøgelse (Se trin 2.1.3), og protokollen. Se tabel af materialer og supplerende fil 1: S. 2. Sandy bure konstruktion.
- Forberede materiale til isolering proces: runde containere (1 for hvert bur plus 1 ekstra), 2 petriskåle (diameter ~ 14 cm), en Pasteur pipette, forstørrelsesglas og 1 L af flodvand.
- Støvtætte floden sand gennem en 2 mm sigte og derefter gennem en 1-mm sigte at få en kornstørrelse på 1-2 mm. tør sandet og gemme det i en tør form indtil kræves.
- Tage unge (Se supplerende fil 1: S.6. Biologisk materiale) ud af thermobox og sætte dem i petriskålen. Ved hjælp af en sprøjte flaske og si, støvtætte gennem den unge til at klare efterladenskaber.
- Indstilling af mikroskopet og kamera (Se supplerende fil 1: S.5. Mikroskop og phototechnics).
- Sætte unge fugle i bure (forsøgslaboratorium arbejde)
- Placer sandet buret i boksen plast. Scatter sorteret sandet (Se trin 2.1.3) op til en tredjedel af højden af den sandede bur. Hæld vand i boksen. Sikre at den sand overflade er ca 10 mm under vandstanden. Indsæt den sandede bur i boksen 25 L af flodvand og udsættes for den samme temperatur som de unge FWPMs (Se supplerende fil 1: S.6.2. Opbevaring af det biologiske materiale) for 12 h. undgå eksponering af sandet for sollys.
- Tage en petriskål med de villige FWPM ungfisk.
- Kontrollere den enkeltes egnethed ved at kigge i okularet (Se trin 1.5.2).
- Udføre den fotografisk dokumentation som følger. Tage et billede af alle individer opdaget (Se trin 1.5.3) og vælge 10 af de største individer. Alternativt kan du tage billeder af alle unge sammen med lav forstørrelse (~ 40 X) for en bulk evaluering og vælger de 10 største individer. Gemme alle billederne og optage deres numre.
- Ved hjælp af en sprøjte flaske, flytte FWPM ungfisk i rede sandede buret.
- Butik yngel
- Sætte bur i den store plastic boks med flodvand, så buret er fuldt nedsænket og holde det i thermobox. Lad den unge, tilpasses i situ floden vandtemperaturen (gradvis afkøling, max. 5 ° C i 24 timer) før installationen.
- Installere sandede bure
- Forberede materiale til felt installation: sandede bure, en ~ 25-L felt thermobox, en flad sten (minimal vægt 1 kg), et net (mesh størrelse 10 x 10 mm), en sprøjte flaske, felt temperatur dataloggers (Se Tabel af materialer og supplerende fil 1: S.4.2. vand måling), en spade, og felt-protokollen.
- Transport bure med yngel til webstedet i feltet thermobox, at holde en stabil vandtemperatur (~ 2 ° C change). Sætte feltet thermobox med de sandede bure i floden på webstedet felt at lade FWPM ungfisk tilpasning til de lokale miljøforhold (pH, ledningsevne, osv.).
- Installere de sandede bure til levesteder med betingelser, der er typiske for FWPMs (f.eks.på kanten af den største strøm strøm i en bugte, ikke i direkte vandflow, ikke i stillestående vand, ikke i direkte sollys).
- For åbent vand, fastgør de sandede bure til en flad sten ved hjælp af et net og placere det i floden bunden. Sikre, at den større side af Cage danner en vinkel på 45° med strømmen.
- For Hyporheal, skal du grave bure i floden bunden vinkelret på strømmen af vand, så buret låget er i niveau med river bunden overfladen.
Bemærk: Det anbefales at foretage regelmæssig kontrol og vedligeholdelse på bure (Se supplerende fil 1: S. 4. 1. site kontrol).
- Afinstallere bure og transport ungfisk efter eksponering
Bemærk: Se supplerende fil 1: S.3. Udsættelsens varighed.- Trække bure ud af vandet, klare dem af fygende materiale og sætte dem ind i feltet thermobox fyldt med flodvand.
- Transport bure til laboratoriet og starte dødelighed og vækst sats vurdering.
Bemærk: Ved en temperaturforskel på mere end 5 ° C mellem bure og laboratoriemiljø, det er nødvendigt at lade temperaturerne udligne.
- Separat FWPM yngel fra sand
- Forberede en rund beholder med en vanddybde på 50 mm (for hvert bur separat) og en ekstra runde container. Overføre sandet fra buret til objektbeholderen runde. Bruge en hvirvlende bevægelse til at vaske ud de lettere partikler i en ekstra beholder.
- Prøve indhold fra denne beholder gradvist og søge efter ungfisk trinvis ved hjælp af Pasteurs pipette og et forstørrelsesglas. Sætte unge i petriskålen ved hjælp af Pasteurs pipette. Gentag dette trin, indtil den sidste unge er blevet fundet og derefter en anden 10 x efter de første negative fund. Efter hver vask trin, skal du tilføje ren flodvand til den originale beholder med sand.
Bemærk: Især efter den første vask ordentligt kendskab til indholdet og rense det af ballast som fint sediment og andre alluvia.
- Evaluere forsøget
- Kontrollere fitness af hver juvenile (Se trin 2.4.3 og 1.5.2) og tælle antallet af overlevende.
- Tage et billede (Se trin 2.4.4.) af hver enkelt separat, selv om det betyder, der er ingen klare identiteten af hver enkelt. Alternativt kan du tage bulk billeder og vælge et undersæt af de 10 bedst dyrkes personer fra de endelige resultater.
Bemærk: Begge muligheder har en lignende rapportering værdi. Mulighed 1 har en begrænsning af en større arbejdsbyrde, men også gavn af den højeste foto forstørrelse og dermed også større nøjagtighed.
- Komplet eksperimentet
- Udfør målinger i billed analyse software. Komplet eksperimentet som gjort i de trådnet bure (Se trin 1,10) med følgende undtagelse: evalueres ikke vækstrate (%) af hver juvenile men evaluere gruppen som helhed i det sandede bur forsøg.
Bemærk: Efter forsøget, overlevende bør returneres til avlsprogram
(Se supplerende fil S.6.1. SeLEKTIONSKOEFFICIENTER af biologisk materiale).
- Udfør målinger i billed analyse software. Komplet eksperimentet som gjort i de trådnet bure (Se trin 1,10) med følgende undtagelse: evalueres ikke vækstrate (%) af hver juvenile men evaluere gruppen som helhed i det sandede bur forsøg.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De fire bioindication metoder (åbent vand sandede bure, sandede bure i seng, åbne vand mesh bure og mesh bure inden for bed) blev anvendt til at undersøge miljøet tilstand egnethed for FWPMs i den øverste Vltava River Basin (Böhmerwald, tjekkisk Republik). Denne flod repræsenterer én FWPM residual lokalitet inden for centrale Europa19. Her præsenterer vi et specielt udvalgt sæt af resultater illustrerer de vigtigste aspekter af de fire metoder. Yderligere detaljer er beskrevet i en omfattende undersøgelse af sort et al. 13.
River miljø blev undersøgt på to niveauer:
(I) en langsgående floden profil var repræsenteret ved main-stream lokaliteter (websteder A - E) og bifloder af forskellige forurening stadier (websteder R og V). Lokaliteter blev testet både sandede bure og mesh bure installeret i frit strømmende vand. Derudover en grus hyporheic zone blev testet af i sengen sandy bure i lokalområder B, C og D.
(II) en hyporheic miljø blev testet i den valgte lokalitet C. Egnetheden af forskellige substrater (sand, grus, sten) blev testet af inden for bed mesh bure.
Vækst og overlevelse på > 1 år gamle ungfisk (Se supplerende fil 1: S.6. Biologisk materiale) blev testet. Eksperimentet blev udført i dets fulde udstrækning i sommeren 2014 og blev gentaget i mindre omfang på nogle lokaliteter i sommeren 2015. Inden for niveau, (I), 2-6 sandy bure med et minimum af 100 unge og 6 (2014) eller 4 (2015) mesh bure med 6 unger blev anvendt på hver lokalitet, testet af den relevante metode. I niveau (II), var 7 mesh bure med 6 unger installeret i hver afprøvede miljø. Eksponeringstiden var en måned for trådnet burene og tre måneder for de sandede bure.
Den statistiske analyse blev udført i R, version 3.1.020. Kruskal-Wallis, Kruskal-Nemenyi og Wilcoxon-Mann-Whitney test blev anvendt. For data med en normalfordeling, blev lineære eller kvadratiske regression udført.
Lokalområderne kan skelnes klart baseret på vækst i åbent vand mesh burene trods høje inden for bur variabilitet, selv i forskellige vækst-gunstige perioder (figur 3). I den mere vækst-gunstig eksponering i 2015 (vækst sats 19.3-41,8%), blev en signifikant tendens opdaget i de langsgående profil hvor vækstraten steg downstream (Kruskal-Wallis test, p < 0,001). Vigtigere, var overlevelsesraten ækvivalent høj i begge sæsoner (fra 83%) (Figur 4A).
På den anden side åbent vand sandede bure viste en anden tendens mellem de vigtigste stream lokalområder i 2014: vækst sats steg nedstrøms fra lokalitet en (52%) gennem den midterste lokalitet C (153%), og derefter faldt igen indtil lokalitet E (46%) (et kvadratisk regression af absolut vækst værdier: r2adj = 0,77, F2,13 = 25.66, d.f. = 16, p < 0,001). Denne tendens blev også bekræftet i 2015, hvor den største vækst blev indspillet på den midterste lokalitet C igen. Også, de absolutte vækst sats værdier ikke afvige meget mellem 2014 og 2015. På den anden side afveg overlevelsesraten i årene, er meget højere i 2015 (fra 48% til 72%) end i 2014 (ca. 25%) (Figur 4B).
En effekt af to forskellige eksponering metoder er også klart synlige i den forurenede biflod (lokalitet V). De sandede bure udsat her i tre måneder viste 0% overlevelse, mens en 83% overlevelsesrate med nogle vækst blev indspillet af åbent vand mesh bure eksponering her i løbet af 30 dagene.
Resultater fra i sengen sandede bure illustrere forskellige betingelser i hyporheic miljøet i forhold til åbent vand i de pågældende lokalområder. Væksten har altid været lavere i hyporheal steder end i åbent vand, og overlevelsesraten var meget mere variabel (fra næsten 50% til 0%, figur 4B).
En undersøgelse af hyporheic microhabitats ved hjælp af i-seng mesh bure viste en signifikant effekt af substrat sammensætning på juvenile overlevelse. De bedste betingelser blev indspillet fra den ilt-mættet stenet bund (en overlevelsesrate tæt på 100%) mens værst (en < 40% overlevelsesrate) var angivet i dårligt iltet sand hvor en meget stor variation i overlevende blev også fundet. Hyporheic vand iltning, som gentagne gange blev målt under eksperimentet, forklarer denne tendens (figur 5).
Figur 1. Bioindication mesh bur med enkelte kamre. Se supplerende fil 1 for yderligere oplysninger. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Bioindication sandstrand bur. Se supplerende fil 1 for yderligere detaljer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Individuel variation i juvenile vækstrate indspillet af åbent vand mesh bure i lokalområder B og E i to sæsoner. De midler og standardafvigelsen er beskrevet for hver mesh bur. Værdierne er baseret på måling af 6 unger (eller 4-5 unge Hvis mortaliteten Vurder > 0%) i hver maske bur.
Figur 4. Eksempel resultater fra et felt bioindication eksperimentere med mesh og sandy bure. (A) dette panel viser eksempel resultater fra et felt bioindication eksperiment med mesh bure. Ialt 6 lokaliteter (B, C, D, E, R og V) i Vltava-floden afvandingsområde blev testet på 2 særskilte lejligheder (i 2014 og 2015). Eksponeringstiden var 30 dage i sommersæsonen. Lokaliteter B - E repræsenterer (i rækkefølge) en langsgående profil af en ca. 20-km strækning af floden main-stream. Lokaliteter R og V repræsenterer profiler af 2 bifloder. Hovedstæder markere den samme lokalitet i panelet (A) og (B). Alle lokaliteter blev testet med åbent vand mesh bure. Derudover lokalitet C blev også testet ved hjælp af i-seng mesh bure installeret i 3 forskellige typer af flodlejet (Cs = sand, Cg = grus, Cst = sten) i 2014. Burene var installeret i 4-7 replikationer på hvert websted. 6 ferskvands perle mussel ungfisk af 1 + år gammel blev brugt pr. mesh bur. De gennemsnitlige vækstrater er markeret for de 3 største personer (maks. 3) fra hver testet mesh bur (kolonner, venstre akse) og den gennemsnitlige overlevelsesrate per mesh bur (blue point, højre akse). (B) dette panel viser eksempel resultater fra et felt bioindication eksperimentere med sandet bure. Samlede of7 lokaliteter (A, B, C, D, E, R og V) i Vltava-floden afvandingsområde blev testet 2 gange (i 2014 og 2015). Eksponeringstiden var 3 måneder om sommeren. Websteder A - E repræsenterer (i rækkefølge) en langsgående profil af en ca. 30-km lang strækning af floden main-stream. Sider R og V repræsenterer profiler af 2 bifloder. Hovedstæder markere samme lokalitet både i dette og i tidligere panel. Alle lokaliteter blev testet med åbent vand sandede bure. Derudover lokaliteter B, C og D blev også testet ved hjælp af i-seng sandede bure installeret i hammeren river bed substrat (Bg, Cg og GD) i 2014. Burene var installeret i 2-4 replikationer på hvert websted. Mindst 100 ferskvands perle mussel yngel var til stede i hver sandede bur. Den gennemsnitlige vækstrate for de 10 største personer (maks. 10) fra hver testet sandede bur (kolonner, venstre akse) og den gennemsnitlige overlevelsesraten pr. sandstranden bur (blue point, højre akse) er markeret. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. Iltmætning. Dette panel viser forholdet mellem minimal værdier af iltmætning i 30 dage af mesh bure eksponering og de overlevende sats pr. bur i inden for bed mesh bure udsat i forskellige bed microhabitats i 2014. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| 2014 | 2015 | |||
| lokalitet | 3-måneders udsættelse af sandede bure | 1-måneds udsættelse af mesh bure | 3-måneders udsættelse af sandede bure | 1-måneds udsættelse af mesh bure |
| A | 13,9 | - | - | - |
| B | 14.4 | 13.4 | 13,9 | 17,5 |
| C | 15 | 13.8 | 14.4 | 18.3 |
| D | 15 | 13.8 | 14.3 | 18.3 |
| E | 15,5 | 14 | - | 18.7 |
| RASMUSSEN | 13.5 | 12.8 | - | - |
| V | 14 | 13.2 | - | - |
Tabel 1. Gennemsnitlige overfladevandets temperatur (° C) på lokaliteter under eksponering i 2014 og 2015.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Eksponeringstid:
Selv en måned udsat mesh bure Vis en synlig vækst afspejler forskellene mellem lokaliteter (figur 3), så de er meget anvendelige til hurtig og nem afsløring af en lokalitet karakterisering. Ikke desto mindre afhænger relevansen af resultaterne den kortsigtede stat af de betingelser, som kan svinge. Især kan korte regn begivenheder spille en rolle. Derimod kan uforudsigelige episodisk forurening ikke altid være registreret. I lokalområde V (figur 4A) fundet vand kemi analyse en kortbølge stærk ammonium stigning13. Dette var sandsynligvis ansvarlig for dødelighed i de tre-måneders udsatte sandede bure men påvirkede ikke 30-dages udsatte mesh bure.
Temperatursvingninger kan også påvirke kortsigtede eksponering resultater. Måneds gennemsnitlige temperatur under mesh bur eksponering varierer mellem år (tabel 1). Væksten varierer også, hvor højere temperaturer var ledsaget af højere vækstrater (Kruskal-Wallis test p < 0,001). På den anden side, den gennemsnitlige vandtemperatur på de samme lokaliteter under tre måneder sandede bur eksponeringen var meget ens i begge år (tabel 1) og vækstraten ikke afviger betydeligt (figur 4B).
Fordele og mangler af de beskrevne metoder:
En åben vand eksponering er relativt nemme at udføre, men er af begrænset værdi for habitat bioindication. Metoden for åbent vand mesh bure er relativt gamle16 og har været flere gange brugt med mindre ændringer10,11,12,13,21,22 , 23. dog disse bure er ikke begrænset af ilt, hvis mangel er sandsynligvis ansvarlige for mange unge døde under hyporheic forhold. Således åbent vand mesh bure kan viser god udvikling selv i lokaliteter med øget dødelighed og en faldende vækstrate i åbent vand sandede bure (lokalitet E) eller en 100% dødelighed i inden for bed sandede bure, som på lokalitet D i 2014 (figur 4B). Tilsyneladende, åbent vand mesh bure vise lokalitet vækst potentiale, men dette kan ikke være realistisk, da det er afhængige af den virkelige tilgængeligheden af hyporheic microhabitats inden for et lokalområde. Fordi åbent vand mesh bure har mulighed for høj overlevelse (figur 4A), endda op til en 100% overlevelse sats13, kan de tjene godt for bioindication af kronisk toksicitet (eller akut toksicitet hvis det forventes på et givet tidspunkt). Også, de kan være en nyttig mad kilde tilstedeværelse test til en vis grad.
Som en ny og usædvanlig metode simulere åbent vand sandede bure bedre hyporheic habitat betingelser. Flytning af ungfisk mellem sandkornene er muligt i dette apparat, som hjælper med at reducere biofilm vækst på juvenile skallen. En hyporheic iltmangel kan være forårsaget af aktiviteten af mikrober koloniserer sandkornene; denne effekt kan også delvis forekommer i bure placeret over en floden bunden. Ikke desto mindre på grund af den nødvendige periodisk rengøring af tilstopning drivende materiale fra et bur fine sedimenter er også fjernet og dermed betingelserne, der er ændret i forhold til den naturlige hyporheic habitat. Så kan væksten også betragtes som lokalitet vækst potentiale i åbent vand sandede bure. Dette er dog tættere på reel lokalitet egnethed end i åbent vand mesh bure. Derfor, de langsgående vækst sats forløb optaget af sandede bure (figur 4B) også synes at være mere plausibel og angive en mere egnet floden strækning. Desuden, i sandet bure, muligheden for ungfisk og subadults avl op til kønsmodenhed er verificerede9, så sandet bure kan tjene som en sikker metode, avl og bioovervågning samtidigt.
Sandy bure og mesh bure placeret i positionen i sengen er tættest på de virkelige forhold i en lavvandet hyporheal. Ved at lade et ungt bevægelse, sandede bure, navnlig give dem begge en vertikal og horisontal gradient på flere centimeter i skala. Denne evne til at flytte kunne være meget vigtigt for flygter fra midlertidige ilt-mangelfuld mikro-zoner. Denne mulighed er fraværende i inden for sengen mesh bure. Derfor er en relativt høje antal bioindication enheder nødvendigt, fordi hyporheic er meget variable13,24 (figur 5) og tab som følge af et uegnet sted er fælles.
I Resumé svarer de bioindication metoder, der anvendes i denne forskning med formodet juvenile naturforholdene i følgende rækkefølge:
1. åben vand mesh bure,
2. åben vand sandede bure,
3. inden for-bed mesh bure,
4. inden for-bed sandede bure.
Arbejdsbyrde pr. enhed øger i samme rækkefølge. Desuden opnået ungdoms antallet kræves for en statistisk test af resultaterne stigninger i inden for bed engagementer for. Det lader til, at inden for bed sandede bure repræsenterer en dyrere, men præcis bioindication metode. Denne nye metode har brug for flere tests i fremtiden og sammenligning med andre typer af hyporheic undersøgelser baseret på piezometer målinger25,26. Der er især behov for at undersøge graden af lighed ved hjælp af en direkte sonden måler fysisk-kemiske forhold i bure og det omgivende hyporheic miljø.
Antallet af individer målt i et bur:
Sammenlignet med mesh bure, er det ikke muligt at måle vækst tilvækst af specifikke ungfisk i sandet bure, som der er ingen oplysninger, på hvilken individet fra input-sættet er hvoraf den ene i outputtet. Det er nødvendigt at arbejde med en gennemsnitlig værdi. Hvis optalt for alle personer, kan denne værdi være meget lav på grund af et antal meget langsomt voksende eksemplarer; men et par af enkeltpersoner kan vokse meget hurtigt (vækst jumpere). Sådanne ujævne vækst er typiske for muslinger27. Vækst variation blandt unge stiger med stigende eksponeringstid og store forskelle kan forekomme, især i vækst-gunstige sæsoner. Også en lang eksponering fører til større dødelighed i trådnet burene (for en gennemgang Se Lavictoire, Moorkens, Ramsey, Sinclair og Sweeting28), så vi kan arbejde med et betydeligt lavere antal individer i slutningen af forsøget i forhold til den input unge fugles sæt. Måling kun flere bedst voksende unge fugle er en mulig metode.
Oplevelsen af FWPM avl inden for tjekkiske handlingsplan for ferskvands perle Mussel9,29, samt resultater fra eksperimenter på havet muslinger30,31, tyder på, at vækst-mangelfuld ungdomskriminalitet muslinger har en høj dødelighed, og der er kun en ubetydelig chance for deres levende til modenhed. Derimod vækst jumpere har en højere overlevelsesrate og de er afgørende for en befolkning opsving. Parameteren 10 MAX (de 10 mest hurtigt voksende enkeltpersoner) tager højde for vækst jumpere og kan øge den informative værdi af eksperimentet, selvom høj dødelighed finder sted (figur 4B, sæson 2014). Det skal bemærkes, at vækst estimatet opnået ved denne metode ikke kan være en falsk positiv. Det kan kun være lidt undervurderet fordi mange af de største ungfisk i slutningen af forsøget ville have vokset lidt mere i denne sag. Arbejdsbyrden er også mindre hvis det kun er 10 personer er evalueret. Tilsvarende, en måling af tre maksimalt voksende personer (maks. 3) viste sig for at være passende i mesh bure, at fjerne indflydelsen af langsomt voksende, ikke-perspektiv individer, som kunne skævhed det reelle billede af websted vækstpotentiale.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Michal Bílý og Ondřej P. Simon blev støttet af tilskud fra den tjekkiske Universitet af Life Science [interne Grant agenturet af fakultetet for miljøvidenskab, CULS Prag (42110 1312 3175 (20164236))]. Støtte til Karel Douda kom fra Czech Science Foundation (13-05872S). Data om bioindication og nuværende forekomst af perle muslinger blev indsamlet under gennemførelsen af handlingsplanen for tjekkiske for ferskvands perle muslinger forvaltes af Naturstyrelsen bevarelse af Den Tjekkiske Republik, som er finansieret af regeringen i den Tjekkiet og er tilgængelig på
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| biological material maintenance and care | |||
| Freshwater pearl mussel juveniles | any | NA | from a FWPM breeding programme |
| plastic boxes | any | NA | |
| thermobox | MERCI | 212,070,600,030 | There are many possibilities. This is one example only. |
| field thermobox (ca25 l) | any | NA | cold box (insulated box) commonly used for food transport |
| river water | any | NA | |
| Petri dishes | any | NA | |
| plastic Pasteur pipettes with balloon bulb (droppers) | any | NA | hole diameter 1 mm |
| hydrogen peroxide | any | NA | |
| plastic container (ca 50 l) for river water | any | NA | |
| plastic tea strainer | any | NA | commonly used in kitchen |
| mesh cages construction | |||
| main plastic bodies | any | NA | |
| plactic covers | any | NA | |
| special technical sieves 340 µm | Silk &Progress | UHELON 20 T | |
| special technical sieves 100 µm | Silk &Progress | UHELON 67 M | |
| rubber hose (diameter 5.5 mm) | any | NA | |
| steel bolts | any | NA | |
| steel nuts | any | NA | |
| spanner | any | NA | |
| steel spikes | any | NA | |
| pliers | any | NA | |
| beakers | any | NA | |
| plastic dishes (ca. 25x15x3-5cm) | any | NA | |
| squirt bottle | any | NA | |
| field protocols | any | NA | |
| stationery | any | NA | |
| plastic container | any | NA | |
| string | any | NA | |
| hammer | any | NA | |
| sandy cages construction and use | |||
| sieve 1 mm | any | NA | |
| sieve 2 mm | any | NA | |
| special technical sieves 340 µm | Silk &Progress | UHELON 20 T | |
| plastic boxes with tight-fitting lid | any | NA | |
| hot melt adhesive | any | NA | |
| plastic box (ca 250 x 150 x 100 cm) | |||
| big plastic box (ca 25 l) | any | NA | |
| flat stone | any | NA | |
| net | any | NA | |
| river sand | any | NA | |
| round containers | any | NA | |
| magnifying glasses | Carson | Carson CP 60 | There ar many possibilities. This is one example only |
| cages installation and maintenance | |||
| field temperature dataloggers | ONSET | UA-001-64 | http://www.onsetcomp.com/products/data-loggers/ua-001-64 |
| spade | any | NA | |
| toothbrush | any | NA | |
| experiment evaluation | |||
| trinocular dissecting zoom stereo microscope | Bresser optic | ICD 10x-160x | There are many possibilities. This is one example only. |
| digital camera/ electronic eyepiece | Bresser optic | MikroCamLab 5M | There are many possibilities. This is one example only. |
| Calibration gird | Am Scope | SKU: MR100 | There are many possibilities. This is one example only. |
| external power source with two movable light guides | Arsenal | K1309010150021 | There are many possibilities. This is one example only. |
| Image software | ImageJ software | There are many possibilities. This is one example only. | |
| table processor | MS excel | There are many possibilities. This is one example only. |
References
- Goldberg, E. D. The mussel watch-a first step in global marine monitoring. Marine Pollution Bulletin. 6 (7), 111-114 (1975).
- Vaughn, C. C. Ecosystem services provided by freshwater mussels. Hydrobiologia. , In Press (2017).
- Lopes-Lima, M., et al. Conservation status of freshwater mussels in Europe: state of the art and future challenges. Biological Reviews. 92 (1), 572-607 (2017).
- Strayer, D. L., Malcom, H. M. Causes of recruitment failure in freshwater mussel populations in southeastern New York. Ecological Applications. 22 (6), 1780-1790 (2012).
- Douda, K. Effects of nitrate nitrogen pollution on Central European unionid bivalves revealed by distributional data and acute toxicity testing. Aquatic Conservation: Marine and Freshwater Ecosystems. 20 (2), 189-197 (2010).
- Modesto, V., et al. Fish and mussels: importance of fish for freshwater mussel conservation. Fish and Fisheries. , In Press (2017).
- Ecology and evolution of the freshwater mussels Unionoida. Bauer, G., Wächtler, K. 145, Ecological Studies. 1-394 (2001).
- Neves, R. J., Widlak, J. C. Habitat ecology of juvenile fresh-water mussels (Bivalvia, Unionidae) in a headwater stream in Virginia. American Malacological Bulletin. 5, 1-7 (1987).
- Švanyga, J., Simon, O. P., Mináriková, T., Spisar, O., Bílý, M. Záchranný program pro perlorodku říční v ČR (Action plan for the endangered freshwater pearl mussel in the Czech Republic). , NCA CR. Prague, Czech Republic. (2013).
- Schmidt, C., Vandré, R. Ten years of experience in the rearing of young freshwater pearl mussels (Margaritifera margaritifera). Aquatic Conservation: Marine and Freshwater Ecosystems. 20 (7), 735-747 (2010).
- Gum, B., Lange, M., Geist, J. A critical reflection on the success of rearing and culturing juvenile freshwater mussels with a focus on the endangered freshwater pearl mussel (Margaritifera margaritifera L.). Aquatic Conservation: Marine and Freshwater Ecosystems. 21 (7), 743-751 (2011).
- Denic, M., Taeubert, J. E., Lange, M., Thielen, F., Scheder, C., Gumpinger, C., Geist, J. Influence of stock origin and environmental conditions on the survival and growth of juvenile freshwater pearl mussels (Margaritifera margaritifera) in a cross-exposure experiment. Limnologica. 50, 67-74 (2015).
- Černá, M., Simon, O. P., Bílý, M., Douda, K., Dort, B., Galová, M., Volfová, M. Within-river variation in growth and survival of juvenile freshwater pearl mussels assessed by in situ exposure methods. Hydrobiologia. , In Press (2017).
- Denic, M., Taeubert, J. E. Trophic relationships between the larvae of two freshwater mussels and their fish hosts. Invertebrate Biology. 134 (2), 129-135 (2015).
- Douda, K. Host-dependent vitality of juvenile freshwater mussels: implications for breeding programs and host evaluation. Aquaculture. 445, 5-10 (2015).
- Buddensiek, V. The culture of juvenile freshwater pearl mussels Margaritifera margaritifera L. in cages: a contribution to conservation programmes and the knowledge of habitat requirements. Biological Conservation. 74 (1), 33-40 (1995).
- Hruška, J. Experience of semi-natural breeding program of freshwater pearl mussel in the Czech Republic. Die Flussperlmuschel in Europa: Bestandssituation und Schutzmaßnahmen. , Albert-Ludwigs Universität: Freiburg. Kongressband. WWA Hof 69-75 (2001).
- Barnhart, M. C. Buckets of muckets: a compact system for rearing juvenile freshwater mussels. Aquaculture. 254 (1), 227-233 (2006).
- Simon, O. P., Vaníčková, I., Bílý, M., Douda, K., Patzenhauerová, H., Hruška, J., Peltánová, A. The status of freshwater pearl mussel in the Czech Republic: several successfully rejuvenated populations but the absence of natural reproduction. Limnologica. 50, 11-20 (2015).
- R Core Team. A language and environment for statistical computing. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. Available from: https://www.r-project.org/ (2013).
- Hastie, L. C., Yang, M. R. Conservation of the freshwater pearl mussel I: captive breeding techniques. 2, Natural England. Peterborough, UK. Conserving Natura 2000 Rivers Conservation Techniques Series No. 2 (2003).
- Hruška, J. Nahrungsansprüche der Flußperlmuschel und deren halbnatürliche Aufzucht in der Tschechischen Republik. Heldia. 4 (6), 69-79 (1999).
- Scheder, C., Lerchegger, B., Jung, M., Csar, D., Gumpinger, C. Practical experience in the rearing of freshwater pearl mussels (Margaritifera margaritifera): advantages of a work-saving infection approach, survival, and growth of early life stages. Hydrobiologia. 735 (1), 203-212 (2014).
- Braun, A., Auerswald, K., Geist, J. Drivers and spatio-temporal extent of hyporheic patch variation: implications for sampling. PLoS ONE. 7 (7), e42046 (2012).
- Franken, R. J. M., Storey, R. G., Williams, D. D. Biological, chemical and physical characteristics of downwelling and upwelling zones in the hyporheic zone of a north-temperate stream. Hydrobiologia. , 183-195 (2001).
- Roley, S. S., Tank, J. L. Pore water physicochemical constraints on the endangered clubshell mussel (Pleurobema clava). Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 73 (12), 1712-1722 (2016).
- Larson, J. H., Eckert, N. L., Bartsch, M. R. Intrinsic variability in shell and soft tissue growth of the freshwater mussel Lampsilis siliquoidea. PLoS ONE. 9 (11), e112252 (2014).
- Lavictoire, L., Moorkens, E., Ramsey, A. D., Sinclair, W., Sweeting, R. A. Effects of substrate size and cleaning regime on growth and survival of captive-bred juvenile freshwater pearl mussels, Margaritifera (Linnaeus, 1758). Hydrobiologia. 766 (1), 89-102 (2015).
- Hruška, J. Experience of semi-natural breeding programme of freshwater pearl mussel in the Czech Republic. Die Flussperlmuschel in Europa: Bestandssituation und Schutzmassnahmen. , 69-75 (2000).
- Bayne, B. L. Physiological components of growth differences between individual oysters (Crassostrea gigas) and a comparison with Saccostrea commercialis. Physiological and Biochemical Zoology. 72 (6), 705-713 (1999).
- Tamayo, D., Azpeitia, K., Markaide, P., Navarro, E., Ibarrola, I. Food regime modulates physiological processes underlying size differentiation in juvenile intertidal mussels Mytilus galloprovincialis. Marine Biology. 163 (6), (2016).
